אנו מבקשים להודות לצוות הניהולי של CIBIO (אוניברסיטת טרנטו) וCNR Neuroscience מכון לסיוע. ג&#39;ובאני פרובנצאנו נתמך על ידי פוסט דוקטורט מFondazione Veronesi (מילאנו, איטליה). עבודה זו מומנה על ידי המשרד האיטלקי של אוניברסיטות ומחקר (PRIN 2008 מענק # 200894SYW2_002 וprin 2,010-2,011 מענק # 2010N8PBAA_002 לYB), אוניברסיטת טרנטו (מענק CIBIO הזנק לYB) וקרן Telethon (GGP13034 # מענק ל YB).

כל הניסויים נערכו בהתאם להוראה האירופית קהילת 2010/63 / האיחוד האירופי ואושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי. 1. טיפול בבעלי חיים, שיכון וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל פרוטוקולי הניסוי באמצעות עכברים בהתאם להנחיות של הטיפול בבעלי החיים המוסדי בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על בעלי חיים בשעתי אור 12 / מחזור כהה עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית העכברים בקבוצות של 2-4, בכלובי עכבר פוליקרבונט בגודל סטנדרטי עם נסורת וחומר מצעים מוחלפים מדי שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גיל ועכברים בהתאמה מין, בגלל רגישות למחלה יכולה להשתנות עם גיל ומין במודלים של עכברים שונים של הפרעות התפתחותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מספר מתאים של בעלי חיים הגיע למשמעות סטטיסטית (מינימום של 10 עכברים לכל גנוטיפ לחקר ההתנהגות ו4 עכברים לכל גנוטיפ לניסוי אימונוהיסטוכימיה). </li></ol> 2. מבוך מוריס מים (MWM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טנק חוזר (100 סנטימטרים קוטר, גובה 50 סנטימטרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה רמזים חזותיים בחדר מחוגה סביב הטנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פלטפורמת קוטר 10 סנטימטרים לתוך הטנק במיקום קבוע במרכזו של אחד מארבעה רביעים דמיוניים. שמור את הפלטפורמה מוסתרת באותו רביע לכל ניסויים בכל האימונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבריכה במים ברז עד לפלטפורמה היא 1 סנטימטר מעל פני מים. טמפרטורת מים לאזן צריכה להיות קרובה ל 22 מעלות צלזיוס; צעד זה עשוי להימשך מספר שעות. מוסיף מים חמים כדי לקצר את הזמן הנדרש כדי לאזן את טמפרטורת מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 1.5-2 ליטר של צבע לבן, שאינו רעיל כדי להפוך את המים אטומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול רכישת נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת המעקב של MWM עם מצלמות CCD סטנדרטיים ולוחות וידאו. בחר מערכת וידאו-מעקב למעקב וניתוח מספר משתנה כגון אורך דרך, escaחביון PE, ואת המשך זמן בכל רבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הזירה בארבעה רביעים ולהתאים את הגדרות זיהוי כדי להבטיח ניגוד אופטימלי בין בעלי חיים ורקע למעקב בשידור חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את אזור הפלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן משפט המרבי 60 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MWM בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בדיקת התנהגות, תאפשר עכברי תקופת הסתגלות של 20-25 דקות באזור שבו הם לא יכולים לראות את הבריכה או רמזים מרחביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמן את כל עכבר ל9 ימים (שני משפטים רצופים ביום, עם 20-30 דקות מרווח ביניהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ואת המצלמה ולהפעיל את תוכנת מערכת מעקב וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר בזנבו ולמקם אותו לתוך מים, עם הראש שלה הצביע לעבר הצד של בריכה, החל מאחד מארבעת מיקומי ההתחלה (צפון, דרום, מזרח, מערב). לכל עכבר, את מיקום ההתחלה צריך להיות שונה וpseudorandomized פני ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשחות העכבר ולחפש platfORM למקסימום של 60 שניות. ברגע שבעלי החיים מגיעים לפלטפורמה, לאפשר לו להישאר על הפלטפורמה במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכבר לא הצליח לאתר את הפלטפורמה בפרק זמן זה, בעדינות להנחות את העכבר לפלטפורמה, מחזיק אותו בזנבו ולתת לו להישאר שם במשך 20 שניות. ברגע שבעלי החיים השלים כל שני ניסויים, לייבש אותו במגבת והחזרת אותו לכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יום בתקופת ההכשרה, לחזור על אותה הפרוצדורה (צעדי 2.3.4-2.3.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את בדיקת הבדיקה ביום 9 אחרי השביל האימונים האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפלטפורמה מהברכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשחות העכבר ולחפש את הפלטפורמה למקסימום של 60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, לבדוק את טמפרטורת המים, כך שהוא צריך להיות זהה (22 מעלות צלזיוס) ולנקות את הבריכה. </li></ol></li></ol> 3. הכנת סעיפים מבעלי חיים perfused <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים בסוף MWM. ארבעה עכברים לכל גנוטיפ חייבים להיות מורדמים לפני euthanizני על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse בעלי החיים transcardially (לחתוך את זכות auriclewith מספריים כדי לאפשר דימום ולהציג את צינורית פרפר לתוך החדר השמאלי לינקבו) עם מי מלח פוספט (PBS) במשך 4-5 דקות, ואחריו paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 10-15 22 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ופוסט-לתקן את המוח paraformaldehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח בצינורות 50 מיליליטר חרוטי קלקר המכילים 15 מיליליטר של 0.02% נתרן יזיד 0.1 M PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד דרוש לחיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולהסיר את המוח הקטן לפני vibratome חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביקים את המוח זקוף עם אתר החיתוך, באמצעות דבק מגע, על צלחת בעל vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את המוח ל20-40 מיקרומטר סעיפי עטרה עבה, כדי סידורי ברחבי ההיפוקמפוס הגב, על vibratome המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף vibratome פרוסות עם מברשת צבע ולהעביר ל24 צלחת רב גם מכילה 1 מיליליטר של 0.1 מ &#39;PBS לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי חנות לטווח קצר בPBS או ארוך טווח ב0.02% נתרן יזיד PBS ב 4 מעלות צלזיוס (רקמה עשויות לשמש לעד שנה). </li></ol> 4. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 3-5 חלקים הגבי בהיפוקמפוס לכל עכבר, ל -24 צלחת רב גם מכילה 500 μl של 0.1 מ &#39;PBS לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים כלולים בכל טוב עם 500 μl של 0.1 מ &#39;PBS (5 דקות, 3 פעמים עם רעד עדין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות פעילות peroxidase אנדוגני, על ידי דוגרים סעיפים ב 1% H 2 O 2 ב PBS במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization של רקמה: דגירה סעיפים 5 דקות ב0.2% Triton X-100 ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלבים לעיל (4.4; 4.5), לעשות מספיק חיץ חסימה (10% עיזים סרום ושל 0.1% Triton-X100 בPBS) לניסוי כולו (number סעיפים x 100 x μl 3 שלבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: השתמש בסרום מאותו המין שבי Ab המשני (מצומדת לביוטין) נעשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע שאינו ספציפי מחייב של הנוגדנים, על ידי דוגרים סעיפי חסימת חיץ (100 μl / סעיף) לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT) עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה בAb העיקרי (הטבה) בדילול בחסימת מאגר, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין (1: 250) בדילול בחסימת מאגר (זהה לשימוש בשלב 4.6) במשך שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב ABC באותו הזמן, כי avidin וביוטין דורשים לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר למתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנפח הנדרש של מגיב ABC על פי הפרוטוקול של יצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubatסעיפי דואר במשך 45 דקות ב RT עם ABC מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב 0.1 M PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DAB עובד פתרון, כל צעד הכרוך בDAB חייב להיעשות במנדף כמו DAB הוא מסרטנת וטרטוגניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פתרון DAB לצלחת חדשה על ידי פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי מקום בצלחת המכילה DAB עובד פתרון וצלחת מערבולת לאט ביד, על מנת לאפשר חשיפה המרבית לחלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תגובת DAB במיקרוסקופ עד אות מספקת מתפתחת (2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפה ברקמת 0.1 M PBS (3 x 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש באקונומיקה כדי לבטל כל פתרון מצע DAB שנותר במנדף לילה ולהיפטר ממנו על פי הנחיות מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי הר על ג&#39;לטין מצופים שקופיות על ידי צף בPBS. לאחר מכן לייבש אותם בטמפרטורת חדר שעות לפחות 3-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את רצף הקטעים ב -50%, 70%, 95%ואתנול 100% עבור 2 דקות כל אחד, וברור בקסילן 100% במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip באמצעות הרכבה בינונית ולהשאיר במנדף לייבוש למשך הלילה. </li></ol> רוזן 5. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי הטבה חיובית, 04:57 חלקים ברמה של ההיפוקמפוס הגב צריכים להיות מנותחים לכל בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות בהירה שדה מרובים מכל חלק בהגדלה 200X באמצעות מיקרוסקופ מתאים, ולאחר מכן להרכיב אותם באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים בתמונות פסיפס-יומר TIFF באמצעות התוכנה חופשית ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים צבעוניים הטבה בשכבת תאי hilus וגרגיר מעל 02:58 תיבות ספירה של 100 × 100 מיקרומטר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות התא תבוא לידי ביטוי כמספר התאים שכותרתו לחלון ספירה (100 × 100 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוחים סטטיסטיים כדי להעריך הבדל משמעותי בין גנוטיפים. זה יכול להיות מושלם עם לא של הסטודנטיםבדיקה או ניתוח השונה ואחריו מבחן הפוסט הוק המתאים באמצעות תוכנות מסחריות. רמה שנקבעה סטטיסטית משמעות בp &lt;0.05. </li></ol>

