The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

NOTA: Este protocolo comienza después de que uno ha aislado mitocondrias de músculo esquelético rojo. Las mitocondrias se aislaron como se ha descrito previamente a partir de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético rojo 13. Entre 5 a 10 mg / l de proteína mitocondrial se logrará de esta cantidad de tejido mediante la resuspensión del sedimento final mitocondrial en ≤ 50 l de tampón de aislamiento de las mitocondrias (IBM) 2 (Ver Frisard et al 13). 1. Configuración <ol><li> Preparar soluciones madre de trabajo (Tabla 1) y solución de ensayo mitocondrial (MAS) mezcla (Tabla 2) para los ensayos posteriores. Nota: La mayor parte de la preparación para los ensayos se puede hacer con antelación ya que la mayoría de las existencias de soluciones y el MAS se pueden almacenar. </li><li> Hidratar un cartucho de ensayo respirométrico en solución de calibración de 1 ml de la noche antes del experimento en una incubadora no CO 2 a 37 ° C. </li><li> El día del experimento, take cabo existencias congeladas (sustratos y moduladores mitocondriales, mezcla MAS, MAS w / o BSA, Tabla 1) y deshielo en 37 ° C baño o incubadora. </li><li> Preparar todas las soluciones de sustrato (Tabla 3) y las inyecciones (Tabla 4-5) y ajustar el pH lo deseas (pH 7,4). Después se ajusta el pH, almacenar en hielo. </li><li> Programa de la multi-máquina y la medición del consumo de oxígeno a la mezcla adecuada, espere, y los parámetros de medición (Ver Tabla 6) y el fondo de la etiqueta y pozos grupo / condición introduciendo primero el software de análisis, seguido por el modo &quot;Normal&quot;. <ol><li> Entra en el foro de &quot;Invitado&quot; y haga clic en el &quot;Asistente de ensayo&quot;. Una vez en el &quot;Asistente de Ensayo&quot;, haga clic en &quot;Protocolo&quot; para cambiar la mezcla, esperar y medir los parámetros. Etiquetar los pozos de fondo bajo el &quot;Back. Corrección &quot;ficha y asegúrese de seleccionar&quot; Hacer la corrección de fondo &quot;. </li><li> Cond Etiquetaitions por primera clic en la pestaña &quot;Grupos y etiquetas&quot;, seguido de la pestaña &quot;Información de Grupo&quot;. Después se introducen estos parámetros, haga clic en &quot;Finalizar&quot;, seguido de &quot;Guardar plantilla&quot;. </li></ol></li></ol> 2. El ensayo Run <ol><li> Cargue las soluciones de inyección en un cartucho se realiza la prueba y comenzar la calibración introduciendo primero el software de análisis, seguido de entrar en el modo &quot;Normal&quot;. Entra en el foro de &quot;Invitado&quot;. Abra la plantilla guardada en el paso 1.5 en virtud de la unidad &quot;XF&quot;, en la pestaña &quot;Plantillas&quot;. Una vez abierto, haga clic en &quot;Inicio&quot; para iniciar la calibración. Nota: El cartucho se realiza la prueba se debe introducir en la máquina con la esquina cortada en la parte inferior izquierda. Esto tarda aproximadamente 30 min. Tenga cuidado para inyectar las soluciones en los puertos adecuados. Las inyecciones de la Tabla 4-5 se enumeran en el orden de carga. </li><li> Suavemente, pero mezclar bien la mitochondria de stock por agitación de la solución con una punta de pipeta 200 l, seguido por trituración con suavidad la culata con una punta de pipeta 200 l que ha tenido su orificio ensanchado mediante el corte ~ 3 mm del extremo de la punta con unas tijeras. </li><li> Realizar un ácido bicinconínico (BCA) de ensayo para determinar la concentración de proteína de la población mitocondrial. </li><li> Usando la concentración acciones adquiridas desde el paso 2.3, resuspender 10 g de proteína mitocondrial / 200 l de la mezcla de sustrato succinato / rotenona (Tabla 3). Resuspender 14 g de proteína mitocondrial / 200 l de las mezclas de sustratos restantes (esto debe hacerse para cada mezcla de sustrato) (Tabla 3). Coloque todos mitocondrial proteína / sustrato se mezcla en hielo. Nota: La cantidad óptima de proteína mitocondrial por pocillo para cada ensayo se determinó como se ha descrito previamente 9. Se determinó que el piruvato / malato, carnitina palmitoil / malato, glutamato / malato unad ensayos de flujo de electrones utiliza 3,5 g de proteína mitocondrial, mientras que el ensayo de succinato / rotenona utiliza 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo. Por lo tanto, el investigador necesita para volver a suspender suficiente proteína mitocondrial de 4 repeticiones en este paso, ya sea 2,5 mg o 3,5 mg por 50 l se carga por pozo (Ver el paso 2.6). </li><li> Mezclar las soluciones mitocondrias / sustrato suavemente, pero a fondo por agitación de la solución con una punta de pipeta 200 l, seguido por trituración con suavidad la culata