We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

NOTA: El protocolo descrito fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Wake Forest School de Medicina. Se obtuvo el consentimiento por escrito. Todos los participantes eran adultos mayores sanos (65-79 años), de ambos sexos, con un IMC que van desde 23 hasta 35. 1. esquelético biopsia muscular <ol><li> Como se describió anteriormente, 9 realizan todas las biopsias en la madrugada después de una O / N rápido. Pregunte a los sujetos a que se abstengan de tomar aspirina, medicamentos recetados y de venta libre los medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos, u otros compuestos que pueden afectar el sangrado, las plaquetas, o moretones en la semana antes de la biopsia. Pida a los participantes que se abstengan también de cualquier actividad vigorosa durante al menos 36 horas antes de la biopsia. NOTA: El músculo se obtiene a partir del vasto externo utilizando la técnica de la biopsia percutánea con aguja con una aguja percutánea bajo anestesia local con lidocaína al 1%. No hay complicaciones médicas o oTher informaron eventos adversos de este procedimiento han ocurrido en nuestra unidad de investigación clínica. </li><li> NOTA: El procedimiento de biopsia descrito es una adaptación de la de Bergstrom 10. <ol><li> En pocas palabras, administrar localmente 1% toma lidocaína cuidado de no infiltrar el músculo. Siga esto con un período de espera de 10 minutos para permitir suficiente entumecimiento. </li><li> Tome las biopsias del vientre del músculo (la región media del músculo entre la inserción y origen) evitando las zonas subfasciales y myotendonous. <ol><li> Utilice la aguja percutánea (un dispositivo de aspiración asistida reutilizable con un lado de la ventana y el cilindro de corte interior de corte) y seguir una fascial &quot;pop&quot; o la resistencia de la fascia como una guía. </li><li> Estimar la profundidad con la aguja de anestesia, de nuevo sentirlo con la hoja de bisturí angosto y hacer una incisión de 4-5 mm a través de la fascia. Avanzar la aguja a través de la incisión hasta que se inserta en el músculo. </li><li> Recogermúltiples muestras con la ventana convirtieron en diferentes direcciones. Aplicar succión continua usando una jeringa de 60 cc, mientras que el avance y la retirada de muestras de músculo en la aguja percutánea dos a cuatro veces en diferentes direcciones. Suspenda la succión y quitar la aguja. NOTA: Cada pasada (inserción y extracción de la aguja) deben tener menos de un minuto. </li><li> ¿Tienes una asistente aplicar una presión firme para perforar sitio durante 5 min para establecer la hemostasia. Desconecte la aguja de la tubería de succión y retirar con cuidado las muestras de músculo de la ventana y el barril. </li></ol></li><li> Hacer una segunda pasada si se necesita más músculo repitiendo el procedimiento anterior. </li><li> Retire cualquier coágulos sanguíneos visibles desde la muestra de músculo con fórceps, pese la muestra, e inmediatamente colocar en un tubo que contiene DPBS heladas. NOTA: El rendimiento promedio utilizando esta metodología es de 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento mitocondrial &lt;ol&gt; <li> Recién preparar el Chappel-Perry (CP) y mitocondrial solución de ensayo (MAS) tampones (Tabla 1) en el día del experimento, o alícuota y almacenar a -20 ° C. Preparar los compuestos en dimetilsulfóxido a una concentración de 2,5 mM y alícuota y almacenar a -20 ° C. Utilice las alícuotas de amortiguamiento y compuestas almacenados a -20 ° C dentro de 2 meses desde el día de la preparación. </li><li> Quitar el tejido conectivo visible de la muestra usando unas tijeras afiladas y pinzas; si es necesario el uso de un microscopio de disección para este paso. Lávese bien las muestras 3-4 veces con tampón DPBS enfriado con hielo para eliminar la sangre. Mantener las muestras en DPBS y proceso heladas tan pronto como sea posible, teniendo cuidado de no exceder más de 45 minutos de la biopsia. Tome las precauciones necesarias para eliminar cuidadosamente cualquier tendones o tejido adiposo de la muestra de músculo. </li><li> Cortar inmediatamente el tejido muscular en trozos finos con un par de tijeras estériles y suspender en 500 l de 1 ml IPC contiene proteinase (Nagarse) a una concentración de 0,2 mg / g de tejido. Siga esto con una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente y luego transferir al hielo. </li><li> Homogeneizar los tejidos picados tratados con Nagarse utilizando un homogeneizador automatizado. Mantenga la muestra en hielo durante todo este proceso. Homogeneizar cada muestra de tejido cuatro veces, cada vez por un pulso de 2 segundos, usando el homogeneizador automatizado con un ajuste de velocidad de 10.000 rpm. Lavar la sonda con etanol al 70% seguido de agua destilada entre los tejidos. </li><li> Lavar el tejido homogeneizado con un volumen