Este método se puede utilizar para evaluar in vitro la toxicidad de nuevas formulaciones de productos oftálmicos. Al refinar las concentraciones de productos químicos y formulaciones de productos utilizando células oculares in vitro, se puede minimizar el uso de animales para evaluar la seguridad de nuevos productos. Los ensayos in vitro evalúan los criterios de valoración de toxicidad que no se pueden evaluar in vivo, como determinar el efecto de una sustancia química sobre la función mitocondrial, la integridad de la membrana celular y la actividad enzimática.
Evaluar la toxicidad celular in vitro es clave para comprender los posibles mecanismos de toxicidad. Esto es esencial para establecer una dosis máxima tolerable de productos químicos terapéuticos en el ojo. Demostrando el procedimiento estará Nijani Nagaarudkumaran, un investigador del Laboratorio Jones.
Comience colocando tanto pHCEC como iHCEC en placas de Petri recubiertas de colágeno con hojas de cubierta inferior de vidrio a una concentración de 1 x 10 a la 5ª con 1 mililitro de medio de epitelio ocular humano, o HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs 1 conjunto de cultivos durante 24 horas y otro conjunto durante 48 horas en una incubadora de 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, tiñe las células con 500 microlitros de solución tampón de tinción de anexina que contiene 4 calceína micromolar, 8 homodímeros de etidio micromolar 1 y anexina 5 durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Después de teñir las células, ajuste el microscopio de escaneo láser confocal para capturar las longitudes de onda de excitación y emisión, como se describe en el texto manuscrito. Obtenga las imágenes bidimensionales y tridimensionales siguiendo las instrucciones del manuscrito. Sembrar las células a 5 x 10 a 4 por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno 1 de 24 pocillos e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 3 horas.
Después de la incubación, reduzca el volumen del medio en los pozos a 300 microlitros. A continuación, exponga las células a la radiación UVA a 6,48 vatios por metro cuadrado, y la radiación UVB a 1,82 vatios por metro cuadrado a 37 grados centígrados durante 5 y 20 minutos en experimentos separados. Después de la radiación UV, agregue 200 microlitros de HOEM fresco a cada pozo e incube durante 20 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, recoja el sobrenadante celular en cada pocillo y transfiéralo a tubos estériles de polipropileno de 2 mililitros. Congele el sobrenadante a menos 80 grados centígrados. Para determinar los niveles de citoquinas liberados por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los rayos UV, use un ensayo de citoquinas multiplex y siga las instrucciones del kit para cuantificar la interleucina 6, la interleucina 8, la interleucina-1 beta y el TNF-alfa.
Preparar un reactivo de ensayo metabólico al 10% en DMEM y F12. Reemplace el medio de cultivo en cada pocillo con 1 mililitro de la solución de ensayo metabólico al 10% e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a 530 nanómetros de excitación y 590 nanómetros de longitud de onda de emisión.
Células de semilla de 5 x 10 a cuarto por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno 1 de 24 pocillos. Incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Después de la incubación, retire el medio y exponga las células a 1 mililitro de toxinas químicas, que incluyen cloruro de benzalconio al 0,001%, o BAK, peróxido de hidrógeno al 0,01% y dodecil sulfato de sodio al 0,0025% en PBS durante 5 y 15 minutos.
Después de la exposición a las toxinas químicas, retire las toxinas de los pozos, enjuague con 1 mililitro de PBS y agregue 1 mililitro de HOEM a cada pozo. Después de 20 horas de incubación, realice un ensayo metabólico reemplazando el medio con 1 mililitro de una solución de ensayo metabólico al 10% e incubando a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 4 horas. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a 530 nanómetros de excitación y longitudes de onda de emisión de 590 nanómetros.
Transfiera los sobrenadantes celulares de los pozos después de la incubación de 20 horas en tubos de polipropileno estériles de 2 mililitros separados y congélelos a menos 80 grados centígrados. Utilice la misma plataforma multiplex utilizada para evaluar las citoquinas de las células tratadas con UV siguiendo las instrucciones del kit para cuantificar la interleucina 6, la interleucina 8, la interleucina-1 beta y el TNF-alfa. Semillas de células de 1 x 10 a 5 por mililitro de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno de 24 pocillos 1 e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Después de la incubación, retire el medio y exponga las células a 1 mililitro de toxinas químicas, incluyendo 0.001% BAK, 0.005% BAK y 0.01% BAK en PBS durante 5 minutos. Después de la exposición, elimine las toxinas químicas, enjuague los pocillos con 1 mililitro de PBS y agregue 1 mililitro de HOEM a cada pocillo. Después de 20 horas de incubación, tiñe las células con 500 microlitros de solución tampón de tinción de anexina que contiene calceína, homodímero de etidio y anexina 5 durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Ajuste el microscopio para medir intensidades en longitudes de onda de excitación y emisión de 630 y 675 nanómetros para la anexina 5, 495 y 515 nanómetros para la calceína AM, y 528 y 617 nanómetros para la tinción de etidio 1. Luego adquiera imágenes de las células usando el microscopio de fluorescencia. Se encontró que los iHCEC eran células pequeñas que varían de 10 a 20 micrómetros y los pHCEC estaban en el rango de 20 a 50 micrómetros después de 24 horas de crecimiento.
Se observaron diferencias similares en el rango de tamaño para iHCEC y pHCEC después de 48 horas de crecimiento. En comparación con las células no expuestas a los rayos UV, la actividad metabólica de los pHCEC irradiados se redujo significativamente a los 20 minutos de exposición. Para los iHCEC, la actividad metabólica disminuyó para las células irradiadas a los 5 y 20 minutos.
Por lo tanto, se necesitó un tiempo de exposición más largo para reducir la actividad metabólica de los pHCEC que de los iHCEC. La liberación máxima de citoquinas por los iHCEC fue a los 5 minutos de exposición a los rayos UV. La liberación máxima de citoquinas para los pHCEC ocurrió a los 20 minutos de exposición a los rayos UV.
En términos de cantidades totales de citoquinas inflamatorias liberadas, las pHCEC liberaron sustancialmente más interleucina-1 beta, interleucina 8 y TNF-alfa que las iHCEC, mientras que las iHCEC liberaron más interleucina 6. Tanto los pHCEC como los iHCEC mostraron un cambio en la liberación de interleucina 6 después de la exposición a los tres productos químicos. BAK causó una disminución en la liberación de interleucina 6 en comparación con el control para HCEC primarios e inmortalizados.
El peróxido de hidrógeno causó un aumento en la liberación de interleucina 6 de iHCECs y una disminución en la liberación de pHCECs. Tanto los pHCEC como los iHCEC se dañaron significativamente al 0,005% y al 0,1% del BAK. Después de realizar evaluaciones in vitro de la toxicidad de las células oculares, se podrían realizar otros modelos animales de toxicidad ocular para determinar el efecto de un producto ocular sobre los nervios corneales o el sistema inmunitario ocular.
Estas técnicas son esenciales para determinar los mecanismos de toxicidad química y de formulación de productos en el ojo y ayudarán a minimizar el uso de animales para las pruebas de desarrollo de productos.
