The research work presented in this manuscript was supported by a grant (HL107319 to Alan Daugherty and HL107326 to Lisa A. Cassis) from the National Institutes of Health of the United States of America. The content in this manuscript is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The publication of this manuscript was sponsored by DURECT Corporation.

Declaración de Ética: Mouse estudios se llevan a cabo con la aprobación de la Universidad de Kentucky Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC número de protocolo: 2006-0009). Los ratones se sacrificaron a la terminación usando un cóctel de ketamina sobredosis (~ 210 mg / kg) y xilazina (~ 30 mg / kg). 1. Cálculo de la angiotensina II Importe NOTA: Este protocolo utiliza el ejemplo de infusión de AngII (1,000 ng / kg / min) durante 4 semanas en 4 receptor de LDL macho - / - ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada. <ol><li> Pesar estudiar los ratones antes de calcular la cantidad de angiotensina II necesaria para perfusión. </li><li> Utilice la plantilla (Tabla 1) para calcular la masa AngII necesaria para el experimento. Utilice la opción &quot;Mean bombeo Rate&quot; se indica en la Instrucción de bombas como la &quot;tasa de bombeo&quot; en el paso 4 de la plantilla. En la plantilla, ficha Pasos 1-5 manualmente y Pasos 6-10 se calculan automáticamente. <ol><li> En la plantilla, asumir queratones ganará 1 g de peso corporal durante la infusión de AngII 1000 ng / kg / min durante 4 semanas. NOTA: Cada ratón puede tener el aumento de peso corporal muy diferente que dependerá de muchas variables, tales como la cepa de ratón y la dieta. Utilizamos rutinariamente &quot;0&quot; o &quot;1 g&quot;, basada en la propia experiencia de los estudios anteriores. </li><li> Calcula un volumen total de 300 l de solución de Ang II para cada ratón desde cada bomba requiere aproximadamente 250 l. </li></ol></li></ol> 2. Disolución de AngII <ol><li> Tienda liofilizado viales AngII a -20 ° C. Equilibrar viales AngII a RT antes de abrir. </li><li> Pesar la masa AngII calculado (7,3 mg, como se muestra en la Tabla 1) en un tubo de plástico estéril. NOTA: Por Merck Index, no utilice tubos de vidrio para la disolución ya una solución acuosa de angiotensina II tiene una fuerte afinidad por la unión a vidrio. </li><li> Añadir el volumen calculado de solución salina estéril (1.200 μl) en el tubo de plástico que contiene el liofilizado AngII, gorra, y mezclar bien por inversión hasta que la solución es clara. </li><li> Números Label ratón # 1, # 2, # 3 y # 4 en los tubos de plástico estériles individuales con tapas (0,5 - 1,5 ml). Preparar la solución de AngII bajo una campana laminar para cada ratón según el peso corporal, calculado en el paso 1.2 y en la Tabla 1. <ol><li> Por ejemplo, una pipeta 3,6 l de solución salina estéril en el tubo # 1, entonces la solución AngII 296,4 l, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo con suavidad. </li></ol></li><li> Números de la etiqueta del ratón en tubos de plástico con tapas (4 ml, estériles). Estos serán utilizados para la incubación de las bombas como se describe en el Paso 3,13. </li></ol> 3. Relleno bomba osmótica <ol><li> Obtener bombas en dos partes separadas: el cuerpo principal de la bomba y el moderador de flujo (Figura 1). Cada caja tiene 10 cuerpos de bomba y moderadores de flujo que se envuelven individualmente. Anote el número de lote. NOTA: Siempre useguantes porque aceites transferidos desde las manos a la carcasa exterior de bombas afectarán negativamente a la función de bombeo. Use guantes estériles, gasas, tubos, agujas de llenado, y sopesar los barcos para preparar las bombas, para evitar el riesgo de infección del implante. </li><li> Abra sólo el número de cuerpos de bomba y moderadores de flujo necesarios para el estudio, ya que estos no pueden ser almacenados una vez abiertos. Si se necesitan más de 10 bombas, asegúrese de que los números de lote de las bombas son las mismas para un estudio, ya que las bombas de distintos lotes tienen diferente volumen de llenado media y bomba Rate. </li><li> Pesar cada bomba (incluyendo tanto el cuerpo principal y moderador de flujo), y tenga en cuenta el peso de 4 decimales (por ejemplo, 1,1443 g de ratón # 1). Este peso, denominada &quot;bomba de Peso en vacío&quot; en la plantilla (tabla 1), se utilizará para calcular la relación de