Los autores desean agradecer al Dr. John Harbell por su apoyo y tiempo científica dedicada al proyecto IET. Los autores también desean agradecer a Beiersdorf AG (Alemania), los VII (EE.UU.), Mary Kay Inc. (EE.UU.), Avon Products Inc. (EE.UU.), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Suiza), Laboratoire Pierre Fabre (Francia), Harlan Laboratories (Reino Unido), y LVMH Parfume (Francia) para la participación en estudios de la Prueba de Irritación ocular 15 Multi-Centro Internacional de prevalidación y validación.

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	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. 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Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. 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Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. 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Tasas de publicación para este artículo fueron pagados por MatTek Corporation.

Hemos presentado la Prueba de irritación ocular (Figura 1) que fue desarrollado para el modelo de tejido EpiOcular. El IET es capaz de separar los irritantes oculares y corrosivos (GHS Categorías 1 y 2 combinados) a partir de materiales que no requieren etiquetado (GHS No Categoría) con alto grado de sensibilidad y especificidad 17. El IET como se presenta en este documento no discrimina entre SGA Categoría 1 de Categoría 2 productos químicos. El IET fue validado para la clasificación y el etiquetado de potencial de irritación ocular de una amplia gama de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. En conjunción con otros ensayos in vitro, el EIT servir como un reemplazo para el ensayo de irritación de ojo de conejo in vivo. El IET utiliza dos protocolos similares pero distintos para materiales líquidos y sólidos, que varían en el tiempo de exposición y períodos de incubación después de la exposición (Figura 1). El criterio de valoración utilizado en el IETes la viabilidad del tejido, determinado por el ensayo MTT, que se ha utilizado previamente en modelos validados de tejidos epiteliales humanas 20,21. Para realizar este ensayo, no se necesita ningún equipo especial además de equipo de cultivo celular estándar. Debido al alto nivel de reproducibilidad de tejido-al tejido, n = 2 en lugar de los tejidos generalmente recomienda n = 3 se utilizan. La capacidad de utilizar n = 2 los tejidos es un aspecto crítico del protocolo, ya que permite a un operador con experiencia para procesar simultáneamente dos tejidos, reduciendo así al mínimo la variabilidad del ensayo que puede surgir debido a la diferente manejo de tejidos individuales 14. Además, mediante el uso de n = 2 tejidos por artículo de prueba, la irritación de las 10 sustancias de prueba del mismo estado físico (líquido o sólido), junto con los controles positivos y negativos, se puede evaluar utilizando un kit (24 tejidos). Otros puntos clave que garantizan la clasificación fiable de materiales son las especificaciones para el control positivo Dobstance (viabilidad del tejido ≤50.0%), la reproducibilidad entre los tejidos duplicados (diferencia &lt;20,0%), y las lecturas de DO de control negativo (&gt; 0,8 y &lt;2,5). Al realizar la prueba de IET, es importante seguir el protocolo validado y para la dosificación sugerida y horarios de enjuague (Tablas 3 y 4), ya que la desviación del protocolo o los cambios en los períodos de incubación puede dar lugar a resultados alterados. Del mismo modo, las desviaciones del tiempo de 3 horas para la incubación MTT darán lugar a diferentes lecturas MTT y pueden afectar resultado del ensayo. Ocasionalmente, una sustancia de ensayo puede tener propiedades ópticas o de otro tipo que puedan interferir con la viabilidad del tejido ensayo MTT o reducción causa de MTT. Por ejemplo, un compuesto químico de prueba puede reducir directamente MTT en un producto de reacción azul-púrpura, o puede ser una sustancia coloreada que absorbe la luz en el mismo rango que MTT formazán (~ 570 nm). Sin embargo, estos productos químicos de prueba se present un problema solamente, si en el momento del ensayo MTT, una cantidad suficiente del material todavía está presente en (o absorbida por) el tejido. Para evitar esta interferencia, los procedimientos extensos de enjuague se incorporan en el protocolo de EIT. Si el enjuague no quita el TA y TA interfiere con la reducción del MTT, controles adicionales deben ser utilizados para detectar y corregir para ello. En pocas palabras, si se sospecha de reducción de MTT directa de la sustancia de ensayo, 50 l (o 50 mg de sólidos) del producto químico en cuestión se incuba durante 3 horas con una solución de MTT de trabajo en SCC (NC, 50 l de agua desionizada estéril, debe ser ejecutar simultáneamente). Si la solución de MTT se vuelve azul-púrpura, el artículo de prueba se presume que han reducido el MTT. En este caso, una comprobación funcional utilizando los controles de tejido por congelación muerto se debe realizar para evaluar si el material de prueba es vinculante para el tejido y que conduce a una falsa señal de reducción de MTT. Si hay reducción de MTT apreciable en el control de tejido muerto expuesta-TA(en relación con la cantidad en el tejido viable sin tratar), la viabilidad del tejido media del artículo de prueba debe ser corregido restando la viabilidad media del control matado. El IET yerra en el lado de la seguridad, como lo demuestra la baja incidencia de las clasificaciones negativas falsas 14,15,18. Es importante destacar que ninguno de los productos químicos SGA Categoría 1, que son corrosivos para el ojo y que representan el peligro ocular más grave, fueron clasificados como no irritante en este ensayo 14,15,18,19. Por último, una de las principales ventajas de la RHCE en el método de ensayo in vitro es la posibilidad de probar líquido puro y materiales sólidos (que no es posible con cultivos celulares bidimensionales, sumergidos). El IET contribuirá de manera significativa en la determinación del potencial de irritación ocular de una amplia gama de materiales de acuerdo con la clasificación y el etiquetado del sistema SGA de la ONU. La sustitución de los animales para determinar oToxicidad cular ha sido un objetivo de la investigación toxicológica durante muchos años. El método de prueba IET ha completado un estudio formal de validación con el apoyo de EURL CEVMA en 2014 y de la EpiOcular IET fue implementado en las Directrices de ensayo de la OCDE TG 492 de la OCDE como en 2015.