con una punta de pipeta 200 l que ha tenido ~ 3 mm de su extremo cortado. </li><li> Colocar una placa de cultivo de células en hielo y por triplicado, carga de 50 l / pocillo de cada una de las mezclas mitocondrias / sustrato. Los desarrolladores de la respirométrico ensayo basado en una microplaca recomiendan dejar un mínimo de dos (no hay mitocondrias) pocillos de blanco, preferiblemente a ambos lados en la placa de cultivo celular. </li><li> Haga girar la placa de cultivo celular a 2000 g durante 20 min a 4 ° C. Mientras que la placa es sfijando, calentar las soluciones de sustrato en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Después de la vuelta es completa, cargar cuidadosamente 450 l de cada solución de sustrato en la parte superior de sus respectivos pozos (es decir, cargar el piruvato / sustrato malato a los pozos que tienen mitocondrias inicialmente resuspendidos en esta solución de sustrato). Asegúrese de cargar la placa a temperatura ambiente. Nota: Los pozos en blanco deben ser cargados con 500 l de sustrato. Pozos en blanco designados para el ensayo de flujo de electrones se deben cargar con el sustrato flujo de electrones (piruvato / Malate + FCCP), mientras que los pocillos de blanco ensayo acoplado se pueden cargar con cualquier sustrato de ensayo de acoplamiento. Nota: Si la realización de los ensayos de flujo acoplados y electrones en el mismo plato, el investigador debe reasignar pozos de fondo para los ensayos respectivos después de la carrera de ensayo se completa con la plataforma &quot;XF Reader&quot; a través de la pestaña &quot;Instrumento&quot;. Una vez dentro de la configuración de &quot;instrumento&quot;, haga clic en la &quot;Administración&quot;ficha, seguido de &quot;Corrección de fondo&quot;. Haga clic en &quot;Finalizar Modo Configuración del instrumento&quot; cuando haya terminado. Esto se debe a la combinación de ascorbato / TMPD puede consumir O 2, por lo tanto se necesita una corrección de fondo separada para cada tipo de ensayo. </li><li> Después de la 450 l de sustrato se añadió a cada pocillo, ver la capa de las mitocondrias en el pozo para asegurar que las mitocondrias se dispersan uniformemente en una sola monocapa (magnificación 20X [Ver Rogers 9, Figura 4]). Wells que no parecen tener una monocapa uniformemente distribuida se pueden quitar post hoc. </li><li> Después de comprobar la adherencia mitocondrial, inserte la microplaca en el instrumento de ensayo respirométrico e iniciar el ensayo de ejecutar haciendo clic en &quot;Aceptar&quot;. Nota: La calibración del paso 2.1 debe ser completa antes de que comience la carrera. Una vez que el investigador hace clic en &quot;Aceptar&quot;, la máquina se puede extraer la placa de la utilidad que se utilizó para la calibración. <ol> &lt;li&gt; Retire la placa de utilidad y coloque la placa de cultivo celular que contiene la mitocondria en la bandeja. La muesca azul en la placa de cultivo celular debe ser colocado en la esquina inferior izquierda de la bandeja. Haga clic en &quot;continuar&quot; para iniciar el proceso de la prueba. </li></ol></li><li> Después de la carrera se ha completado, saque la placa de cultivo celular y el cartucho con la tecla &quot;Eject&quot; en la pantalla. <ol><li> Una vez que la placa se expulsa, retire y deseche la placa de cultivo celular y el cartucho y haga clic en &quot;Continuar&quot; en la pantalla. La carrera se guardará automáticamente como un archivo .xls en el archivo de &quot;datos&quot;. </li></ol></li><li> Abra este archivo y cambiar la pantalla de &quot;O2&quot; a &quot;OCR&quot; pulsando la flecha hacia abajo en el marco del &quot;Y1:&quot; marcador. <ol><li> Siguiente cambio &quot;medio punto&quot; a &quot;Point-to-Point tarifas&quot; bajo la &quot;Velocidad de datos muestran como:&quot; opción. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; para aplicar estos cambios. </li></ol&gt; </li><li> Haga clic en la ficha &quot;Modo Grupo Bueno&quot; en la parte inferior izquierda de la pantalla para pozos grupo de condiciones similares juntos. Por último, haga clic en el &quot;/ muestra La media estándar de error&quot; pestaña hacia el centro de la pantalla, a la izquierda. Alternativamente, estos comandos se pueden configurar antes del ensayo comienza en el ajuste &quot;Asistente de ensayo&quot;. Nota: Cada estado tendrá una media ± desviación estándar se muestra para cada clase y cada condición. Hay mediciones de la frecuencia tomadas por condición (estado 2 [acoplamiento] / State3u [flujo de electrones] la respiración seguido de cuatro inyecciones). Utilice la media de la tasa de Estado 2 de la segunda medición, determinar Estado 4o en el punto mínimo después oligomicina