llenado. </li><li> Coloque la aguja de llenado de la bomba a una jeringa estéril de 1 cc y llenar cuidadosamente la jeringa con solución de Ang II de la forma adecuadatubo de plástico numerada. Es importante evitar que entre aire en la jeringa. </li><li> Eliminar todas las burbujas de aire y cuidadosamente la jeringa mientras la aguja está colocada hacia abajo. Mantenga la aguja / jeringa en esta posición para evitar la introducción de burbujas dentro de la bomba. </li><li> Introduzca suavemente la aguja de llenado en el cuerpo de la bomba. Avanzar en la punta de la aguja dentro de la bomba. No se apoye con la punta de la aguja firmemente en la parte inferior de la bomba. </li><li> Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para llenar la bomba con una solución de Ang II. Una sombra oscura dentro de la bomba indica el nivel de llenado. El volumen de llenado es de aproximadamente 246 l, según las instrucciones. </li><li> Deje de llenar la bomba y retire con cuidado la aguja tan pronto como una gota de fluido se levanta de la bomba. </li><li> Inserte moderador de flujo en la bomba a través del orificio en la parte superior del cuerpo de la bomba hasta que no se ve brecha entre la cabeza del moderador de flujo y la parte superior del cuerpo de la bomba (Figura 1). </li><li> La inserción de moderato en el cuerpo de la bomba conduce a alguna pérdida de líquido de la apertura de la moderador de flujo. Borrar cuidadosamente todo exceso de líquido que podría haber escapado durante la colocación de los moderadores. </li><li> Pesar bomba llena. Anotar el peso bajo &quot;Bomba Peso Lleno&quot; en la plantilla. </li><li> Calcula grado de llenado (%) = (Bomba de Peso &quot;lleno&quot; - &quot;vacío&quot;) x 1.000 / significa llenar el volumen x 100. <ol><li> Calcula Razón de llenado como se indica en la Tabla 1. Idealmente, llenando relación debe ser igual o mayor que 100%. Bomba de llenado si el grado de llenado es &lt;95% (implicando que las burbujas de aire puede estar presente en la bomba). </li></ol></li><li> Coloque la bomba de llenado en el tubo marcado con 4 ml (Paso 2.5), con frente a la cabeza moderador hacia arriba. Añadir un volumen suficiente de solución salina estéril para cubrir la bomba. Mantenga la bomba en el tubo de solución salina hasta la implantación. </li><li> Colocar los tubos en una incubadora a 37 ºC. Incubar las bombas de O / N (por lo menos 12 hr) para permitir el cebado parcial, y luego implantar en ratones. Bombación de Ang II comienza aproximadamente 24 horas después de la implantación, que permite a los ratones para recuperarse de la cirugía antes de cualquier posible estrés que surge durante AngII infusión. </li></ol> 4. Preparación para la implantación de la bomba <ol><li> Autoclave (modo de gravedad, ciclo de secado, 15 min) gasas, torundas de algodón y herramientas quirúrgicas incluyendo tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas, grapas y grapadora al menos 1 día antes de la cirugía. </li><li> En una sala de procedimientos, preparar vaporizador para la anestesia utilizando isoflurano. Abre paños estériles en una campana de flujo laminar, y coloque cono de la nariz para la anestesia isoflurano. Coloque betadine, etanol al 70%, agua estéril, esterilizador de cuentas, preparado de antiséptico, torundas, gasas, y bombas llenas en una campana laminar. </li><li> Don una mascarilla y bata, a continuación, abra una cortina exterior en una campana laminar con las manos limpias. Póngase los guantes estériles y abrir el paquete en el interior estéril. </li></ol> 5. Procedimiento quirúrgico de la implantación de la bomba <ol><li> Coloque el ratón en un cham inducciónber con flujo de entrada de isoflurano a una velocidad de flujo de 1,5 - 2%. Monitorear el ratón durante 2 - 3 minutos después de decúbito. Afeitarse un área aproximadamente del tamaño de un cuarto, sobre el hombro izquierdo o derecho. </li><li> Coloque ratón en una campana laminar, con su nariz a ras con un cono conectado al flujo de salida isoflurano (Figura 2A). Coloque la cabeza del ratón hacia la mano dominante del cirujano. Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Asegúrese de que el ratón no tiene respuesta a la estimulación del dolor antes de la cirugía. Por ejemplo, la respuesta del pedal es un buen indicador para el dolor. </li><li> Swab y limpie zona afeitada con betadine seguido de tres toallitas con etanol al 70%. Don o cambiar los guantes estériles. </li><li> Utilice un bisturí quirúrgico para hacer una incisión ~ 1 cm detrás de la oreja sobre la lámina del hombro de la pata delantera. Esta incisión debe ser perpendicular a la cola. Tenga cuidado de cortar tejidos solamente la piel y no subyacente. </li><li> Hold forceps en una mano para abrir la incisión, y el uso de la otra mano para hacer un túnel subcutáneo debajo de la piel usando una pinza hemostática (Figura 2B). </li><li> Avanzar punta pinza hemostática hacia la cola, y crear un bolsillo para la bomba. Esto se logra abriendo cuidadosamente las mandíbulas de la pinza debajo de la piel para abrir una bolsa. Retirar la pinza de incisión. </li><li> Inserte la bomba dentro de la incisión con la cabeza moderador posicionado en la parte trasera del ratón (Figura 2C). Empuje suavemente la bomba completamente en el bolsillo. Debe haber suficiente espacio libre para cerrar la herida sin tensión o estiramiento de la piel. </li><li> Una vez que una bomba ha sido insertada, apriete firmemente ambos lados de la incisión, enderezar para que los bordes se encuentran, y colocar 1 o 2 clips para cerrar la herida (Figura 2D). Inspeccionar el sitio de la incisión para asegurar que no es el cierre completo de la herida, y que la bomba no está presionando directamente en el sitio. </li><li> Aplicar crema de lidocaína tópica(4% p / p) con un limpio ratón swab.Remove algodón desde el cono de la nariz, y lo coloca en una almohadilla caliente hasta que se recupera la conciencia. Después de recuperarse, el ratón se devuelve a su jaula. </li><li> Coloque los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador de cuentas durante 10 segundos entre los ratones. Dejar enfriar antes de su uso. Guantes limpios con preparado de antiséptico entre los ratones. Controlar todos los ratones hasta que se logra la recuperación completa. </li><li> Supervise de cerca los ratones después de la cirugía. Inyectar un bolo de solución salina estéril (0,2 - 0,3 ml) por vía subcutánea si un ratón muestra signos de sufrimiento, la deshidratación o pérdida de peso aparente. Observar los ratones al menos dos veces al día durante los primeros 10 días, y al menos una vez cada día posteriormente. Realice una necropsia inmediatamente si algún ratones mueren durante AngII infusión. Retire los clips de la herida entre los 7 - 14 días después de la cirugía. </li></ol> 6. La recolección, Reparación, Servicio de limpieza, e Imagen de aortas <ol><li> Cortar abrir el tórax del ratón y cavidades abdominales ventral, corte open aurícula derecha, perfundir con solución salina a través del ventrículo izquierdo del corazón para eliminar la sangre en la aorta, y luego cosechar la aorta 27. </li><li> Coloque aortas recolectadas en tubos de plástico que contienen al menos 3 ml de paraformaldehído al 4% o 10% de formalina tamponada neutra durante 24 - 48 h 27. </li><li> Retire tejidos adventicia cuidado. Aorta Pin en cera negro con alfileres. Adquirir imágenes de la aorta con el mismo aumento. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestra en la Figura 3. </li></ol> 7. En la cara de imagen de aortas <ol><li> Cortar aorta abierta longitudinalmente a través de la curvatura exterior e interior del arco aórtico, y cortar ramas principales abiertas incluyendo innominada, arteria carótida izquierda y la arteria subclavia izquierda. Pin aorta plana con adventicia externa que pone al lado de la cera negro. </li><li> Adquirir imagen en la cara de la superficie de la íntima de la aorta con la misma ampliación. Incluir una regla en cada imagen para la calibración, como se muestran en la Figura 4. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+AT2+receptors+augments+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysms+and+atherosclerosis.">Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis.</a> Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+receptor-associated+protein+attenuates+angiotensin+II-induced+atherosclerosis+in+hypercholesterolemic+mice+without+influencing+abdominal+aortic+aneurysms.">Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms.</a> Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).</li><li>Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording,+a+tail-cuff+method.">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> J Vis Exp. (27), e1291 (2009).</li></ol>

