Los autores desean agradecer a ZEBET en el BfR (Alemania), BASF SE (Alemania), IIVS Inc. (EE.UU.), LSL-Zet (Austria) para participar en Multi-centro de estudio de validación internacional de la SIT Modificado EpiDerm (5 ).

I. Acondicionamiento de los tejidos - Día 0 <ol><li> Tras la recepción de la epidermis del PAI-200-SIT, accede a todos los componentes del kit para la integridad (para más detalles véase el cuadro kit de reactivos y equipos específicos). </li><li> Por cada tres tejidos EpiDerm, preparar una estéril de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo. </li><li> En condiciones estériles, abra la bolsa de plástico que contiene la placa de 24 pocillos que contienen los tejidos EpiDerm y retire la gasa estéril. </li><li> Usar pinzas estériles para eliminar cada inserción que contiene el tejido EpiDerm y el lugar de inserción en el vacío de 24 pocillos. Durante este paso, eliminar cualquier resto de agarosa de envío que se adhiere a los lados exteriores de la pieza por suaves secante sobre papel de filtro estéril. </li><li> Dentro de los próximos 5 minutos, una inspección visual de los tejidos. No utilice los tejidos defectuosos o tejidos que están completamente cubiertas de líquido. </li><li> Utilizando un hisopo de algodón punta estéril, seque la superficie de los tejidos. Trate de no tocar directamente el tejido - efectos capilares son suficientes para eliminar la humedad de la superficie del tejido. </li><li> Después de secar la superficie del tejido, la transferencia de tres tejidos de la fila superior de las placas de 6 pocillos precargada con 0,9 ml de medio de ensayo. Liberar las burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos. </li><li> Coloque las placas de 6 pocillos que contienen los insertos en la incubadora por un 60 ± 5 min de pre-incubación a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de HR (Humedad Relativa). </li><li> A finales de los 60 ± 5 min de pre-incubación período, la transferencia de los insertos de los pozos de alta en los pozos inferior de la placa de 6 pocillos. Coloque las placas de nuevo en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) para una noche de pre-incubación (18 ± 3 horas). </li><li> Coloque el resto del medio de cultivo en el refrigerador (5 ± 3 ° C). Después de la noche a la mañana la pre-incubación, la sustancia de ensayo se puede aplicar a los tejidos EpiDerm. Nota: El procedimiento de pre-incubación puede acortarse en caso de entrega tardía del tejido (por ejemplo, si los tejidos llegan el miércoles en lugar del martes). </li></ol> II. Exposición a sustancias químicas - Día 1 <ol><li> Prepare una placa de 6 pocillos por cada sustancia de ensayo mediante la cumplimentación de la fila superior sólo con 0,9 ml por pocillo de medio de cultivo. </li><li> Aproximadamente 5 minutos antes de la exposición prevista a los productos químicos, quitar las placas de 6 pocillos que contienen los tejidos pre-acondicionado de la incubadora. </li><li> Evaluar la superficie de los tejidos y eliminar la humedad con puntas de algodón estéril. </li><li> Etiqueta de todas las tapas placa de 6 pocillos con los códigos de ensayo de materiales o nombres. </li><li> Dosis de los tejidos con la sustancia de ensayo a intervalos de 1 minuto para facilitar el lavado de los productos químicos de prueba después de la exposición. Mantener las placas con los tejidos dosis en la campana estéril, hasta el último tejido se dosifica. </li><li> Para probar los productos químicos líquidos, prescindir de 30 l de la solución directamente sobre el tejido y colocar la malla de nylon en la superficie de los tejidos. Si es necesario, con cuidado la posición de la malla con el bulbo de vidrio dirigido pipeta Pasteur. No presione sobre la superficie del tejido. </li><li> Para las pruebas semi-sólidos, el uso de una pipeta de desplazamiento positivo para prescindir de 30 l directamente sobre el tejido. Si es necesario difundir la sustancia química con la pipeta Pasteur para cubrir la superficie del tejido tanto como sea posible. </li><li> Para los materiales sólidos, poco antes de la aplicación de la sustancia problema, humedezca la superficie del tejido, con 25 l de DPBS estéril. Esto permitirá mejorar el contacto de la superficie del tejido con la sustancia de ensayo. Llene una cuchara de 25 mg calibrado aplicación aguda (o cualquier otra herramienta apropiada), con aproximadamente 25 mg de material finamente pruebas en tierra. Aplicar la sustancia de ensayo sólidas a la superficie del tejido. Si es necesario, utilice una lámpara de cabeza con una pipeta Pasteur para vaciar la cuchara por completo. Agite suavemente los insertos para mejorar la difusión de los sólidos en la superficie. </li><li> El caso de sustancias de consistencia cerosa, tratar de formar un piso &quot;cookie como&quot; pieza de 8 mm de diámetro y colóquelo sobre el tejido, que se humedece previamente con DPBS estéril. Para mejorar el contacto entre la sustancia de ensayo y el tejido, pesan la &quot;cookie&quot; con un acero inoxidable o