inyección, utilice el punto máximo de Estado 3 y 3u Estado después de ADP y la inyección FCCP, respectivamente, y utilizar el punto mínimo de la antimicina A la respiración inducida para los ensayos de acoplamiento. Utilice el punto máximo de piruvato / inducida malato Estado respiración 3u, utilice el mínimopunto por rotenona inducida respiración, utilice el punto máximo para inducida succinato 3u Estado respiración, y utilizar el punto mínimo de antimicina A la respiración inducida por el ensayo de flujo de electrones. Todos los experimentos se realizaron 3 veces y los datos que se muestran son los resultados de un trazado representativo. </li></ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle.">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li><li>Chance, B., Williams, G. 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George W. Rogers es un empleado del Seahorse Bioscience que fabrica el instrumento para el que se han desarrollado estos ensayos.

Los métodos presentados en este artículo ofrecen paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando mitocondrias aisladas 75-100 mg de músculo esquelético del ratón. Estos ensayos pueden realizarse con alta precisión como se evidencia por la desviación estándar hermético entre pocillos por triplicado. Es importante destacar que estos ensayos respirométricos permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en el ETC, ciclo de Krebs, vía β-oxidación, transportadores de sustratos, etc., en un modelo animal de uso común. Es importante destacar la justificación del uso de diversos combustibles y los inhibidores utilizados en este protocolo. El piruvato / malato y ensayos respirométricos malato de glutamato / permiten la evaluación del complejo I mediada por la respiración, así como la evaluación de sus respectivos transportadores, y en el caso de glutamato, la desaminasa 15. Alternativamente, la combinación desuccinato / rotenona permite la evaluación de flujo respiratoria mitocondrial a través de Complejo II de la ETC desde rotenona inhibe el complejo I y succinato proporciona electrones al complejo II a través de la reducción de dinucleótido de flavina adenina (FADH 2) 15. Estos ensayos proporcionan información específica sustrato como a la eficiencia de acoplamiento y la respiración máxima. El ensayo de flujo de electrones es único en que la combinación de sustratos e inhibidores permite la evaluación de múltiples complejos durante el flujo respiratoria mitocondrial 9. La mezcla de sustrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite la evaluación de la respiración máxima impulsada por el Complejo I, mientras que la inyección de la rotenona seguido de succinato permite la respiración máxima evaluación impulsado por Complejo II. La inyección de antimicina A, un inhibidor del complejo III, seguido por la inyección de ascorbato / TMPD permite la para la evaluación de la respiración impulsado por Complejo IV ya que el ascorbato / TMPD es unadonador de electrones al citocromo C / Complejo IV. Si bien no se obtiene información sobre la eficiencia de acoplamiento, el método es ideal para muy pequeños tamaños de muestra que impiden la ejecución de múltiples sustratos de forma independiente. Finalmente, el uso de carnitina palmitoil / malato permite la evaluación de la coordinación entre la β-oxidación y el ETC desde el equivalente reducir producido a partir de la oxidación del ácido palmítico (β-oxidación) se introduce en la ETC a través de la electrónica de la transferencia de flavoproteína 15. Cabe señalar que los ensayos de flujo de acoplamiento y el electrón también se podrían usar en tándem para identificar los cambios en la función mitocondrial debido a algún tipo de intervención (tratamiento de drogas, la manipulación genética). La alta precisión alcanzadas para estos ensayos se debe principalmente a una mezcla completa de las mitocondrias, ya sea antes de la determinación de proteínas, o con las soluciones de sustrato. En este sentido, una vez que las mitocondrias se resuspendend en el solutio sustratons, es fundamental para mezclar esta solución a fondo antes de cargar la placa de cultivo celular como se describe en el paso 2.2 con una punta de pipeta de orificio ensanchado. El no mezclar las mitocondrias bien dará lugar a una gran variación dentro del ensayo. Además, el uso de una punta de pipeta orificio estrecho creará fuerzas de cizallamiento mientras se mezcla la mitocondria y aumenta el potencial de dañar las membranas mitocondriales y la liberación de citocromo C. El paso de la adhesión (2.7) es también un paso crítico en este protocolo. El fracaso para hacer girar la placa cargada de cultivo celular a largo / suficientemente rápido