La publicación de este artículo es patrocinado por Alzet.

Las bombas osmóticas entrega de Ang II por vía subcutánea es un método de rutina para la inducción de los aneurismas de aorta en ratones. Basado en datos de muchos laboratorios, ha habido hallazgos consistentes que este es un método fiable y reproducible para estudiar tanto AAAs 3,4 y 22-26 de AAT en ratones. Por lo tanto, este modelo de ratón se considera un modelo que recapitula varias características de los aneurismas aórticos humanos y proporciona una visión mecanicista en estas enfermedades devastadoras. Mientras que el envejecimiento es un factor de riesgo de AAA en los seres humanos, no se ha estudiado sistemáticamente por los AAA inducidos por angiotensina II en ratones. Sin embargo, parece incidencia y la gravedad de los AAA inducidas por AngII son similares en ratones a la edad de 8 - 48 semanas 4,5,7. En la actualidad, sólo hay unos pocos estudios que informaron TAA inducidos por angiotensina II en ratones a la edad de 8 - 24 semanas 22-26, que no presenten diferencias relacionadas con la edad aparente sobre la formación de TAA. Mujeres ratones tienen una incidencia mucho menor de los AAA de ratones machos infundidos con AngII 4,28. También vale la pena señalar que la incidencia de la inducida por Ang II AAA es mucho mayor en hipertensión que los ratones normo-cholesterolemic, que es más del 50% frente a menos del 30%, respectivamente. Además, es frecuente rotura de la aorta (aproximadamente 10 - 30%) tanto en ratones normo e hipercolesterolémicos durante AngII infusión. La infusión de Ang II a una velocidad de 1,000 ng / kg / min en ratones hipercolesterolémicos, tales como el receptor de LDL - / - ratones alimentados con una dieta o apolipoproteína Western (apoE) - / - ratones alimentados con una dieta normal o Western, tiene efectos máximos sobre AAA desarrollo 3,4,29. Esta velocidad de infusión es óptima para un estudio en el que se espera la manipulación de un gen de interés en ratones hipercolesterolémicos para reducir los AAA. Si se espera que una manipulación en ratones hipercolesterolémicos para aumentar AAAs, se recomienda para infundir AngII a una velocidad de 500 ng / kg / min o más baja 30. En contraste con los AAA, no hay ninguna demostraciónasociación nstrated entre el género masculino o la hipercolesterolemia y la inducida por Ang II TAA 25. Sin embargo, de manera similar a los AAA, si se espera que la manipulación de un gen de interés para aumentar la AAT, se recomienda una velocidad de infusión menor que 1000 ng / kg / min para AngII infusión. También es importante saber que la incidencia y la gravedad de los aneurismas aórticos inducida por AngII varían entre los ratones individuales y entre los estudios. Si los ratones no desarrollan aneurismas de aorta, una posibilidad potencial es que Ang II puede que no se han entregado con éxito en ratones. Para la validación de una alta tasa de infusión de Ang II, en kg min, se recomienda como 1000 ng / / medición de la presión arterial antes de, y durante, la infusión de Ang II utilizando un método de cola-brazalete no invasiva 31. AngII infusión a una velocidad de 1,000 ng / kg / min aumenta la presión arterial sistólica en ratones. Además, las concentraciones de renina en plasma se pueden medir durante AngII infusión o en la terminación desde Ang II tiene un voto negativo de rsecreción enin. Por lo tanto, la infusión de AngII conduce a reducciones en las concentraciones de renina en plasma. Si un ratón infundido con Ang II no tiene patologías aparentes aórticas, sin aumento de la presión arterial, y no hay disminución de la concentración de la renina plasmática, que indicaría que Ang II no se ha entregado de manera eficiente a través de la mini-bomba osmótica implantada. Le recomendamos quitar este ratón del estudio. También es importante señalar que algunos ratones no desarrollan aneurismas aórticos pesar del aumento de la presión arterial sistólica y la disminución de las concentraciones plasmáticas de renina. Estos ratones deben permanecer en el estudio. En resumen, AngII infusión se consigue mediante la implantación subcutánea usando bombas osmóticas para inducir aneurismas de la aorta en ratones. Este método ofrece AngII constantemente a una tasa definida para duraciones designadas que se utilizan para estudiar tanto los AAA y TAA.