igual de CP I (500 l a 1 ml) y el volumen de 2x CP II (1 ml a 2 ml), y se recoge el contenido en un tubo de centrífuga y se centrifuga a 600 xg, 4 ° C durante 10 min. Pasar el sobrenadante a través de un paño humedecido queso, recoger el filtrado y desechar el sedimento, eliminando así la mayoría de las fracciones no mitocondriales. </li></ol> 3. Lavado de la mitocondria <ol><li> Centrifugar el sobrenadante de la etapa anterior en 10,000 xg, 4 ° C durante 10 min. Suspender el sedimento en 4 ml de tampón CP II y más centrifugar a 10.000 xg, 4 ° C durante 10 min. NOTA: En raras ocasiones, se forma un sedimento fino de sangre debajo de la pellet mitocondrial. En ese caso, retire el pellet mitocondrial por aspiración suave con tampón CPII. Este paso se puede evitar completamente lavando la sangre en el paso 2. </li><li> Suspender el sedimento obtenido en 2 ml de tampón CP I. En esta etapa utilizar una pequeña alícuota de esta suspensión para la estimación de proteínas. Resuspender la muestra restante en CP I buffer y centrifugar como anteriormente. Suspender el sedimento final en una cantidad mínima (200 l) de la solución de ensayo mitocondrial (MAS). NOTA: La proteína se ensayó en esta etapa porque tampón CP I no tiene BSA, mientras que el MAS en el que las muestras serán suspendidos después no tener BSA en ella. </li></ol> 4. Estimar el contenido mitocondrial midiendo la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteína BCA <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Utilice esta concentración para calcular la cantidad de mitocondrias utilizados para su embarque en una microplaca de 24 pocillos para mediciones respirométricos, o para experimentos de Western blot. Tener en cuenta el factor de dilución (10) para el cálculo de la concentración de proteína. 5. Lleve a cabo los ensayos XF según lo descrito por Rogers, GW, et al. 12 NOTA: Visualizar la tasa de consumo de O 2 (OCR) en pmoles O 2 / min, o los niveles absolutos de O 2 y pH en la salida de datos. <ol><li> Utilice 1x MAS para preparar compuestos para ser inyectado. Añadir una concentración 10x de los compuestos a los puertos de AD para dar una concentración final de la siguiente manera: Port A, ADP [-diphosphate adenosina 5 &#39;, 2 mM, 50 l]; puerto B, oligomicina (2 M, 55 l); puerto C, FCCP [cianuro de 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona carbonilo, 6 M, 60 l]; y el puerto D, 2 mM antimicina-A (65 l). Prepararvolumen suficiente de compuestos para el número requerido de pocillos. </li><li> Determinar la cantidad óptima de las mitocondrias por titulación. Por ejemplo, la carga de 1,0 g, 2,5 g, y 5,0 g de mitocondrias por pocillo en un volumen de 50 l de 1x frío de hielo que contienen MAS sustrato. Para minimizar la variabilidad entre los pozos, primero diluir 10x mitocondrias en sustrato frío 1x MAS +. A continuación, entregar 50 l de esta suspensión a cada pocillo (excepto a los pocillos de corrección de fondo). </li><li> Centrifugar la placa a 2000 xg, 20 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, añadir suavemente 450 l de 1x MAS + succinato (10 mM) y la rotenona (2 M) (condiciones iniciales; véase más adelante) a cada pocillo. Ver las mitocondrias en el microscopio para asegurar la adherencia homogénea al pozo antes de transferir la placa al analizador XF. NOTA: Las condiciones iniciales utilizados dependerá de si la respiración es accionado por cualquiera de I o complejo II complejo ETC. Por complejo respiración II impulsado por usar succinate (10 mM) y rotenona (2 mM) como condiciones iniciales. Bloques rotenona I complejo y succinato proporciona combustible para el complejo II (succinato deshidrogenasa). Para estudiar la respiración impulsado por el complejo I, utilizar ya sea piruvato y malato, cada uno a una concentración final de 5 mM o glutamato y malato cada uno a una concentración final de 10 mM como condiciones iniciales. Este último puede ayudar a distinguir entre la disfunción ciclo del ácido tricarboxílico y transporte sustrato. Para estudiar la respiración impulsado por tanto complejo I y II complejo, incluir piruvato y succinato sin rotenona o malato como condiciones iniciales. Utilice carnitina palmitoil como sustrato para la β-oxidación. </li><li> Secuencialmente medir la respiración mitocondrial en tiempo real utilizando el medidor de respiración mediante la programación de la forma descrita anteriormente 12. Utilice la configuración para el medidor de respiración proporcionado en la Tabla 2. NOTA: Una breve explicación de diversos estados de la respiración mitocondrial son los siguientes: </li><li&gt; Estado 2 = estado acoplado con el sustrato presente; Estado 3 = fosforilantes de respiración en presencia de saturar ADP; Estado 4 o = respiración no fosforilación inducida por oligomicina; 3u Estado = máxima respiración desacoplado estimulado por el desacoplador FCCP; Residual no mitocondrial respiración = respiración después de complejo III inhibición por antimicina-A. También se debe señalar que, la longitud de la medición de OCR en combinación con la concentración mitocondrial podría influir en los datos por el agotamiento de oxígeno durante los períodos de medición. </li></ol> 6. Western Blot NOTA: Determine el marcador mitocondrial de la COX IV y GAPDH tejido completo por Western Blot para asegurar el enriquecimiento de las mitocondrias en la muestra final <ol><li> Separe las mitocondrias aisladas y extracto de tejido completo en un 12% de sodio dodecil sulfato de geles de poliacrilamida. </li><li> Transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).