<ol>
	<li>Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neurodevelopmental+disorders+in+adulthood.">Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).</li><li>Ehninger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+learning+deficits+in+a+Tsc2+/-+mouse+model+of+tuberous+sclerosis.">Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis.</a> Nature medicine. 14, 843-848 (2008).</li><li>West, A. E., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-regulated+gene+transcription+in+synapse+development+and+cognitive+function.">Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).</li><li>Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+deficits+in+Tsc1+/-+mice+in+the+absence+of+cerebral+lesions+and+seizures.">Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures.</a> Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+regulation+of+ERK+signaling+modulates+GABA+release+and+learning.">Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning.</a> Cell. 135, 549-560 (2008).</li><li>Brielmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-relevant+social+abnormalities+and+cognitive+deficits+in+engrailed-2+knockout+mice.">Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice.</a> PloS one. 7, e40914 (2012).</li><li>Provenzano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+dysregulation+of+neurofibromin-dependent+pathways+is+associated+with+impaired+spatial+learning+in+engrailed+2+knock-out+mice.">Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).</li><li>Morgan, J. I., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-transcription+coupling+in+neurons:+role+of+cellular+immediate-early+genes.">Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes.</a> Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1:+modeling+CNS+dysfunction.">Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).</li><li>Costa, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+the+learning+deficits+in+a+mouse+model+of+neurofibromatosis+type+1.">Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1.</a> Nature. 415, 526-530 (2002).</li><li>Silva, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+increases+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+dentate+gyrus.">Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.</a> Nature. 2, 266-270 (1999).</li><li>Adams, J. P., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+psychology:+roles+for+the+ERK+MAP+kinase+cascade+in+memory.">Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).</li><li>Di Cristo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+ERK+activation+for+visual+cortical+plasticity.">Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity.</a> Science. 292, 2337-2340 (2001).</li><li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK2+contributes+to+the+control+of+social+behaviors+in+mice.">ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+GABAergic+neurons+in+the+hippocampus+and+cerebral+cortex+of+Engrailed-2+null+mutant+mice:+implications+for+autism+spectrum+disorders.">Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders.</a> Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+in+engrailed-2+mutant+mice+reveals+common+molecular+pathways+associated+with+autism+spectrum+disorders.">Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders.</a> Molecular autism. 4, 51 (2013).</li><li>Cheh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder.">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li><li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+broader+phenotype+of+autism:+genetic,+brain,+and+behavioral+perspectives.">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li><li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה לחשיפת הפעלה עצבית הבאה MWM בEn2 - / - עכברים, מודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. רמות ירידה של ההטבה אותרו בתת-תחום CA3 של En2 - / - מוטציות לעומת WT. באופן שונה ממה שנצפה בתת-תחום CA3, עלייה כללית של נוירונים הטבה חיוביים זו?...