de plástico ayuda. </li><li> Aplicar DPBS como control negativo y el 5% SDS como control positivo en los tejidos control. </li><li> Después de la administración del tejido pasado, la transferencia de todas las placas durante 35 ± 1 minutos de la incubadora humidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa). </li><li> Después de los 35 ± 1 minutos de incubación a 37 ° C retirar todas las placas de la incubadora. Coloque las placas en la cubierta estéril y esperar hasta que un período de 60 minutos de exposición química se ha completado para el primer tejido dosificado. </li><li> Después de iniciar el procedimiento de lavado con la inserción de un intervalo de tiempo por minuto (para segurose que el tiempo total de exposición de cada inserción es de 60 minutos). </li><li> Utilice una botella de lavado para lavar los tejidos con DPBS estéril. Rellene el tejido insertar 15 veces mediante el uso de un flujo constante de DPBS y se vacía. (Nota: para los tejidos con una malla de nylon, lave la superficie del tejido 5 veces y retire la malla cuidadosamente con las pinzas de punta, afilada Después, continúe con el resto de 10 lavados). </li><li> Después del 15 de enjuague con la botella de lavado, sumergir completamente la inserción de 3 veces en 150 ml de DPBS y agitar para remover el resto del material de ensayo. </li><li> Por último, enjuagar la inserción del tejido una vez desde el interior y una vez que desde el exterior con DPBS estéril. </li><li> Eliminar el exceso de DPBS del tejido agitando suavemente la inserción, y borrando en el papel secante estéril. </li><li> La transferencia de los insertos de tejido borrados de la nueva placa de 6 pocillos previamente pre-llenado con medio de cultivo. Todos estos pasos (14-18) se debe hacer dentro de 1 minuto para cada inserción. </li><li> Después del último tejido se aclara, seque la superficie de cada tejido con un algodón estéril con punta de algodón. </li><li> Incubar los tejidos en la incubadora para los próximos 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa). Nota: Cada técnico ensayo no debe probar más de 6 sustancias de prueba, incluyendo los controles negativos y positivos en una carrera de prueba solo (juego), para poder seguir el protocolo que se describe a continuación </li></ol> III. Intercambio de soportes - Día 2 <ol><li> Después de las 24 ± 2 horas post-incubación, la transferencia de los insertos en la parte inferior de la placa de 6 pocillos, precargada con 0,9 ml de los medios de comunicación. Los medios de comunicación de las filas superiores pueden ser recogidos para el análisis de los criterios de valoración adicionales (citocinas, quimiocinas, etc.) El análisis de los criterios de valoración secundarios es opcional. </li><li> Continuar con la post-incubación (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) por 18 ± 3 horas. </li></ol> IV. MTT ensayo de viabilidad - Día 3 <ol><li> Etiqueta de dos placas de 24 pocillos con los nombres químicos o códigos. Una placa servirá para la incubación del tejido con MTT y el otro para la etapa de extracción. </li><li> Prepare la solución de MTT por el deshielo del concentrado de MTT (5 mg / ml) y diluir con el diluyente MTT. La concentración final de solución MTT es de 1 mg / ml. </li><li> Pipetear 300 L de solución de MTT en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. </li><li> Retire las placas de 6 pocillos de la incubadora, mancha el fondo de los insertos en un papel secante, y transferirlos a la placa de 24 pozos pre-llenado con MTT. </li><li> Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, el 95% de humedad relativa) y se incuba durante 3 horas ± 5 min. Se adhieren estrictamente a las 3 horas ± 5 min tiempo de incubación para evitar la desviación entre las lecturas MTT diferentes. </li><li> Cuando la incubación MTT, se debe utilizar una bomba de succión para aspirar suavemente el medio MTT de todos los pozos. </li><li> Rellenar los pozos con DPBS y aspire de nuevo. Repita este lavado dos veces más y asegurarse de que los tejidos se sequen después de la aspiración última. </li><li> Después de los lavados de transferencia de los insertos de una nueva placa de 24 pocillos. Sumerja los insertos pipeteando suavemente 2 ml de solución de extracción (isopropanol) en cada inserción. El nivel se elevará por encima de los bordes superiores de la inserción, por lo tanto completamente sumergido en los tejidos. </li><li> Sellar la placa de 24 pocillos (por ejemplo, con Parafilm o el uso de la bolsa de sellado) para inhibir la evaporación de extracción. Extracto de la MTT de los tejidos por lo menos 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador de placas (~ 120 rpm). Extracción de la noche sin agitación también puede ser utilizado. </li><li> Después del período de extracción, perforar los insertos con una aguja de inyección o una bombilla de cuentas pipeta Pasteur y permitir que el extracto para correr en el pozo de donde se tomó la inserción. </li><li> Deseche el inserto perforado y una pipeta la solución