</li><li> Incubar con el anticuerpo de la COX IV (1: 20.000), seguido de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios. Para la determinación de GAPDH, pelar el blot y la sonda con un anticuerpo monoclonal GAPDH (1: 2.000). NOTA: Si las diferencias en la contaminación ER son de interés, incluyen marcadores ER tales como ERp72, calnexina o calreticulina en el análisis. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

Mitocondrias aisladas se utilizan a menudo en los estudios que examinan la función de la función de ETC, así como otras actividades mitocondriales, incluyendo el transporte del sustrato y la función de ciclo del TCA. Ensayos respirométricas utilizando orgánulos aislados permiten el examen directo de los procesos básicos de la fosforilación oxidativa y las propiedades intrínsecas de la ETC. Perfiles de respirometría de mitocondrias aisladas en comparación con células enteras o las fibras musculares permeabilizadas tiene las ventajas de la interpretación de datos relativamente fácil y la ausencia de la &quot;interferencia&quot; de procesos no mitocondriales o los cambios en la masa mitocondrial / biogénesis. La normalización de los datos se basa en el contenido de proteína mitocondrial, permitiendo de ese modo sencillo comparación cruzada de las mitocondrias entre las muestras. Perfiles de respirometría de mitocondrias aisladas es un enfoque preferido cuando el objetivo del estudio es determinar los mecanismos subyacentes y la identificación de objetivos específicos, tales como componente ETCs / complejos, o mecanismos de transporte mitocondrial. Se describe un protocolo para biopsia muscular y aislamiento de las mitocondrias funcional a partir de pequeñas muestras de tejido. Este método produce resultados reproducibles entre los usuarios debido a la utilización de un homogeneizador automatizado frente de funcionamiento manual homogeneizadores Dounce. Aislamiento de las mitocondrias se puede realizar con tan poco como 20 mg de tejido muscular. La cantidad de mitocondrias aisladas que pueden obtenerse a partir de este tamaño de muestra es suficiente para ejecutar Seahorse respirometría a base de placa, dejando mitocondrias excedentes para otros experimentos y de almacenamiento para otros análisis moleculares. Cabe señalar que este método puede ser traducido al XF 96, donde incluso cantidades más pequeñas de las mitocondrias se pueden utilizar (1-2 g por pocillo). Varios protocolos para el aislamiento de las mitocondrias se basan en homogeneizadores Dounce para la interrupción inicial del tejido. Un inconveniente de este método es la práctica en la naturaleza del tejido inicialhomogeneización. La fuerza y la velocidad de la mano del mortero en el homogeneizador pueden variar significativamente entre los operadores 6. Esto puede resultar en la variación de experimento a experimento, así como la variación-laboratorio a otro, y conduce a dificultades en la comparación de los datos entre los experimentos. Esto es especialmente preocupante en los estudios de intervención en humanos cuando se recogen datos de los participantes en los puntos de tiempo separados, por lo general, antes y después del tratamiento, y potencialmente en múltiples sitios. Utilizamos un homogeneizador automatizado para un enfoque más coherente que produce resultados más reproducibles con limitada variación de persona a persona. La velocidad de la preparación también hace que este enfoque adecuado para el manejo de muestras múltiples al mismo tiempo. Típicamente, hasta tres experimentos se pueden realizar en un solo día. Las limitaciones potenciales de la técnica descrita aquí surgen de la utilización de los orgánulos aislados y el uso de un formato basado en placa. Por ejemplo, Picard et al. tener demoniotraron que las mitocondrias aisladas poseen características funcionales que difieren fundamentalmente de las de las mitocondrias intactas dentro de las miofibrillas permeabilizadas. Propusieron que las técnicas de aislamiento mitocondriales resultan en función bioenergética alterada, tales como el aumento significativamente en comparación con las miofibras RCR permeabilizadas acompañados por la producción de especies reactivas de oxígeno mayor 13. En