Queremos dar las gracias al personal administrativo del CIBIO (Universidad de Trento) y CNR Instituto de Neurociencias para obtener ayuda. Giovanni Provenzano es apoyado por una beca postdoctoral de la Fundación Veronesi (Milán, Italia). Este trabajo fue financiado por el Ministerio Italiano de Universidad e Investigación (PRIN 2008 subvención # 200894SYW2_002 y PRIN 2010-2011 subvención # 2010N8PBAA_002 a YB), Universidad de Trento (CIBIO subvención inicial a YB) y la Fundación Teletón (subvención # GGP13034 a YB).

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE y fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia. 1. Cuidado de Animales, Vivienda y Tratamiento <ol><li> Realizar todos los protocolos experimentales con ratones de acuerdo con las directrices de la respectiva cuidado de los animales institucional. </li><li> Mantener los animales en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con los alimentos y el agua ad libitum. </li><li> Casa de los ratones en grupos de 2-4, en jaulas de policarbonato ratón de tamaño estándar con aserrín y material de cama con cambio semanal. </li><li> Use la edad y el sexo, con ajuste ratones, porque la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el género en diferentes modelos de ratón de los trastornos del neurodesarrollo. </li><li> Elija un número adecuado de animales para alcanzar significación estadística (un mínimo de 10 ratones por genotipo para el estudio del comportamiento y 4 ratones por genotipo para el experimento inmunohistoquímica). </li></ol> 2. laberinto acuático de Morris (MWM) <ol><li> Use un tanque circular (diámetro 100 cm, altura 50 cm). <ol><li> Coloca algunas señales visuales en los separadores de ambiente de todo el tanque. </li><li> Coloque una plataforma de 10 cm de diámetro en el tanque en una ubicación fija en el centro de uno de los cuatro cuadrantes imaginarios. Mantenga la plataforma escondida en el mismo cuadrante para todos los ensayos en todas las sesiones de entrenamiento. </li><li> Llenar la piscina con agua del grifo hasta que la plataforma se encuentra a 1 cm por encima de la superficie del agua. Equilibrar la temperatura del agua debe estar cerca de 22 ° C; este paso puede tardar varias horas. Añadir agua caliente para acortar el tiempo necesario para equilibrar la temperatura del agua. </li><li> Añadir aproximadamente 1,5-2 L de blanco, la pintura no tóxica para hacer el agua opaca. </li></ol></li><li> Procedimiento Track Adquisición <ol><li> Configurar el sistema de seguimiento de MWM con cámaras CCD estándar y tarjetas de vídeo. Elegir un sistema de vídeo-seguimiento para monitorear y analizar diversas variables tales como longitud del camino, escalatencia pe, y el tiempo dedicado en cada cuadrante. </li><li> Divida la arena en cuatro cuadrantes y ajustar la configuración de detección para garantizar un contraste óptimo entre los animales y el fondo para el seguimiento en directo. </li><li> Especifique la región de la plataforma. </li><li> Ajuste el tiempo de prueba máxima, 60 seg. </li></ol></li><li> Prueba MWM <ol><li> Antes de la prueba de comportamiento, permitirá a los ratones un período de adaptación de 20 a 25 min en una zona donde no pueden ver la piscina o claves espaciales. </li><li> Capacitar a cada ratón durante 9 días (dos ensayos consecutivos al día, con intervalo de 20 a 30 minutos entre ellos). </li><li> Encienda el ordenador y la cámara e iniciar el software del sistema de vídeo-seguimiento. </li><li> Tome el ratón por la cola y colocarlo en el agua, con su cabeza apuntando hacia el lado de la piscina, a partir de una de las cuatro posiciones de inicio (norte, sur, este, oeste). Para cada ratón, la posición de inicio debe ser diferente y pseudorandomized entre los ensayos. </li><li> Deje la natación del ratón y la búsqueda de la platform por un máximo de 60 segundos. Una vez que el animal llega a la plataforma, permitirá que se quede en la plataforma durante 20 segundos. </li><li> Si el ratón no pudo localizar la plataforma dentro de ese tiempo, guiar suavemente el ratón a la plataforma, sujetándolo por la cola y dejar que se quede allí por 20 seg. Una vez que el animal ha completado todos los dos ensayos, secarlo con una toalla y lo puso de nuevo en la jaula. </li><li> Cada día del período de entrenamiento, repita el mismo procedimiento (pasos 2.3.4-2.3.6). </li><li> Realice la prueba de la sonda en el día 9 después de la última pista de entrenamiento. </li><li> Retire la plataforma de la piscina. </li><li> Deje la natación del ratón y la búsqueda de la plataforma para un máximo de 60 segundos. </li><li> Periódicamente, verifique la temperatura del agua por lo que debe ser la misma (22 ° C) y limpiar la piscina. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de Secciones de perfundidos Animales <ol><li> Sacrificar a los ratones al final de MWM. Cuatro ratones por genotipo deben ser anestesiados antes de euthanización de acuerdo a las normativas locales e internacionales. </li><li> Perfundir el animal transcardially (cortar la derecha auriclewith una tijera para permitir el sangrado e introducir una cánula de mariposa en el ventrículo izquierdo para perfundir) con tampón fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-15 min 22. </li><li> Diseccionar y post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante al menos 12 h. </li><li> Coloca los cerebros de 50 ml tubos cónicos de poliestireno que contienen 15 ml de 0,02% azida sódica en PBS 0,1 M y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario para cortar. </li><li> Corte y retire el cerebelo antes vibratome corte. </li><li> Pegue el cerebro en posición vertical con el sitio de corte, utilizando pegamento, sobre la placa de soporte de la vibratome. </li><li> Cortar el cerebro en 20-40 micras secciones coronales de espesor, con el fin de serie en todo el hipocampo dorsal, en vibratome apropiado. </li><li> Recoger vibratome rebanadas con un pincel y transferir a un 24 placa de múltiples pocillos que contenía 1 ml de 0,1 M PBS para cada pocillo. </li><li> Secciones para almacenaje de corto plazo en PBS o largo plazo en 0,02% azida sódica en PBS a 4 ºC (tejido pueden ser utilizados para un máximo de un año). </li></ol> 4. La inmunohistoquímica <ol><li> Transferencia 3-5 secciones del hipocampo dorsal de cada ratón, en 24 placa de múltiples pocillos que contenía 500 l de 0,1 M PBS para cada pocillo. </li><li> Lávese las secciones contenidas en cada pocillo con 500 l de 0,1 M PBS (5 min, 3 veces con agitación suave). </li><li> Apagar la actividad de la peroxidasa endógena, incubando secciones en 1% H 2 O 2 en PBS durante 20 min con agitación suave. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Permeabilización de tejido: incubar las secciones durante 5 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS. </li><li> Durante los pasos anteriores (4,4; 4,5), haga tampón de bloqueo suficiente (10% de suero de cabra y el 0,1% de Triton-X100 en PBS) durante todo el experimento (number de las secciones x 100 l x 3 pasos). </li><li> Nota: El uso de suero de la misma especie en la que el Ab secundario (conjugado con biotina) se hizo. </li><li> Evitar la unión no específica del anticuerpo, mediante la incubación de las secciones en tampón de bloqueo (100 l / sección) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación suave. </li><li> Incubar las secciones de Ab primario (pERK) diluido en tampón de bloqueo, durante la noche a 4 ° C, con agitación suave. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Incubar con el Ab secundario conjugado con biotina (1: 250) diluido en tampón de bloqueo (el mismo que se utiliza en el paso 4.6) durante 1 hora a RT con agitación suave. </li><li> Preparar reactivo ABC, al mismo tiempo, debido a la avidina y biotina requieren por lo menos 30 min a temperatura ambiente a lo complejo. </li><li> Preparar el volumen necesario de ABC reactivo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> IncubatSecciones E para 45 min a TA con ABC de reactivo. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Preparar solución de trabajo de DAB, cada etapa que implica DAB debe hacerse en la campana de humos como DAB es carcinógeno y teratógeno. </li><li> Transferir la solución de DAB a una nueva placa con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Coloque las secciones en la placa que contiene DAB solución y placa lentamente remolino de trabajo a mano, para permitir la máxima exposición a las secciones. </li><li> Monitorear reacción DAB en el microscopio hasta que se desarrolla la señal adecuada (2-5 min). </li><li> Detener la reacción con la intensidad de color deseada mediante el lavado del tejido en 0,1 M PBS (3 x 5 min). </li><li> Utilice lejía para desactivar cualquier solución de sustrato DAB restante en la campana de humos durante la noche y disponer de él de acuerdo con las directivas de laboratorio. </li><li> Mount secciones sobre gelatina recubiertas diapositivas flotando en PBS. Luego secar a temperatura ambiente al menos 3-4 horas. </li><li> Deshidratar la secuencialmente secciones en 50%, 70%, 95%y etanol al 100% durante 2 min cada uno, y claro en 100% de xileno durante 5 min. </li><li> Cubreobjetos utilizando medio de montaje y dejar en la campana de humos que se seque durante la noche. </li></ol> Conde 5. celular <ol><li> Recuento de células Perk-positivos, de tres a cinco secciones a nivel del hipocampo dorsal deben ser analizados por animal. </li><li> Adquirir varias imágenes de campo brillante de cada sección con una ampliación de 200X utilizando un microscopio adecuado, y luego ensamblarlos usando un software de procesamiento de imágenes. </li><li> Realizar el recuento de células en las imágenes de mosaico tiff convertida utilizando el software libre ImageJ. </li><li> Recuento de células Perk-manchado en la capa de células hilio y gránulos durante dos o tres cajas de conteo de 100 × 100 m cada uno. </li><li> Las densidades celulares se expresaron como el número de células marcadas por ventana de recuento (100 × 100 micras). </li><li> Realizar análisis estadístico para evaluar diferencias significativas entre genotipos. Esto se puede lograr con la t de Studentprueba o ANOVA seguido por el test post hoc apropiado utilizando softwares comerciales. Ajuste el nivel de significación estadística de p &lt;0,05. </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Aquí, ofrecemos un protocolo de inmunohistoquímica Perk por revelar la activación neuronal después de MWM en En2 - / - ratones, un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico. Se detectaron niveles disminuidos de Perk en el subcampo CA3 del En2 - / - mutantes en comparación con WT. A diferencia de lo observado en el subcampo CA3, un aumento general de las neuronas Perk-positivo fue lugar detectarse tanto en hilio y GCL de En2 - / - ratones en comparación con WT. ...