Los aneurismas aórticos exhiben expansión luminal permanente de la aorta que presagia ruptura y por lo general conduce a la muerte. Esta enfermedad se presenta en las dos regiones de la aorta abdominal y torácica, que se denominan como aneurismas aórticos abdominales (AAA) y aneurismas de aorta torácica (TAA), respectivamente. Debido a una comprensión incompleta de los mecanismos moleculares y procesos fisiopatológicos, no hay ninguna terapia médica probado que puede impedir la expansión o ruptura de cualquiera de los tipos de aneurismas aórticos. Puesto que es difícil de adquirir muestras de pacientes y realizar experimentos en seres humanos directamente, la investigación se centra en la definición de mecanismos de los AAA ha sido extrapolado frecuencia de los modelos animales. Un modelo animal comúnmente usado es la infusión subcutánea de la angiotensina II (AngII) en ratones. En comparación con otros métodos quirúrgicos para inducir AAA en ratones, como la perfusión elastasa intra-aórtica o aplicación peri-aórtica de cloruro de calcio que requieren laparotomía 1,2, esto method no requiere entrada en la cavidad del cuerpo y requiere experiencia quirúrgica mínimo 3,4. Infusión subcutánea de AngII a través de bombas osmóticas para inducir AAAs se informó inicialmente en baja densidad de lipoproteínas receptor (LDL) - / - ratones alimentados con una dieta enriquecida en grasa saturada 3, y posteriormente en apoE - / - ratones alimentados con una dieta normal de laboratorio 4. Muchos estudios recientes también han demostrado que induce AAAs AngII en ratones normolipidémicos 5-7. El enfoque de la infusión de AngII se ha aplicado para inducir los AAA y explorar mecanismos moleculares así como el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales (por ejemplo, 5-15) ya que este modelo recapitula muchas características observadas en los AAA humanos. Por ejemplo, los factores de riesgo de AAA humanos, como el tabaquismo, la edad y el género masculino también aumentan los AAA inducidos por angiotensina II en ratones 16,17. La asociación de hipercolesterolemia con AAA en el ser humano requiere aclaración. Sin embargo, tiene seres coherente que la hipercolesterolemia aumenta AngII inducida AAA en ratones 18. Patologías de los AAA inducidas por AngII en ratones son muy heterogénea y se caracterizan por la infiltración de macrófagos profunda, la degradación del colágeno, la formación trombótica y la resolución, y la neovascularización 19-21. En contraste con la ubicación de aorta infrarrenal más común de los AAA en los seres humanos, AngII inducida en ratones AAAs se producen en la región aórtica suprarrenal. Otra característica ubicua de inducida por Ang II AAA es la ruptura medial transmural, que conduce a la trombosis transmural. No está claro si la ruptura elastina transmural se produce en los seres humanos desde el desarrollo patológico de los AAA en los seres humanos no se ha estudiado exclusivamente debido a la falta de tejidos aneurismáticas de etapas anteriores. AngII infusión en ratones también conduce a la profunda expansión de la región de la aorta torácica, que está restringida principalmente a la aorta ascendente que es la región más común para TAA en los seres humanos <sup&gt; 19,22-26. Similar a los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducida durante AngII infusión también recapitular muchas características de AAT humana 25. Sin embargo, a diferencia de los AAA inducidos por angiotensina II, TAA inducidos por angiotensina II no están asociados con la hipercolesterolemia y no tienen diferencias de género. El objetivo general de la infusión de Ang II subcutánea en ratones es el estudio de las características patológicas y mecanismos moleculares de la AAA y la AAT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="711">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1705</td>
			<td>compound used to induce aortic aneurysms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Osmotic Pumps</td>
			<td>DURECT Corporation</td>
			<td>Alzet Model 2004</td>
			<td>feasible for 28-day infusion in mice weighed &#62; 20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated fat-enriched diet</td>
			<td>Harlan Teklad</td>
			<td>TD.88137</td>
			<td>42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcutaneous angiotensin ii infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Los 4 del receptor de LDL masculina - / - ratones descritos en la sección Protocolo fueron sacrificados después de 4 semanas de AngII infusión. Aortas se recogieron, se limpian, y la imagen para visualizar dilataciones aórticas. Como se muestra en la Figura 3, aortas tienen varias características diferentes, incluyendo la expansión de la región suprarrenal (AAA; Figura 3a), la expansión de la región ascendente (AAT; Figura 3B), o la expansión de ambas regiones (presencia tanto de los AAA y AAT; figura 3C), mientras que la morfología de un ratón fue macroscópicamente normal (Figura 3D). La dilatación de la aorta abdominal se cuantifica midiendo la anchura ex vivo máxima de la región suprarrenal, como se ilustra por la línea roja en la Figura 3A. Para medir la dilatación de la aorta ascendente, aortas fueron cortadas abierto y puestas como se muestra en la Figura 4. Área de superficie de la íntima se midió en la región de la aorta ascendente (área rodeada por The líneas rojas en la figura 4A) para cuantifican TAA. Una regla se incluyó en cada imagen para normalizar las mediciones, como se muestra en ambas figuras 3 y 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" /> . Figura 1. Imagen Representante de bomba osmótica llena Cada bomba contiene dos partes: un cuerpo principal y un moderador de flujo. Después de llenar el cuerpo de la bomba con AngII, el moderador de flujo se inserta para sellar la bomba. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" /> Figura 2. Proceso de la cirugía de implantación de la bomba (A) del ratón se coloca en una campana laminar con un cono de nariz que es continuamente la liberación de isoflurano y oxígeno.; (B) una pinza hemostática recta se inserta en la incisión de la piel para hacer un túnel subcutáneo; (C) de la bomba se inserta a través de la<html> incisión de la piel con suavidad; (D) La incisión de la piel se grapa después de la inserción de la bomba. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" /> Figura 3. imágenes aórtica (ex vivo) de ratones infundidos con AngII AngII 1000 ng / kg / min se infundió en receptor de LDL hombre -. / - Ratones durante 28 días. (A) AAAs acompañada de trombosis; La línea roja (2,05 mm) muestra la medición de la anchura máxima de la aorta en la región suprarrenal. (B) Ascendente dilatación aórtica (TAA) con aorta abdominal macroscópicamente normal; (C) dilataciones profundos tanto en el ascenso y regiones de la aorta suprarrenal (TAA y AAAS); (D) de la aorta macroscópicamente normal sin aparente dilatación del ascendente o región de la aorta suprarrenal. 4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. In caras de las regiones de la aorta torácica de ratones infundidos con AngII AngII 1.000 ng / kg / min se infundió en el receptor de LDL masculina -. / - Ratones durante 28 días. Superficie esbozado por una línea roja representa la región de la aorta ascendente incluyendo parte del arco aórtico. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="2"> Dosis requerida </td><td></td><td> 1000 </td><td colspan="2"> ng / kg / min </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> Comience peso corporal (el más grande del ratón) </td><td> 24.8 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> Ganancia de peso corporal total estimado </td><td> 1 </td><td> g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> Velocidad de bombeo </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> l / h </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="2"> Number de los ratones </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="2"> Dosis por hora para los animales </td><td></td><td> 1518 </td><td> ng </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> Conc necesaria </td><td></td><td></td><td> 6072 </td><td> ng / l </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="2"> Por 300 solución ul </td><td></td><td> 1.82 </td><td colspan="2"> mg / l 300 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> SOLUCIÓN ES NECESARIO </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td colspan="2"> AngII total (mg) </td><td></td><td> 7.3 </td><td> mg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 </td><td colspan="2"> Disuelto en solución salina y# 160; </td><td></td><td> 1200 </td><td> l </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ratón </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de dilución </td><td colspan="2"> Volumen (l) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Relación de Llenado </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Saline </td><td> Vacío </td><td> Lleno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> Factor de dilución = peso corporal del peso del ratón / cuerpo del ratón más grande </td><td></td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ratón </td><td> Peso corporal </td><td> Factor de dilución </td><td colspan="2"> Volumen (l) </td><td colspan="2"> Bomba Peso (g) </td><td> Relación de Llenado </td></tr><tr><td> # </td><td> (g) </td><td></td><td> AngII </td><td> Saline </td><td> Vacío </td><td> Lleno </td><td> (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 24.5 </td><td> 1.0 </td><td> 296.4 </td><td> 3.6 </td><td> 1.1443 </td><td> 1.3877 </td><td> 99 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 23.0 </td><td> 0.9 </td><td> 278.2 </td><td> 21.8 </td><td> 1.1677 </td><td> 1.4145 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 24.8 </td><td> 1.0 </td><td> 300.0 </td><td> 0.0 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 21.8 </td><td> 0.9 </td><td> 263.7 </td><td> 36.3 </td><td> 1.1438 </td><td> 1.3904 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Cálculo de la infusión de 28 días a través de bombas osmóticas.