comparación con las fibras musculares permeabilizadas, el aislamiento de las mitocondrias requiere mayor tiempo de preparación. Además, la pérdida de contenido celular disminuye relevancia fisiológica, algo que se retiene en las células enteras y las fibras incluso permeabilizadas. El uso de respirometría basado en placa con los permisos técnica descrita replicar carreras por muestra. Sin embargo, las mitocondrias se deben adherir a la parte inferior de cada pocillo. Esta configuración es diferente de su entorno normal y puede afectar las características funcionales. Además, cabe señalar que el uso de este protocolo para el aislamiento mitocondrial Ther,e todavía puede ser la contaminación de retículo endoplásmico (ER) en la preparación mitocondrial. Las diferencias en la contaminación ER pueden afectar la determinación del rendimiento y de influir en los resultados mitocondriales. En conclusión, este estudio presenta datos que confirman que las mitocondrias aisladas de tejidos utilizando este procedimiento son funcionalmente activos y pueden ser utilizados para estudios / aplicaciones que requieren mitocondrias aisladas de alta calidad a partir de la cantidad mínima de muestras de músculo esquelético. La ventaja de este método es que: i) es posible aislar las mitocondrias a partir de cantidades mínimas de músculo esquelético, ii) el procedimiento es rápido, iii) con la tecnología basada placa, es posible ejecutar varias muestras al mismo tiempo, y iv) no hay suficiente tejido sobrante y mitocondrias aisladas tras el ensayo bioenergética para el almacenamiento de muestras y otras investigaciones de biología molecular.

Las mitocondrias son los centros de producción de energía primaria en el celular y tienen un papel importante en el envejecimiento, así como diversos trastornos relacionados con la edad, como la enfermedad cardiovascular, enfermedad de Alzheimer, la diabetes, el cáncer y la obesidad. Perfiles de respirometría de mitocondrias aisladas proporciona análisis directo de la función de la cadena de transporte de electrones (ETC) y ha contribuido significativamente a nuestra comprensión de la biología mitocondrial y su papel en la salud y la enfermedad. Mitocondrias aisladas se utilizan para estudiar diversos aspectos de la bioenergética como, el transporte de sustrato, la actividad de la ATP sintasa, fuga de protones, etc. La metodología descrita en este manuscrito se ha optimizado para permitir el análisis respirométrico de mitocondrias aisladas de biopsias de tejido de músculo esquelético obtenidos a partir de sujetos humanos. El protocolo de biopsia se describe en este manuscrito ha sido utilizada por nuestro personal durante los últimos 12 años. Nuestro grupo ha realizado más de 700 procedimientos en los adultos de diversas edades,hasta 90 años, y con diversas patologías crónicas, sin ningún problema de seguridad adversas. Un aspecto clave de este protocolo es que está diseñado específicamente para utilizar cantidades mínimas de tejido, lo que facilita su uso en estudios de investigación clínica. Varios protocolos se han desarrollado para el aislamiento de las mitocondrias. Fernández-Vizarra et al. 1,2 describe un método para aislar las mitocondrias a partir de diversos tejidos de rata, así como células cultivadas. Garcia-Cazarin et al. 3 han informado un método para aislar las mitocondrias a partir de los músculos esqueléticos de rata y ratón. Un método para el aislamiento de las mitocondrias de cerebro de rata también ha sido reportado por Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 informaron de un método de aislamiento de mitocondrias usando el barocycler y / o la trituradora PCT. Recientemente, Franko et al. 6 reportó un método de aislamiento de mitocondrias altamente enriquecido utilizando contra-TOM22 Perlas magnéticas. Aunque estos protocolos producen excelentes resultados, los requisitos de tamaño del tejido son altos en comparación con el método descrito en este manuscrito. Por ejemplo, Gross et al. 5 utiliza 1.5 a 1.8 g del músculo gastrocnemio, y alrededor de 2 g del tejido renal. Del mismo modo, Franco et al. 6 utiliza 500 mg de tejido hepático de ratón. Desde nuestra experiencia, los rendimientos típicos que pueden esperarse de la biopsia percutánea con aguja de músculo esquelético (vasto externo) oscilan entre 100-200 mg. La capacidad de evaluar la función mitocondrial en 20-50 mg de tejido muscular utilizando el protocolo descrito aquí permite a los usuarios realizar múltiples evaluaciones por biopsia y almacenar las muestras para su uso futuro en otros experimentos de biología molecular. Esta es una característica crítica en la investigación clínica y otros estudios que requieren un uso diligente de las muestras. Cabe señalar que las mitocondrias previamente congelados no son buenas para el estudio de la respiración acoplado debido a TINERARIOr daño de la membrana mitocondrial y la pérdida de la actividad del citocromo C. Nuestro método ha sido adaptado y modificado a partir del método publicado por Chappell y Perry 7. Utilizando los métodos descritos en este manuscrito, hemos informado recientemente que el perfil respirométrico de las mitocondrias aisladas de vasto lateralis humano se correlaciona directamente con la capacidad física, medida como la velocidad del paso 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer Bio-Gen PRO200</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deepwell late Rotor&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm University College Hospital Needle</td>