הפרעות התפתחותיות כוללות קבוצה רחבה והטרוגני של הפרעות כגון תסמונת דאון, תסמונת X השביר (FXS), תסמונת רט, נוירופיברומטוזיס, טרשת גבשושית וASD, שבפיתוח וההבשלה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מופרעת מוקדם במהלך התקופה טרום לידה 1. תפקוד המוח התפתחותית אלה יכול לגרום לתופעות עמוקות, לכל החיים על תפקוד מוטורי, שפה, למידה ותהליך הזיכרון. שפע של גורמים גנטיים וסביבתיים היה מעורב בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות במהלך השנים האחרונות 2,3. גם אם המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפנוטיפ הקליני אינו ידועים, הממצאים הנ&quot;ל אפשרו הפיתוח של מספר מודלים עכבר של הפרעות אלה. גירעונות למידה וזיכרון זוהו במספר המודלים האלה עכבר כגון Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,NF1 +/- וEn2 - / - עכברים 2,4-7. אתגר חשוב בתחום של הפרעות התפתחותיות הוא זיהוי של תהליכים תאיים ומולקולריים שבבסיס זיכרון ולמידת תפקוד לקוי. מסלולי איתות נבחרים הופעלו במהלך למידה או זיכרון יכולים לגרום לשעתוק של גנים ספציפיים וסופו של דבר להוביל לדה נובו סינתזת חלבון. שינויים סינפטיים גנים מיידיים-מוקדם הפעלה (IEGs) וחלבון תלוי מושרים במהירות בתאי עצב במוח בתגובה לפעילות עצבית ואימון התנהגותי 8,9. גירעונות במסלולי איתות מעורבים neurofibromin נקשרו עם למידה לקויה בהפרעות התפתחותיות. Neurofibromin הוא התוצר של גן NF1, מוטציה שגורם לסוג 1 נוירופיברומטוזיס, תסמונת גנטית מורכבת מאופיינת בגידולים של מערכת עצבים, עיכובים התנהגותיים ומוטוריים, וDisa קוגניטיביתbilities 10. הטרוזיגוטיים עכברים למחיקת NF1 המוגבלים לנוירונים מעכבים להראות גירעונות בשלב המוקדם של הגברה לטווח ארוך (LTP), כמו גם למידה מרחבית נפגעה בMWM 5,11,12. מעניין לציין, חוסר NF1 במודל עכבר זה מוביל להפעלת יתר של איתות ראס בinterneurons המעכבת במהלך למידה, וכתוצאה מכך זירחון ERK גדל ולבסוף בשיפור חריג של שחרור GABA מהנוירונים האלה 5. בהתבסס על ממצאים אלה, להדמיה של פעילות עצבית לאחר משימות התנהגותיות מייצגת דרך לשחזר מעגלים ספציפיים מעורבים במחלות נוירו-התפתחותי. פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה המתואר כאן מטרה להעריך ולכמת רמות זירחון ERK היפוקמפוס הבאות MWM במודל עכבר ASD עם ליקויים קוגניטיביים. MWM נעשה שימוש נרחב לחקור למידה בהיפוקמפוס תלויה במרחב ובזיכרון במכרסמים 13,14 </sעד&gt;. אנחנו מחליטים להשתמש זירחון ERK כקריאת נתונים מולקולריים של למידה בהיפוקמפוס משימה תלויה, מאז ERK הוצג לי תפקיד חיוני בלמידה וזיכרון היווצרות 15. יתר על כן, מסלול ERK הוא הכרחי לפלסטיות ניסיון תלוי בפיתוח החזותית 16 הקליפה. לבסוף, עכברים חסרי אחד משני ERK isoforms (ERK2) בתכנית של מערכת העצבים המרכזית מסומנים חריגות בהתנהגות קוגניטיבית, רגשית וחברתית 17, מצביעים על כך שאיתות ERK עשויה לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם. השתמשנו Engrailed 2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים כמודל של הפרעות התפתחותיות. En2 - / - עכברים להראות תכונות אנטומיים והתנהגות &quot;כמו-ASD&quot;, לרבות אובדן interneurons המוח הקדמי 18, ביטוי מופחת של גנים הקשורים-ASD 19, ירד חברותיות, וגמישות מחשבתית לקויה 6,7,20. learni מרחביng ופגמי זיכרון, כמו אלה שהתגלו בMWM, הם חזקים במיוחד בEn2 - / - עכברי 6,7 ועשוי להיות רלוונטי לליקויים קוגניטיביים שנצפו בחולי ASD 21. יתר על כן, הראתה שהלמידה מרחבית לקויה בMWM קשורה ביטוי neurofibromin מופחת ורמות גבוהות הטבה בhilus של En2 - / - עכברים בוגרים 7. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול מפורט לאפיון immunohistochemical של ההטבה הבאה MWM במודל עכבר ASD זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