dará lugar a la adhesión incompleta de la mitocondria al pozo, lo que conduce la mayor variabilidad entre los pozos y mediciones. El protocolo descrito ha sido optimizado para incluir: cargar una cantidad óptima de proteína mitocondrial por pozo, utilizando las concentraciones / métodos de preparación adecuados para hacer soluciones madre y del sustrato, alterando el proceso de la prueba para asegurar pla estado mitocondrialteaus, y la mezcla adecuada de las acciones y mitocondrial / sustrato mezclas mitocondriales. Antes de estos esfuerzos de optimización, los autores encontraron con dificultades en el proceso de la prueba. A continuación se analizan los métodos de solución de problemas / modificaciones que fueron útiles en la optimización de este protocolo. Con respecto a la carga óptima, carga demasiado pequeñas mitocondrias no obtener una respuesta robusta, al cargar demasiado las mitocondrias, se agotará la de oxígeno dentro de la microcámara y dar lugar a mediciones inexactas. Rogers et al 9 proporciona ejemplos de la determinación de las cantidades de carga óptimos de mitocondrias por pocillo para ensayos respirométricos basado en una microplaca. Más a menudo, demasiado mitocondrias se carga por pozo como lo demuestra el estado 2 tasas de más de 100 a 200 pmol / min / pocillo y el estado 3 tarifas&gt; 1500 pmol / min / pocillo. Si se produce más de carga, lleve a cabo un experimento con diferentes concentración de proteína mitocondrial (por ejemplo, entre 1 -. 10 g) para obtener OCRs dentro del r dinámicaange de la máquina de medición del consumo de oxígeno. Preparación y las concentraciones correctas de sustratos y acciones es de suma importancia. Utilice siempre una forma ácida de sustratos / inyecciones y ajustar el pH con hidróxido de potasio o HCl; / No se recomiendan los buffers de sodio soluciones. Además, los sustratos resuspender / existencias en DMSO o etanol al 100% resultará en el fracaso de medición o error. Asegúrese de utilizar etanol al 95% cuando se indique. Es común que la carnitina palmitoil para precipitar fuera del etanol al 95% después de descongelar la madre congelado, causando así una gran variabilidad. Asegúrese de calentar el stock de carnitina palmitoil y agitar bien antes de usar. Además, un resultado del ensayo altamente variable piruvato / malato puede ser debido a la piruvato Stock ser&gt; 2 semanas de edad. Asegúrese de rehacer alícuotas congeladas de piruvato cada 2 semanas. El proceso de la prueba fue modificado para mediciones de 2 min para asegurar mesetas estatales mitocondriales. Si se desea la observación del agotamiento de ADP, el investigador puedeextender el tiempo de medición en la pestaña &quot;Protocolo&quot; en el marco del foro &quot;Asistente de ensayo&quot;. Por último, una gran variabilidad se produce cuando las soluciones de la Bolsa y las mitocondrias mitocondrial además de sustrato no se homogeneizan completamente antes de la carga. Si la variabilidad entre los pozos es alta después de que el proceso de la prueba, asegúrese de mezclar completamente la solución de sustrato antes de la siguiente experimento. Nunca vórtice las soluciones mitocondrias / sustrato, y no agitar, puré, y se tritura suavemente con una punta de pipeta de orificio ensanchado. Hay algunas limitaciones de esta técnica que vale la pena destacar. En primer lugar, el número de pocillos en la placa de cultivo celular utilizado para estos ensayos es relativamente bajo (es decir., 24 pozos y al menos 2 designado para pozos en blanco). Si se desea llevar a cabo todos los 5 de estos ensayos en un plato, el investigador sólo es capaz de examinar las respuestas de un ratón a la vez. Sin embargo, cabe señalar que el 96 instrumentos así están disponibles para higher rendimiento. En segundo lugar, hay fortalezas y debilidades inherentes en la evaluación de la disfunción mitocondrial en las mitocondrias aisladas en comparación con 1 en células intactas. Algunas debilidades incluyen tener relevancia fisiológica menos en comparación con las células intactas y que inducen artefactos del proceso de aislamiento. Por último, el éxito de este método depende de la calidad del proceso de aislamiento mitocondrial. Aunque algunos de estos ensayos se han desarrollado ya sea en diferentes sistemas o han sido validados en otros modelos animales, los métodos presentados en este documento son la primera para sintetizar todos los ensayos mencionados anteriormente para el uso óptimo en una de múltiples pocillos máquina de medición del consumo de oxígeno a través del ratón músculo esquelético. Es importante destacar que todos los 5 de estos ensayos se pueden realizar con la cantidad de mitocondrias aisladas