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Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

La implantación subcutánea de bombas osmóticas proporciona un enfoque conveniente para suministro prolongado y consistente de compuestos. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente para estudiar las dos aneurismas de la aorta abdominal y torácica en ratones.

Subcutánea angiotensina II infusión usando osmótica Bombas Induce aneurismas aórticos en ratones

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

36.7K vistas.  University of Kentucky.  La implantación subcutánea de bombas osmóticas proporciona un enfoque conveniente para suministro prolongado y consistente de compuestos. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente para estudiar las dos aneurismas de la aorta abdominal y torácica en ratones. 

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Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

El trasplante ortotópico aórtica en los ratones para el Estudio de la Enfermedad Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Investigación

Medicina

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound and aortic blood pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is raised then lowered incrementally by intravenous infusion of vasoactive drugs phenylephrine and sodium nitroprusside. Aortic diameter is measured for each pressure step to characterize the pressure-diameter relationship of the ascending aorta. Stiffness indices derived from the pressure-diameter relationship can be calculated from the data collected. Calculation of arterial compliance is described in this protocol.
This technique can be used to investigate mechanisms underlying increased aortic stiffness associated with cardiovascular disease and aging. The technique produces a physiologically relevant measure of stiffness compared to ex vivo approaches because physiological influences on aortic stiffness are incorporated in the measurement. The primary limitation of this technique is the measurement error introduced from the movement of the aorta during the cardiac cycle. This motion can be compensated by adjusting the location of the probe with the aortic movement as well as making multiple measurements of the aortic pressure-diameter relationship and expanding the experimental group size.

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.

Medición ascendente aórtica Rigidez<em&gt; En Vivo</em&gt; En ratones usando ultrasonido

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

La constricción aórtica mínimamente invasiva transversal en ratones

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Un modelo del cerrado-pecho para inducir constricción aórtica transversal en ratones

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...