en el bien de arriba abajo tres veces hasta que sea homogénea. </li><li> Para cada tejido, la transferencia de dos alícuotas de 200 l de la solución de violeta de formazán en una placa de fondo de microtitulación de 96 pocillos plana. La transferencia de los duplicados de acuerdo con el diseño de la placa fijo establecido en la hoja de cálculo que acompaña a este protocolo de video. Para los blancos, el uso de isopropanol. </li><li> Lea la densidad óptica (DO) de los extractos de MTT en un espectrofotómetro de placa de 96 pozos con una longitud de onda de 570 nm (540 a 580) sin un filtro de referencia. </li><li> Introducir los resultados en la hoja de cálculo para el cálculo automático de los resultados (Figura 1). </li><li> Una sustancia de ensayo es como &#39;irritante&#39; (R38 o categoría del SGA 2) si la viabilidad de los tejidos por ciento determinado por el ensayo MTT es &lt;50% con respecto al control negativo. Nota: MTT es tóxico, así que asegúrese de usar guantes protectores cuando maneje. Proteger MTT y su modoluciones de la luz, ya MTT es sensible a la luz. Use una solución de MTT en unas pocas horas después de su preparación ya que se degrada con el tiempo. </li></ol> Calidad V. Ensayo controles <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT kit Criterios de Aceptación: En modelos in vitro CHE deben proporcionar datos consistentes, de alta calidad con el tiempo, no sólo durante el proceso de validación (8). Las pautas recomendadas para asegurar la reproducibilidad a largo plazo del ensayo y el rendimiento son &quot;una caracterización completa de las células o los tejidos, el muestreo de cada lote ... para el desempeño, y el uso regular de los controles y las sustancias químicas de referencia para ofrecer garantías de coherencia de sus resultados del ensayo&quot; (9) . Además de los criterios de aceptación del ensayo se describen a continuación, cada lote de producción de EpiDerm es el control de calidad probado por el fabricante en contra de una sustancia química de referencia adicionales (1% Triton X-100). El tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad del tejido al 50% (ET-50) de Triton X-100 se determina. Para EpiDerm, promedio anual ET-50 los valores han oscilado entre 5,9 horas y 7,5 horas. El lote de CV muchos de los tejidos de control negativo (es decir, la variabilidad de la viabilidad de referencia) tiene un promedio inferior a 7,5% por cada año desde 1996. El valor ET50 de cada lote de producción debe estar dentro de dos desviaciones estándar de la media histórica Triton X-100 ET50 establecido en 1996 (es decir, ET-50 = 6,7 horas; límite inferior de aceptación = 4.8h; límite de aceptación superior = 8.7h) con el fin de ser liberado para su uso por el fabricante. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 1: Control negativo: El OD absoluta del control negativo (NC) tejidos (tratados con DPBS estéril) en el MTT-test es un indicador de la viabilidad del tejido obtenido en el laboratorio de pruebas, después del transporte y el almacenamiento de los procedimientos y condiciones específicas de uso. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la media de la DO 570 de los tejidos NC es ≥ 1,0 y 2,5 ≤. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 2: Control Positivo Una solución al 5% de SDS (en H 2 O) se utiliza como control positivo (PC) y prueba al mismo tiempo que la sustancia de ensayo. Medios concurrentes que el PC tiene que ser probado en cada ensayo, pero no más de un PC se requiere por día de pruebas. La viabilidad del control positivo debe ser dentro de un intervalo de confianza del 95% de los datos históricos. El ensayo cumple con el criterio de aceptación, si la viabilidad media de los tejidos PC expresado en% de los tejidos de control negativo es del 20%. </li><li> EPI-200-SIT ensayo de aceptación Criterio 3: Desviación Estándar (SD) La irritación de la piel se predice a partir de la viabilidad media determinada sobre tres tejidos individuales y por lo tanto, la variabilidad de los tejidos replica debe ser aceptablemente bajo. El ensayo cumple con el criterio de aceptación si la SD calculado a partir de cada viabilidades% del tejido de los tres tratados de forma idéntica réplicas es &lt;18%. </li></ul> Resultados representante <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3" /> </div> Figura 1 Los resultados obtenidos durante 6 artículos de prueba, Carolina del Norte y el control de PC -. Parte de la hoja de cálculo automatizado para el cálculo de los resultados. Las sustancias de ensayo que reducía la viabilidad del tejido por debajo del 50% hace referencia a NC se clasifican como sustancias irritantes. La prueba ha sido optimizado para proporcionar resultados que sean lo suficientemente lejos de la clasificación de corte (50% de viabilidad) lo que aumenta la robustez del ensayo. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiales </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Lista de Materiales" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