de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético de ratón, proporcionando así un alto rendimiento con un material mínimo. De gran importancia, la capacidad de los múltiples pocillostecnologías de consumo de oxígeno para llevar a cabo ensayos con cantidades mínimas de las mitocondrias, en combinación con un método de aislamiento optimizado, permite al investigador para llevar a cabo una multitud de otros experimentos con el resto del tejido de músculo esquelético (por ejemplo., transferencias de Western, RT-PCR, ensayos enzimáticos, etc.), que es a menudo una lucha con este modelo animal. En conclusión, los métodos presentados en este documento proporcionan paso a paso las instrucciones para la realización de una colección de microplacas basado en ensayos respirométricos utilizando cantidades mínimas de músculo esquelético del ratón. Es importante destacar que los métodos presentados requieren cantidades mínimas de tejido y las mitocondrias. Una vez dominado, las técnicas descritas en este documento permitirá a los investigadores determinar un mecanismo potencial de un producto compuesto o de genes en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal de uso común.

La principal función fisiológica de las mitocondrias del músculo esquelético es producir ATP a partir de la fosforilación oxidativa 1. Es importante destacar que las mitocondrias del músculo esquelético juegan un papel específico en la capacidad de ejercicio 2, diabetes 5 3, 4 y enfermedad degenerativa de tipo II de envejecimiento. Como una sociedad que envejece, y la diabetes tipo II es la 7ª causa de muerte en los Estados Unidos 6, la necesidad de métodos que evalúan la función mitocondrial se ha convertido cada vez más frecuente en la investigación biomédica 7,8. Específicamente, la medición del consumo de oxígeno tiene utilidad excepcional en la evaluación de la función mitocondrial, ya que representa la función coordinada entre los genomas mitocondriales y nucleares para expresar los componentes funcionales de la fosforilación oxidativa 9. Varias tecnologías existen que permiten la medición del consumo de oxígeno en las células intactas y aísland mitocondrias 7-10. Además, los ensayos han sido desarrollados para múltiples tipos de células y tejidos, y en una variedad de especies que permiten la medición de las vías respiratorias mitocondriales y de control 9,11,12. Sin embargo, en la actualidad existe un vacío en la literatura en cuanto a la recopilación de todos estos ensayos usando mitocondrias aisladas de músculo esquelético de ratón para el uso de las tecnologías de consumo de oxígeno basado en una microplaca. Es importante destacar que el uso de ensayos respirométricos microplacas basado está creciendo entre los biólogos mitocondriales y permite mediciones de alto rendimiento utilizando cantidades mínimas de mitocondrias aisladas 9. Por lo tanto, una colección de ensayos respirométricos microplacas basado fueron desarrolladas que permiten la localización de dónde anomalías y / o adaptaciones pueden estar ocurriendo en la cadena de transporte de electrones (ETC). Además, dos ensayos respirométricos basados ​​microplaca adicionales fueron desarrolladas que permiten la evaluación de la coordinación between el ácido (TCA) ciclo tricarboxílico y el ETC, y entre ß-oxidación y la ETC. Es importante destacar que los métodos presentados proporcionan una manera clara y concisa para medir los cambios mecánicos en la función mitocondrial en un modelo animal de uso común.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

La Figura 1 representa las tasas de consumo de oxígeno (OCR) para el piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, y los ensayos de malato de glutamato / (acoplamiento ensayos). Estos trazados de ensayo se muestran como consumo de oxígeno Rate, o OCR, en función del tiempo, se correceted fondo, y se muestran como las tasas de punto a punto. Cada panel representa el consumo de oxígeno en diferentes estados mitocondriales como se describe por casualidad y Williams 14. El primer panel representa el consumo basal de oxígeno, o del Estado 2. El segundo panel, después de la inyección de ADP, representa el máximo junto respiración, o el Estado 3. El tercer panel, después de la inyección de oligomicina A (un inhibidor del complejo V), representa la respiración debido a fugas de protones, o Estado 4o. El cuarto panel, después de la inyección de FCCP, representa el máximo de respiración desacoplado o 3u Estado. Finalmente, el quinto panel, después de la inyección de antimicina A, representa la inhibición de la respiración oxidativa. En particular, all estados mitocondriales tienen desviación estándar mínimo. Esto es debido a una mezcla