Los productos de consumo tales como cosméticos, detergentes y productos de limpieza para el hogar incluyen una variedad de sustancias químicas que pueden provocar lesiones graves si entran en contacto con los ojos. Por lo tanto, las pruebas de estos agentes para la irritación de los ojos es requerido por las agencias reguladoras de Estados Unidos y de la UE para garantizar la seguridad de los consumidores 1. Una evaluación del potencial de irritación de los ojos de las mezclas y formulaciones es también un requisito para cumplir con REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas) legislación para el etiquetado de los ingredientes cosméticos bajo la Directiva sobre cosméticos de la UE para el transporte de productos químicos, y por el etiquetado de los pesticidas y productos para el hogar 2. Actualmente, las agencias reguladoras requieren la evaluación del peligro ocular mediante el Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS) 3. SGA se basa principalmente en la prueba de irritación ocular de Draize, el ensayo de irritación ocular más utilizado en las que las sustancias extrañas y mixtures se introducen directamente en el saco conjuntival del ojo del conejo 4. De acuerdo con la clasificación del SGA, SGA Categoría 1 (corrosivos oculares) se refiere a las sustancias que causan lesión inicial severo a los tejidos oculares o daño grave al ojo y la visión que no es totalmente reversible en los 21 días después de la exposición 3.5. GHS categoría 2 se refiere a las sustancias que producen cambios significativos en el ojo que son totalmente reversibles en los 21 días de exposición. Las sustancias de ensayo que no son corrosivos o irritantes se conocen como GHS Sin categoría. Durante más de 40 años, la prueba del ojo del conejo de Draize ha sido criticado por su falta de reproducibilidad, la sobreestimación de las respuestas humanas, y el uso de animales vivos 5-8. Estas preocupaciones han alentado a muchas propuestas de refinamiento, reducción y sustitución de la prueba in vivo 9. La necesidad de alternativas sin animales validados se fortaleció aún máspor la adopción de la Séptima Enmienda de la Directiva sobre cosméticos, que prohibió el uso de animales en la evaluación de la seguridad de los productos cosméticos (en 2005) y los ingredientes (en 2009) 2. Desde 1996, el modelo de tejido-córnea como reconstruido ha sido ampliamente utilizado por la industria cosmética para evaluar el potencial de irritación de las materias primas, formulaciones a base de tensioactivos y mezclas que están diseñados para su uso en compuesto, o en las proximidades de, el ojo 10-13. El uso del modelo de tejido RHCE permite la aplicación tópica directa del material de prueba sobre la superficie del tejido en su forma nativa, sin diluir. De esta manera, las formulaciones no solubles en agua pueden ser probados sin diluir con disolventes. En respuesta a la EURL de CEVMA (Centro Europeo Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Validación de Métodos Alternativos) solicitud de un método ampliamente aplicable, directa y económica del Test de irritación ocular (IET) que utiliza un single tiempo de exposición y es capaz de separar los irritantes oculares y corrosivos con materiales que no requieren etiquetado fue desarrollado (Figura 1) 14. Basándose en los resultados para 83 productos químicos (44 líquidos y 39 de sólidos), el EIT logra 95,5 / 68,2 / y 81,8% de sensibilidad / especificidad y exactitud (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / y 84,6% SS &amp; A para sólidos, y 97,6 / 68,3 / y 83,1% para el general de las SS &amp; A. En 2007, un multi-laboratorio de estudio de pre-validación patrocinado por Cosméticos Europa (anteriormente Colipa) bajo los auspicios de la CEVMA EURL evaluó la relevancia y fiabilidad del IET con el objetivo de llevar a validación formal 15. En este estudio, se realizaron 298 ensayos independientes en siete laboratorios independientes. Los resultados del estudio demostraron acuerdo de 99,7% en la predicción con bajos coeficientes de variación en todos los laboratorios participantes 15. Como resultado, en 2010 el protocolo EIT entró en una EURL formales CEVMAprograma de validación. El estudio de validación utilizado 104 sustancias químicas de prueba codificadas, incluidas las sustancias individuales y mezclas químicas, para lo cual en vivo los datos de referencia (Draize datos irritación de los ojos) estaban disponibles. Basado en el éxito de este trabajo, una guía de proyecto de ensayo de la OCDE se presentó en 2014. Se prevé que el IET contribuirá de manera significativa a la clasificación del potencial de irritación ocular de una amplia gama de materiales de acuerdo con la clasificación y el etiquetado del sistema SGA de la ONU.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

