Este protocolo describe técnicas que pueden ser utilizadas por los fisiólogos de pequeños animales para dilucidar el papel de los neuropéptidos y otros factores hormonales que regulan el sistema digestivo y/o excretor. Estas técnicas permiten mediciones de muestras biológicas de tamaño micro que de otro modo no serían posibles utilizando técnicas diseñadas específicamente para modelos animales más grandes, incluidos, por ejemplo, roedores y teleus. Este método puede proporcionar información sobre la regulación endocrina del intestino, incluido el transporte epitelial, así como el músculo liso asociado con el tracto gastrointestinal en insectos y en especies no insectígenas de tamaño similar.
Demostrando los procedimientos de trompas renales de insectos estará Farwa Sajadi, un candidato a doctorado de mi laboratorio. Además, un ex estudiante graduado de mi laboratorio Aryan Lajevardi demostrará los protocolos centrados en el intestino trasero. Comience preparando los platos de Ramsay y ensayos de contracción para los experimentos.
Use pipeta y llene los pozos con hasta 20 microlitros de solución. Para controles no estimulados, llene los pozos con 20 microlitros de medio salino de Aedes Schneider. Una vez que todos los pocillos estén llenos, vierta aceite mineral hidratado en el plato de ensayo hasta que los pocillos y los alfileres minutien estén sumergidos.
Después de sumergir el túbulo en el pozo, recoja el extremo proximal del túbulo con fórceps, retírelo de la gota de baño y envuelva el extremo alrededor del pasador. Envuelva el túbulo alrededor del pasador dos veces manteniendo la longitud del túbulo que queda en la gota de baño consistente con los otros túbulos. Para hacer un microelectrodo selectivo de sodio, use una jeringa de un mililitro para rellenar el electrodo con cloruro de sodio 100 milimolar.
Asegúrese de que la solución de relleno se llene hasta la punta del electrodo. Si aparecen burbujas de aire, mueva suavemente el microelectrodo o retire la solución y vuelva a llenarla. Sumerja una punta de pipeta de 10 microlitros en la solución de ionóforo selectivo de sodio.
Alinee el electrodo perpendicular a la pipeta, luego coloque un dedo enguantado sobre la parte inferior de la punta para crear presión y expulsar una pequeña gota de ionóforo. Toque con cuidado la gota de ionóforo en la punta del microelectrodo, asegurándose de no romperlo. Llene un vaso de precipitados pequeño hasta la mitad con cloruro de sodio 100 milimolar y coloque un poco de arcilla de modelado en el interior en la parte superior del vaso de precipitados.
Después de que el ionóforo haya sido absorbido, coloque la punta del electrodo hacia abajo en la pared del vaso de precipitados, dejando las puntas dentro del cloruro de sodio. Mantenga isme en el vaso de precipitados hasta que esté listo para usar. Para hacer el electrodo de referencia ISME, rellene un electrodo con cloruro de potasio 500 milimolar y guárdelo en un vaso de precipitados.
Cubra las puntas de los electrodos con una solución de aproximadamente 3,5% de cloruro de polivinilo, disuelta en tetrahidrofurano, para evitar el desplazamiento del ionóforo cuando se sumerge en aceite de parafina. Para calibrar el electrodo de sodio, coloque 10 gotas de microlitros de concentraciones estándar de cloruro de sodio en el borde del plato Ramsey con los túbulos malpighianos incubados. Coloque las gotas estándar a dos centímetros de distancia con la mayor concentración en la parte superior.
Inserte tanto el electrodo de referencia como el electrodo selectivo de iones sobre los cables de cloruro de plata y sujéntelos de forma segura utilizando soportes de electrodos que estén conectados a micromanipuladores. Navegue por ambos electrodos hacia la gota de cloruro de sodio de 200 milimolares utilizando los micromanipuladores, asegurándose de que las puntas eléctricas no toquen el fondo del plato. Encienda el electrómetro para comenzar a grabar y permita que la lectura se estabilice.
Registre la lectura y continúe con el siguiente estándar. Después de adquirir mediciones de la tasa de secreción de fluido, mueva cuidadosamente los electrodos selectivos de referencia e iones en la gota secretada utilizando los micromanipuladores. Encienda la grabación y permita que la lectura se estabilice, luego grabe.
Encienda el amplificador de iones/polarográfico IPA-2, el microscopio de luz y los ordenadores. Coloque el microelectrodo selectivo de sodio en un soporte que consiste en un cable de cloruro de plata y conéctelo al conector hembra. Retire un electrodo de referencia del vaso de precipitados con el cloruro de potasio, colocando un dedo en un extremo e inclinando el capilar de vidrio hacia este dedo para evitar que el agar se caiga.