completa de la población mitocondrial y las mezclas de las mitocondrias / sustrato, y el logro de una sola monocapa de las mitocondrias después de la adhesión de centrifugado (Paso 2.6). Por otra parte, la carga de las mitocondrias desiguales en cada pocillo y no alcanzar una sola monocapa de las mitocondrias en el pozo de la microplaca conduce a una mayor desviación estándar en cada estado tal como se muestra en la Figura 2. Los trazados en la Figura 1 pantalla mesetas para cada estado mitocondrial y para cada sustrato. La meseta alcanzado después de dos ciclos de medición sugiere buena calidad mitocondrial y que las mitocondrias permanecen adheridas al pozo durante toda la duración del ensayo. Además, el logro de tasas máximas plateaued puede ser más deseable ya que esto permite al investigador para tomar el promedio de OCR en estos estados mitocondriales, reduciendo así el sesgo que pueda ocurrirseleccionando arbitrariamente un punto. La cantidad de mitocondrias por pocillo se determinó mediante ensayos de optimización. La cantidad óptima de las mitocondrias por pocillo debe resultar en el estado 2 tasas entre de 100-200 pmol / min / pocillo y estatales 3 Tasas &lt;1.500 pmol / min / pocillo, ya que estos valores están dentro del rango dinámico del oxígeno de múltiples pocillos de detección de oxígeno el consumo de la máquina de medición. Cargando demasiada proteína mitocondrial por pocillo puede resultar en OCRs más allá del rango dinámico del instrumento (Figura 3A). La Figura 3 representa la carga de 3,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo azul) en comparación con la carga 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rojo rastreo) para el ensayo de succinato / rotenona. Cargando demasiada proteína mitocondrial por pozo también puede conducir al agotamiento de oxígeno dentro de la microcámara del pozo, evitando así la medición exacta de OCR para cada medición sucesiva 9 (Figura 3B &lt;/ strong&gt;). Punto a punto de OCR es la tasa instantánea de cambio de la OCR. Si plana, el OCR es estable / estable, pero si disminuye, entonces no puede ser un problema biológico o técnico. El fuerte descenso de OCR en el estado 3 y la respiración 3u Estado (Figura 3A) es causada por las mitocondrias agotar el suministro de oxígeno antes de la final de la medición (Figura 3B). La Figura 4 representa OCR frente al tiempo para el ensayo de flujo de electrones. El trazado se corrige y se muestra como se describe para la Figura 1. El primer panel en este ensayo representa la respiración 3u Estado el piruvato / malato mediante I. Complejo El segundo panel, después de la inyección de la rotenona, representa la inhibición del complejo I de la respiración mediada. El tercer panel, después de la inyección de succinato, representa sustrato estimulado 3u Estado con electrones de entrar en la ETC en el Complejo II (Complejo II respiración mediada). El cuarto panel, después de la inyección de Antimycin A, representa la inhibición del complejo III y la respiración tanto totales. Por último, el quinto panel, después de la inyección de ascorbato / TMPD, representa Complejo IV respiración mediada. Similar a los trazados en la Figura 1, todos los estados mitocondriales tener desviación estándar mínima, y cada tasa tiene o casi ha alcanzado una meseta. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Figura 1. Ensayos de acoplamiento. (A) 10 mM piruvato malato / 5 mM, (B) succinato 10 mM / 2 mM rotenona, (C) 40 M palmitoil carnitina / malato de 1 mM, y (D) 10 mM de glutamato / 10 mM malato acoplado mitocondriales trazados de ensayo de respiración tal como se determina mediante la medición de múltiples pocillos de consumo de oxígeno. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg para todos los ensayos, excepto succinato / rotenona, que utiliza 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = piruvato; SUCC = succinato; ROT = rotenona; PAL-C = carnitina palmitoil; GLUT = glutamato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Figura 2. altamente variable piruvato / Malate Ensayo. 10 mM de piruvato 5 mM / malato ensayo Muy variable causada por la mezcla de forma incompleta las mitocondrias de las existencias mitocondrial en el sustrato / mezcla MAS, lo que conduce a pro mitocondrial variable deproteína de carga en cada pocillo. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = piruvato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Figura 3. La sobrecarga mitocondrial de proteínas para el / Ensayo rotenona succinato. (A) las tasas de consumo de oxígeno fuera de la gama dinámica de la máquina de medición del consumo de oxígeno de múltiples pocillos causada por la carga de 3,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo azul) en comparación con la carga 2,5 g de proteína mitocondrial por pocillo (rastreo rojo). (B ) BueyyGen tensión cercanos a cero después de ADP y las inyecciones FCCP causados ​​por la carga de proteína mitocondrial excesivo (3,5 mg) por pocillo (trazo azul) en comparación con la carga de una cantidad óptima (2,5 g) de proteína mitocondrial por pozo (trazo rojo). Los datos representan n = 3 repeticiones biológica emparejadas por cantidad de proteína mitocondrial. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = Carbonyl cianuro 4 - (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Anti-A = antimicina A; SUCC = succinato; ROT = rotenona; O 2 = oxígeno; mm Hg = milímetros de mercurio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Figura 4. Ensayo de flujo de electrones. 5 mM piruvato / 1 mM malato + 4 M FCCP, electrón fbajo mitocondrial trazado ensayo de respiración según lo determinado por la medición de múltiples pozos de consumo de oxígeno. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Proteína mitocondrial cargado por pozo fue de 3,5 mg. Los datos representan n = 3 repeticiones biológicos vinculados. OCR Velocidad = consumo de oxígeno; Anti-A = antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametil- p-fenilendiamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Stock Concentración </td><td> MW </td><td> Volumen final </td><td> Misa Agregado </td><td> Comentarios / Descripción </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (go ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml de 1M Tris Base </td><td> 3.801 g </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238.3 </td><td> 250 ml de DiH 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl2, hexahidratado </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml de DiH 2 O </td><td> 50,82 g </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Piruvato pH 7,4 </td><td> 0.1 </td><td> 88.06 (Viene como una solución de 14,11 M) </td><td> 40 ml de DiH 2 O </td><td> 0,283 ml de ácido pirúvico </td><td> Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C, hace fresco cada dos semanas </td></tr><tr><td> Succinato pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 118.09 </td><td> 100 ml de DiH 2 O </td><td> 9,4 g de Doácido ccinic </td><td> Hacer alícuotas de 1 ml y se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> Malate, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134.09 </td><td> 100 ml de 95% de etanol </td><td> 6,7 g de ácido málico </td><td> Hacer alícuotas de 200 ly se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0.01 </td><td> 164.25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Hacer 300 alícuotas y almacenar a -20 ° C; Mezclar con una cantidad equimolar de ascorbato para mantener TMPD reducida </td></tr><tr><td> Cloruro de palmitoil L-carnitina </td><td> 0.01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml de 95% de etanol </td><td> 0,005 g </td><td> Hacer 40 alícuotas y se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> Oligomicina A </td><td> 0,006 </td><td> 791.06 </td><td> 0,987 ml de 95% de etanol </td><td> 0,005 g </td><td> Hacer 20 alícuotas y se almacena a -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0.01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml de 95% de etanol </td><td> 0,01 g </td><td> Hacer 40 alícuotas y se almacena a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenona </td><td> 0,001 </td><td> 394.4 </td><td> 10 ml de 95% de etanol </td><td> 0,0039 g </td><td> Conservar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9.12 ml de 95% de etanol </td><td> 0.025 g </td><td> Conservar a -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0.5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml de DiH 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Conservar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ácido málico, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134.09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Hacer alícuotas de 200 ly se almacena a -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabla 1. Imagenes Soluciones <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reactivo </td><td> Stock Concentración </td><td> Misa Agregado </td><td rowspan="2"> Molaridad final / Porcentaje </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (go ml) </td></tr><tr><td> La sacarosa </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> - </td><td> 20,04 g </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2, hexahidratado </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Esencialmente Fatty Acid Free-BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0,20% </td></tr></tbody></table> . Tabla 