En este vídeo, se ha demostrado la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para las pruebas in vitro irritación de la piel de sustancias químicas, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. Al llevar a cabo este método, es importante trabajar en condiciones de asepsia y seguir estrictamente el protocolo validado, ya que la desviación del protocolo puede provocar resultados diferentes. Algunas de las modificaciones de la prueba es posible, sin embargo, los cambios en el protocolo se tratarán directamente con los autores. La única limitación de este método es una posible interferencia de la sustancia problema con el extremo de MTT. Una sustancia de color o una que reduce directamente el MTT (y por lo tanto imita la actividad de la deshidrogenasa de la mitocondria celular) puede interferir con el extremo de MTT. Sin embargo, estas sustancia son un problema sólo si en el momento de la prueba de MTT (es decir, 42 horas después de la exposición de la sustancia) una cantidad suficiente de la sustancia todavía están presentes en (o dentro) de los tejidos. En el caso de este improbable caso, la reducción (true) MTT metabólicas y el aporte de un material de prueba de color o (falsa) de reducción de MTT directa por el material de prueba se puede cuantificar mediante un procedimiento descrito en detalle en el Procedimiento de Operación Estándar de ensayo proporcionado por MatTek Corp.

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

El ensayo de irritación cutánea EpiDerm (EpiDerm SIT) se desarrolló<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Y validado<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Para<em&gt; In vitro</emLa piel&gt; irritación de ensayos de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos. El SIT EpiDerm utiliza el 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Reconstruida epidérmico humano (CHE) EpiDerm modelo. El procedimiento descrito en este protocolo permite la discriminación entre los agentes irritantes de la categoría 2 del SGA y no irritantes<sup&gt; (6)</sup&gt;. La prueba se realiza a lo largo de un período de tiempo de 4 días, que consiste en la pre-incubación, 60 minutos de exposición, 42 horas después de la incubación y el ensayo de viabilidad MTT. Después de la recepción de tejidos y la noche de pre-incubación (día 0), los tejidos son sobre temas expuestos a la sustancia de ensayo (día 1), que puede ser líquido, semi-sólidos, sólidos o cera. Tres tejidos se utilizan para cada sustancia de ensayo, así como para el control positivo (5% aq. Solución de SDS), y un control negativo (DPBS). Exposición a productos químicos tiene una duración de 60 minutos, 35 minutos de que los tejidos se mantienen en una incubadora a 37 ° C. Las sustancias de ensayo se retiran de la superficie del tejido mediante un procedimiento de lavado intensivo. Las inserciones de tejido son borrados y se transfieren a un medio fresco. Después de un período de incubación de 24 horas (día 2), el medio se cambia. El medio se pueden guardar para su posterior análisis de las citocinas o los puntos de interés. Después del intercambio de soportes, los tejidos se incubaron durante 18 horas. Al final de la 42h todo después de la incubación (día 3), los tejidos se transfieren a una solución MTT amarilla y se incubó durante 3 horas. La resultante púrpura-azul sal de formazán, formado principalmente por el metabolismo mitocondrial, se extrae durante 2 horas con isopropanol. La densidad óptica de formazano extraída se determinará mediante un espectrofotómetro. Un producto químico está clasificado como un irritante si la viabilidad del tejido en relación con los tejidos tratados de control negativo se reduce por debajo del 50%. Este procedimiento puede ser utilizado como reemplazo total de la prueba in vivo de conejo irritación de la piel para la identificación de peligros y etiquetado de productos químicos en línea con las regulaciones de la UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

En este video, se demuestra la piel EpiDerm ensayo de irritación (EpiDerm SIT) elaborado y validado para<em&gt; In vitro</emLa piel&gt; irritación de ensayos de productos químicos, incluidos los ingredientes cosméticos y farmacéuticos.

Un In Vitro</emPiel> Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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Video: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

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Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

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Investigación

Biología

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Un In Vitro Prueba de irritación (SIT) con la epidermis humana reconstruida epidérmico (CHE) Modelo