Coloque con cuidado un extremo en el soporte, asegurándose de que no se formen burbujas. Si hay una burbuja, retire el electrodo de referencia, vuelva a llenar el soporte con cloruro de potasio de tres molares y repita. Coloque el soporte del electrodo en el conector hembra.
Después de la calibración, diseccione el órgano. Coloque la placa de poli-L-lisina con la muestra diseccionada en la etapa del microscopio e inserte la punta del electrodo de referencia dentro de la solución salina. Sumergir la punta del microelectrodo selectivo de iones en la solución salina, teniendo cuidado de no romper la punta.
Utilice las perillas de ajuste manual para ajustar la posición del microelectrodo mientras mira bajo el microscopio óptico. Ajuste la posición vertical del microelectrodo de modo que su punta esté en el mismo plano que el órgano o tejido, luego gire el interruptor del motor para habilitarlo. Usando las teclas de flecha de la computadora, mueva el microelectrodo horizontalmente a una posición a tres milímetros de distancia del tejido para medir las grabaciones de fondo.
Cuando esté listo, comience a grabar presionando F5, obtenga cinco mediciones de la actividad de fondo. Mueva la punta del microelectrodo cerca del tejido teniendo cuidado de no perforar el órgano. Reduzca la sensibilidad a golpes de la tecla para colocar la punta del microelectrodo dos micrómetros directamente a la derecha, perpendicular al tejido.
Obtenga tres registros en el sitio a lo largo de la almohadilla rectal para identificar el sitio de mayor actividad iónica, luego obtenga mediciones salinas de referencia en el sitio que muestra la mayor actividad. Para registrar las contracciones del intestino posterior, llene uno de los pocillos en el plato con un volumen conocido de solución salina de Aedes. Después de la disección, transfiera cuidadosamente el intestino posterior diseccionado unido al intestino medio a un pozo en otro plato, asegurándose de no pellizcar el íleon.
Sumerja el intestino en la solución salina dentro del pozo y coloque los alfileres Minutien en el intestino medio y el recto. El íleon no debe estar bajo tensión y deben observarse contracciones espontáneas originadas en la válvula pilórica en el íleon anterior. Conecte la cámara de vídeo al microscopio estereoscópico.
Luego coloque el plato que contiene el órgano diseccionado bajo el microscopio y grabe un video durante dos minutos. La aplicación de DH31 contra túbulos malpighianos no estimulados da como resultado un aumento significativo en la tasa de secreción de líquidos, lo que confirma su papel como hormona diurética en los mosquitos Aedes. Cuando los túbulos se tratan con AedaeCAPA-1, se observa una reducción en la tasa de secreción en los túbulos de Malpighian estimulados por DH31.
Se utilizaron electrodos selectivos de iones para medir las concentraciones de sodio en las gotas secretadas. El tratamiento de DH31 en las MT no tuvo ningún efecto sobre la concentración de sodio en la gota secretada. Sin embargo, con la aplicación de AedaeCAPA-1, la concentración de sodio en el líquido secretado aumentó significativamente.
Además, en comparación con los controles no estimulados, DH31 condujo a una tasa de transporte de sodio significativamente mayor, mientras que AedaeCAPA-1 abolió este aumento en los túbulos estimulados por DH31. El SIET se utilizó para evaluar los cambios en el transporte de sodio a lo largo del epitelial de la almohadilla rectal de los mosquitos hembra adultos. Se utilizó un análogo de leucoquinina para examinar los cambios en la absorción de sodio, lo que resultó en una disminución de cuatro veces en la absorción de sodio en comparación con el control salino.
Para evaluar el papel de un neuropéptido piroquinina2 en la motilidad ileal, se utilizó un análogo de Rhodnius prolixus, que previamente se demostró que activaba el receptor A.aegypti PK2 enriquecido en el íleon del mosquito. En relación con los niveles basales, PK2 inhibe significativamente las contracciones ileales. Al realizar un ensayo de Ramsay con túbulos de Malpighian y medir las tasas de secreción de iones o líquidos, es imperativo que los túbulos no se dañen durante la disección o durante la transferencia al plato de ensayo.
Después del ensayo de Ramsay, los transportadores de membrana específicos pueden ser dirigidos farmacológica o molecularmente utilizando técnicas genéticas inversas para discernir su contribución específica al transporte transepitelial de solutos en el epitelio simple.