אינדוקציה של קינאז phosphorylated מוסדר תאי (הטבה) היא קריאת נתונים מולקולריות אמינה של הפעלה עצבית למידה תלויה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה הטבה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. באופן ספציפי, אנחנו משמשים immunostaining ההטבה ללמוד הפעלה עצבית הבאות מבוך המים מוריס (MWM, משימת למידה בהיפוקמפוס תלוי קלסית) בEngrailed-2 נוקאאוט (En2 - / -) עכברים, מודל של הפרעות ספקטרום האוטיסטי (ASD). בהשוואה לפרא-סוג פקדים (WT), En2 - / - עכברים הראו גירעונות למידה מרחבית משמעותיים בMWM. לאחר MWM, הבדלים משמעותיים במספר תאי עצב הטבה חיובי אותרו בתת תחומים ספציפיים בהיפוקמפוס של En2 - / - עכברים, בהשוואה לבעלי החיים WT. כך, הפרוטוקול שלנו יכול וחסונה לזהות הבדלים בנוירונים הטבה חיוביים הקשורים לירידת ערך למידה בהיפוקמפוס תלוי במודל עכבר של ASD. באופן כללי יותר, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם לחקור את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בשני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להמחיש, על ידי אימונוהיסטוכימיה, הביטוי של סמן ספציפי של פעילות הנוירון היפוקמפוס לאחר MWM במודל עכבר של הפרעות התפתחותיות. כל נתוני הניסוי הראו זאת נלקחו מהעבודה האחרונה שלנו 7. WT זכר והנקבה וEn2 - / - המלטה באותו הגיל מבוגר (בן 3-5 חוד?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders at JoVE.com

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  University of Trento.  אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של ה?...

Video: Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

שימוש MazeSuite והתפקודי ליד ספקטרוסקופית אינפרא אדום כדי ללמוד למידה מרחבית ניווט

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו<em&gt; בחי</em&gt; Microdialysis במהלך בדיקת זיכרון המרחבי

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

הערכת למידה וזיכרון המרחבי קטן קַשׂקַשִׂי זוחל

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.