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: alícuotas de 25 ml y se almacena a -20 ºC * Nota: Excluir BSA para la mezcla MAS utilizado para las inyecciones de ensayo. <table border="0"><tbody><tr><td> Sustrato Medio </td><td> Concentración final </td><td> Cantidad de acciones (l) </td><td> Monto del MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Piruvato / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Piruvato: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / rotenona </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 M </td><td> Succinato: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenona 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Piruvato / Malato + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4 mM </td><td> Piruvato: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malate: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoil L-carnitina / Malate </td><td> 40 mM / 1 mM </td><td> Palmitoilcarnitina: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> El glutamato / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> El glutamato: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malate: 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Soluciones por sustrato pH 7.4: Hacer fresca del día del experimento. * Solución de ensayo de flujo de electrones. <table border="0"><tbody><tr><td> Medio de inyección </td><td> Concentración </td><td> Cantidad de acciones (l) </td> &lt;td&gt; Cantidad de MAS (ml) </td><td> Cantidad inyectada en el cartucho </td><td> Concentración final </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Después se inyecta en la placa) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 l </td><td> 3 </td><td> 50 l </td><td> 5.0 mM </td></tr><tr><td> Oligomicina A </td><td> 20 M </td><td> 10 l </td><td> 3 </td><td> 55 l </td><td> 2.0 M </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 M </td><td> 12 l </td><td> 3 </td><td> 60 l </td><td> 4.0 M </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 M </td><td> 24 l </td><td> 3 </td><td> 65 l </td><td> 4.0 M </td></tr></tbody></table> Tcapaces 4. Las inyecciones para ensayos acoplados pH 7,4:. Hacer fresco el día del experimento. * Ensayos de acoplamiento incluyen (pero no se limitan a) piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, y glutamato / malato. <table border="0"><tbody><tr><td> Medio de inyección </td><td> Concentración </td><td> Cantidad de acciones (go ul) </td><td> Monto del MAS (ml) </td><td> Cantidad inyectada en el cartucho </td><td> Concentración final (después de inyectada en la placa) </td></tr><tr><td> Rotenona </td><td> 20 M </td><td> 60 l </td><td> 3 </td><td> 50 l </td><td> 2.0 M </td></tr><tr><td> Succinato </td><td> 50 mM </td><td> 300 l </td><td> 3 </td><td> 55 l </td><td> 5.0 mM </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 M </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 l </td><td> 4.0 M </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 l </td><td> 3 </td><td> 65 l </td><td> 100 mM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbato: 0.059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 5. Las inyecciones para Electron ensayo de flujo pH 7,4:. Haga fresco el día del experimento <table border="0"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tiempo (min) </td><td> # De ciclos </td></tr><tr><td> Calibre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> espera </td><td> 10 min (para permitir que la placa se caliente desde el paso adherencia) </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Yoasure </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> Inyectar A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> La medida </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> Inyectar B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> La medida </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> Inyectar C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> La medida </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> Inyectar D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> La medida </td><td> 2 minutos </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Protocolo Run Instrument.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K vistas.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Aislamiento de Pericitos Tipo I y Tipo II de Músculos Esqueléticos de Ratón

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Difracción de rayos X del músculo esquelético murino intacto como herramienta para el estudio de la base estructural de la enfermedad muscular

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...