Trastornos del desarrollo neurológico incluyen un grupo amplio y heterogéneo de trastornos como el síndrome de Down, síndrome de cromosoma X frágil (FXS), el síndrome de Rett, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa y ASD, en la que el desarrollo y maduración del sistema nervioso central (SNC) se altera temprana durante el período prenatal 1. Estas disfunciones del desarrollo cerebral pueden causar profundos efectos, toda la vida en la función motora, lenguaje, aprendizaje y proceso de la memoria. Una plétora de factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo durante los últimos años 2,3. Incluso si los mecanismos moleculares que subyacen al fenotipo clínico siguen siendo desconocidos, los hallazgos mencionados anteriormente han permitido el desarrollo de varios modelos de ratón de estos trastornos. Déficits de aprendizaje y memoria se han identificado en un número de estos modelos de ratón, tales como Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,Nf1 +/- y En2 - / - ratones 2,4-7. Un reto importante en el campo de los trastornos del desarrollo neurológico es la identificación de los procesos celulares y moleculares que subyacen a la memoria y el aprendizaje de la disfunción. Vías de señalización activadas seleccionados durante el aprendizaje o la memoria pueden inducir la transcripción de genes específicos y en última instancia conducir a la síntesis de novo de proteínas. Genes tempranos inmediatos de activación y de proteínas dependientes (IEGs) modificaciones sinápticas son inducidos rápidamente en las neuronas del cerebro en respuesta a la actividad neuronal y la formación del comportamiento 8,9. Las deficiencias en las vías de señalización que implican neurofibromina se han asociado con problemas de aprendizaje en los trastornos del desarrollo neurológico. Neurofibromin es el producto del gen NF1, cuya mutación causa neurofibromatosis tipo 1, un síndrome genético complejo caracteriza por tumores del sistema nervioso, de los retardos y de comportamiento de motor y cognitivo DISAbilidades 10. Ratones heterocigotos para eliminación Cf1 restringidas a las neuronas inhibitorias muestran déficits en la fase temprana de la potenciación a largo plazo (LTP), así como el aprendizaje espacial comprometido en MWM 5,11,12. Curiosamente, la deficiencia de NF1 este modelo de ratón conduce a una activación de Ras sobre-señalización en interneuronas inhibidoras durante el aprendizaje, lo que resulta en un aumento de la fosforilación de ERK y finalmente en una mejora anormal de la liberación de GABA a partir de estas neuronas 5. Basándose en estos hallazgos, la visualización de la actividad neuronal después de tareas de comportamiento representa una manera de reconstruir circuitos específicos implicados en enfermedades del desarrollo neurológico. El protocolo de inmunohistoquímica descrito aquí tiene como objetivo evaluar y cuantificar los niveles de fosforilación de ERK hipocampo siguientes MWM en un modelo de ratón ASD con déficits cognitivos. MWM es ampliamente utilizado para investigar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y la memoria en roedores 13,14 </sarriba&gt;. Decidimos utilizar la fosforilación de ERK como lectura molecular del aprendizaje hipocampo tarea dependiente, ya que ERK ha demostrado tener un papel esencial en el aprendizaje y la memoria formación 15. Por otra parte, la vía ERK es necesario para dependiente de la experiencia plasticidad en la corteza visual en desarrollo 16. Finalmente, los ratones que carecen de una de las dos isoformas de ERK (ERK2) en el espectáculo CNS marcados anomalías en los comportamientos cognitivos, emocionales y sociales 17, lo que indica que la señalización de ERK podría desempeñar un papel crítico en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, tales como ASD. Utilizamos Engrailed 2 nocaut (En2 - / -) ratones como modelo de trastornos del neurodesarrollo. En2 - / - ratones muestran características anatómicas y de comportamiento &quot;ASD-like&quot;, incluyendo la pérdida de interneuronas del cerebro anterior 18, la reducción de la expresión de genes relacionados con el ASD 19, disminución de la sociabilidad, y deterioro de la flexibilidad cognitiva 6,7,20. Learni espacialng y defectos de memoria, como los detectados en MWM, son especialmente robusto en En2 - / - ratones 6,7 y podrían ser relevantes para los deterioros cognitivos observados en pacientes ASD 21. Por otra parte, hemos demostrado que el aprendizaje espacial deteriorada en MWM se asocia con la reducción de expresión neurofibromina y aumentó los niveles pERK en el hilio del En2 - / - ratones adultos 7. Aquí presentamos el protocolo detallado para la caracterización inmunohistoquímica de Perk siguiente MWM en este modelo de ratón TEA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