Para cumplir con la Enmienda Séptima a la legislación Directiva sobre cosméticos y de REACH de la UE de la UE, se necesitan métodos alternativos sin animales validados para la evaluación fiable y exacto de toxicidad ocular en el hombre. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular (IET), que utiliza un modelo tridimensional reconstruida humano-como córnea epitelial (RHCE) tejido que se basa en las células humanas normales. El IET es capaz de separar los irritantes y corrosivos oculares (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría). La prueba utiliza dos protocolos separados, uno diseñado para productos químicos líquidos y un segundo protocolo, similar para artículos de prueba sólidos. El modelo de predicción EIT utiliza un único período de exposición (30 min para líquidos, 6 hr para los sólidos) y una sola viabilidad del tejido de corte (60,0% según se determina mediante el ensayo de MTT). Basado en los resultados para 83 productos químicos (44 líquidos y sólidos 39) IET logra 95,5 / 68,2 / 81,8% y sensitivity / especificidad y la precisión (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% y SS &amp; A para sólidos y 97,6 / 68,3 / 83,1% y para el general de las SS &amp; A. El EIT contribuirá significativamente a clasificar el potencial de irritación ocular de una amplia gama de productos químicos líquidos y sólidos sin el uso de animales para satisfacer los requisitos de ensayos reglamentarios. El método EpiOcular IET se implementó en 2015 en las Directrices de la OCDE como TG 492.