Improved Registration of 3D CT Angiography with X-ray Fluoroscopy for Image Fusion During Transcatheter Aortic Valve Implantation

The fusion of 3D anatomical models derived from high-fidelity pre-interventional computed tomography angiography (CTA), and x-ray (XR) fluoroscopy to facilitate anatomical guidance is of huge interest for complex cardiac interventions like TAVI procedures with cerebral protection. Co-registration of CTA and XR has been introduced either based on additional intraoperative non-/contrast-enhanced cone-beam computed tomography (CBCT) or two separate aortograms. With the related increase of radiation exposure and/or contrast agent (CA) dose, a potential additional risk for the patient is introduced. Here, we propose a modified co-registration approach making use of arteriograms of the iliofemoral arteries, routinely performed during the femoral puncture and sheath introduction. On-the-fly refinement of the co-registration during the on-going procedure enables accurate co-registration without any additional angiograms, thus reducing CA, XR dose and procedure time, while simultaneously improving operator confidence and procedure safety.

The aim of this study was to improve the co-registration for image fusion (IF) of pre-interventional CT data with real-time x-ray (XR) fluoroscopy during transfemoral transcatheter aortic valve implantation (TAVI).

Mejor registro de 3D CT angiografía con rayos x fluoroscopia para fusión de imágenes durante la implantación de válvula aórtica transcatéter

The fusion of 3D anatomical models derived from high-fidelity pre-interventional computed tomography angiography (CTA), and x-ray (XR) fluoroscopy to ...

Electrocardiogram Recordings in Anesthetized Mice using Lead II

The electrocardiogram is a valuable tool for evaluating the cardiac conduction system. Animal research has helped generate novel genetic and pharmacological information regarding the electrocardiogram. However, making electrocardiogram measurements in small animals in vivo, such as mice, has been challenging. To this end, we used an electrocardiogram recording method in anesthetized mice with many advantages: it is a technically simple procedure, is inexpensive, has short measuring time, and is affordable, even in young mice. Despite the limitations with using anesthesia, comparisons between control and experimental groups can be performed with enhanced sensitivity. We treated mice with agonists and antagonists of the autonomic nervous system to determine the validity of this protocol and compared our results with previous reports. Our ECG protocol detected increased heart rates and QTc intervals on treatment with atropine, decreased heart rates and QTc intervals after carbachol treatment, and higher heart rates and QTc intervals with isoprenaline but did not note any change in ECG parameters on administration of propranolol. These results are supported by previous reports, confirming the reliability of this ECG protocol. Thus, this method can be used as a screening approach to making ECG measurements that otherwise would not be attempted due to high cost and technical difficulties.

We present an ECG protocol that is technically easy, inexpensive, fast, and affordable in small mice, and can be performed with enhanced sensitivity. We suggest this method as a screening approach for studying pharmacological agents, genetic modifications, and disease models in mice.

Grabaciones de electrocardiograma en ratones anestesiados usando plomo II

The electrocardiogram is a valuable tool for evaluating the cardiac conduction system. Animal research has helped generate novel genetic and ...

The Intra-Aortic Balloon Pump

Cardiogenic shock remains one of the most challenging clinical syndromes in modern medicine. Mechanical support is being increasingly used in the management of cardiogenic shock. Intra-aortic balloon pump (IABP) is one of the earliest and most widely used types of mechanical circulatory support. The device acts by external counterpulsation and uses systolic unloading and diastolic augmentation of aortic pressure to improve hemodynamics. Although IABP provides less hemodynamic support when compared with newer mechanical circulatory support devices, it can still be the mechanical support device of choice in appropriate situations because of its relative simplicity of insertion and removal, need for smaller size vascular access and better safety profile. In this review, we discuss the equipment, procedural and technical aspects, hemodynamic effects, indications, evidence, current status and recent advances in the use of IABP in cardiogenic shock.

We describe the steps for the percutaneous implantation of the intra-aortic balloon pump (IABP), a mechanical circulatory support device. It acts by counterpulsation, inflating at the onset of diastole, augmenting diastolic aortic pressure and improving coronary blood flow and systemic perfusion, and deflating before systole, reducing left ventricular afterload.

La bomba de balón intraaórtico

Cardiogenic shock remains one of the most challenging clinical syndromes in modern medicine. Mechanical support is being increasingly used in the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...