La inducción de la quinasa extracelular regulada fosforilada (pERK) es una lectura fiable molecular de la activación neuronal de aprendizaje-dependiente. Aquí se describe un protocolo de inmunohistoquímica Perk para estudiar el perfil de la activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. En concreto, se utilizó inmunotinción Perk para estudiar la activación neuronal tras laberinto acuático de Morris (MWM, una tarea de aprendizaje hipocampo-dependiente clásica) en Engrailed-2 knockout (En2 - / -) ratones, un modelo de trastornos del espectro autista (TEA). En comparación con el de tipo salvaje (WT) controles, En2 - / - ratones mostraron déficits de aprendizaje espacial significativas en el MWM. Después de MWM, se detectaron diferencias significativas en el número de neuronas Perk-positivas en los subcampos del hipocampo específicas de En2 - / - ratones, en comparación con los animales WT. Por lo tanto, nuestro protocolo puede detectar diferencias en robustamenteneuronas Perk-positivos asociados con el deterioro de aprendizaje hipocampo-dependiente en un modelo de ratón de los TEA. Más en general, nuestro protocolo se puede aplicar a investigar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo en ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

El protocolo descrito aquí fue diseñado para visualizar, por inmunohistoquímica, la expresión de un marcador específico de la actividad de las neuronas del hipocampo después de MWM en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. Todos los datos experimentales que se muestran en este documento se tomaron de nuestro reciente trabajo 7. Se utilizaron obtenidos de apareamientos heterocigotos; camada de la misma edad de adultos (peso = 25-35 g 3-5 meses de edad) - Hombres y mujeres WT y ...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K vistas.  University of Trento.  Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

Utilizando MazeSuite y funcional espectroscopia cercana al infrarrojo para estudiar el aprendizaje de la navegación espacial

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinyección insulina hipocampo y<em&gt; En vivo</em&gt; Microdiálisis durante la prueba de memoria espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos<em&gt; In-Vitro</em&gt; isquemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

La evaluación del aprendizaje espacial y la memoria en pequeños reptiles escamosos

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

El uso de condicionamiento de clásico de Eyeblink rastro para evaluar disfunción hipocampal en un modelo de rata de trastornos del espectro alcohólico Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.