Resultados EIT representativos realizados con 10 artículos de prueba (TA) y controles negativos y positivos se presentan en la Tabla 6 y la Figura 3. La media OD = 1,31 para la NC corresponde a 100% la viabilidad del tejido, por lo tanto el PC (DO media = 0,41) tenían la viabilidad del tejido relativa de 31,2%. Cuando el protocolo IET se realizó en 15 experimentos independientes válidos en 7 laboratorios utilizando el protocolo de exposición líquida y en 8 experimentos válidos independientes en 4 laboratorios, utilizando el protocolo de exposición sólida, la viabilidad media de tejido para el PC utilizando el protocolo de líquido fue 36,4 ± 4,0 % y 32,3 ± 6,4% para el protocolo de sólidos. En todos los casos, los resultados de los controles positivos fueron por debajo del valor de corte de 60,0% 15. Como se muestra en la Figura 3, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8 tenido viabilidades de tejidos&gt; 60,0% y por lo tanto fueron clasificados como &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10 tenía Viabilidades tejido X04; 60,0% y por lo tanto fueron clasificados como &quot;I&quot;. La diferencia de la viabilidad del tejido entre los tejidos duplicados era &lt;20,0% para todos los TA con una excepción de TA2. Por lo tanto, los resultados de todos los artículos de prueba, con la excepción de TA2, se consideraron &quot;calificado&quot;, ya que cumplen todos los criterios de aceptación del IET (Sección 10.2). Debido a la alta variabilidad entre tejidos duplicados para TA2 en el experimento inicial, un segundo experimento era necesario para obtener resultados EIT calificados. El método de prueba IET como se describe aquí utilizando el modelo de tejido RHCE se utilizó para la evaluación de la irritación ocular en varios estudios de validación multilaboratorio, incluyendo validación formal por el CEVMA EURL / Cosméticos Europa 15,17-19. En todos los estudios, el IET ha demostrado ser reproducible y fue capaz de identificar correctamente los productos químicos (ambas sustancias y mezclas) que no requieren de clasificación y etiquetado de la irritación ocular o lesiones oculares graves acacuerdo con la ONU GHS 15,17-19. El método de prueba IET cumple los criterios de aceptación del Grupo de Gestión de Validación (VMG) para la irritación de los ojos para la sensibilidad, especificidad y precisión global y en la actualidad está pendiente de aplicación formal a la renovación parcial de conejo en vivo Test Draize 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema del protocolo IET para artículos de prueba líquidos y sólidos Abreviaturas utilizadas: AM, medio de ensayo;. SCC, condiciones de cultivo estándar; PBS, fosfato de Dulbecco solución salina tamponada; RT, la temperatura ambiente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figura 2:. La configuración de la placa de 96 pocillos estandarizado para la prueba de viabilidad del tejido MTT Dos 200 alícuotas son transferred a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos pre-marcado. Abreviaturas utilizadas: NC, control negativo; PC, control positivo; TA1-TA20, artículos de prueba 1-20; Solución en blanco, de extracción. 96- configuración de placas MTT se utiliza con hoja de cálculo Excel diseñado para calcular la viabilidad del tejido RHCE y los resultados del IET. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figura 3: Resultados del IET obtuvieron de los artículos 10 de la prueba, Carolina del Norte y los controles de PC utilizando el modelo de tejido RHCE La gráfica se genera a partir de una hoja de cálculo de Excel diseñada para presentar los resultados del IET.. Las sustancias de ensayo que redujo la viabilidad del tejido ≤ 60,0% con respecto a Carolina del Norte se clasifican como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10) y los productos químicos de prueba que tenía la viabilidad del tejido&gt; 60,0% son clasificados como no-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Hora de inicio de los pasos de trabajo de protocolo IET (un día de trabajo por un operador) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada línea corresponde a un par de tejidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orden de pasos: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Líquidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposición </td><td> Post- Remoje </td><td> Post- <td> MTT Reacción </td><td> MTT Extracción </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 minutos </td><td> 30 minutos </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> Sobredosis </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 12:12 </td><td> 15:12 </td><td> después </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 09:01 </td><td> 9:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 12:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 12:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 12:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 12:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 12:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 12:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 12:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 12:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> Veintiuno después de las diez </td><td> Veintiún después de las doce de la noche </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 12:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 12:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3:. Horario Tiempo de la muestra para la prueba de los artículos de prueba líquidos pasos del protocolo, incluyendo pre-mojar los tejidos con DPBS, Aplicación de los artículos de prueba (TA), enjuague y Post-remojo, periodo post-incubación, ensayo MTT, Extracción de MTT, y medición de OD MTT se presentan en columnas. Los tiempos para los tejidos duplicados se organizan en filas. La totalidad de las pruebas de ensayo de 10 TA y controles se pueden acabar en un día. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Hora de inicio de los pasos del protocolo del IET (2 días de trabajo para un operador) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada línea corresponde a un par de tejidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Día 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Día 2 (día siguiente) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orden de pasos: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sólidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposición </td><td> Post- Remoje </td><td> Post- Incubaction </td><td> MTT Reacción </td><td> MTT Extracción </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 minutos </td><td> 6 hr </td><td> 26 min </td><td> 18 horas </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> Sobredosis </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 12:56 </td&gt; <td> después </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 12:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ Td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 4: horario Tiempo de la muestra para la prueba de los artículos de prueba sólidos. Pasos del protocolo incluyendo pre-humectación de los tejidos con DPBS, Aplicación de los artículos de prueba, aclarado y Post-remojo, período post-incubación, el ensayo de MTT, Extracción de MTT, y medición de OD MTT se presentan en columnas. Los tiempos para los tejidos duplicados se organizan en filas. Todo el ensayo de prueba de 10 TA y controles se lleva a cabo durante un período de dos días. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Cantidad </td><td> Reactivo </td><td> Condiciones de almacenamiento </td><td> Fuente </td><td> Descripción </td><td> Fecha de caducidad </td></tr><tr><td> 1 vial, 2 ml </td><td> MTT Concentrado (MTT-100-CON) </td><td> Protegido de la luz (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Frozen MTT concentrado </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 vial, 8 ml </td><td> MTT diluyente </td><td> 2-8 y# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Para diluir el concentrado MTT antes de su uso en el ensayo de MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 botella, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Solución de extracción </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabla 5: MTT-100 Componentes del kit de ensayo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Código N ° </td><td> Tejidos </td><td colspan="2"> Los datos en bruto </td><td colspan="2"> Datos corregidos en blanco </td><td rowspan="2"> media de OD </td><td rowspan="2"> % De la viabilidad </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1,150 </td><td> 1,149 </td><td> 1,150 </td><td> 1,150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> significar </td><td> Dif. </td><td> significado de </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Clasificación </td></tr><tr><td></td><td> de OD </td><td> de OD </td><td> viabilidades [%] </td><td> de viabilidades </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0,041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> Ordenador personal </td><td> 0,410 </td><td> 0,043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1,292 </td><td> 0,127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0,333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0,078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1,100 </td><td> 0,101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> YO </td><td> calificado </td></tr></tbody></table> Tabla 6:. Los resultados obtenidos del IET por 10 artículos de prueba, controles NC y PC Las mesas son produced por una hoja de cálculo de Excel diseñado para calcular la viabilidad del tejido y los resultados del IET. Las sustancias de ensayo que redujo la viabilidad del tejido ≤ 60,0% con respecto a Carolina del Norte se clasifican como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 y TA10) y los productos químicos de prueba que tenía la viabilidad del tejido&gt; 60,0% son clasificados como no-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, y TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.0K vistas.  MatTek Corporation.  Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría). 

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Investigación

Bioingeniería

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Tecnología celular encapsulada para la entrega de productos biológicos al ojo del ratón

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales humanas y ovinas en membranas biomateriales

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Cuantificación de la organización del colágeno fibrilador con herramientas basadas en curvelet transform

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...