			<td>Cadence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60cc syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate reader</td>
			<td>Tecan (Genios-basic)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF 24-3 analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel system</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak Gel Logic 112</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak camera assembly</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;">XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td>
			<td rowspan="2">Seahorse Bioscience</td>
			<td>100850-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100867-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>221473</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>12421-0010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A9187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial proteinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P-8038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9546</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9272</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>H3784</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>PI23227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S3674</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P5280</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>2288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADP(K+ salt)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF Cell mito stress test kit</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td>101706</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&#160;</td>
			<td>SC-29113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0343BOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilin Transfer Membranes (0.45um)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH20200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0006-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14734</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF822E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF812E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

Perfiles de respirometría de mitocondrias aisladas se utiliza comúnmente para investigar la función de la cadena de transporte de electrones. Se describe un método para obtener muestras de vasto lateral humanos, aislar las mitocondrias a partir de cantidades mínimas de tejido de músculo esquelético, y la placa de perfiles respirométrico basado utilizando un flujo extracelular (XF) analizador. Comparación de los perfiles respirométricas obtenidos utilizando 1,0, 2,5 y 5,0 g de mitocondrias indican que 1,0 mg es suficiente para medir la respiración y que 5,0 g proporciona resultados más consistentes basado en la comparación de los errores estándar. Western blot de las mitocondrias aisladas de marcador mitocondrial de la COX IV y no mitocondrial GAPDH marcador de tejido indican que existe contaminación transitoria mitocondrial limitado el uso de este protocolo. La capacidad para estudiar respirometría mitocondrial en tan poco como 20 mg de tejido muscular permite a los usuarios utilizar biopsias individuales para múltiples puntos finales del estudio en clínicaproyectos de investigación.

La Figura 1 representa un diagrama de flujo detallado de todo el protocolo. Perfiles de transferencia de Western de la COX IV / GAPDH (Figura 2) muestran la expresión de la proteína mitocondrial, la COX IV, y el marcador no mitocondrial, GAPDH. La expresión de la COX IV y GAPDH son evidentes en todo el lisado muscular. Después de las mitocondrias se aislaron utilizando la técnica descrita en este protocolo, las bandas de la COX IV son todavía evidentes mientras GAPDH está ausente en la misma exposición. Exposiciones más largas pueden revelar una banda GAPDH débil. Estas manchas indicar que las mitocondrias aisladas tienen contaminación transitoria mitocondrial mínima. Además, la expresión de la COX IV en mitocondrias aisladas es consistente entre muestras. La Figura 3 muestra los perfiles de respirométricas típicos accionados por el complejo II (succinato y rotenona) utilizando 1,0 g, 2,5 g, y 5,0 g de mitocondrias. Como era de esperar, en general OCR aumenta wITH mayores cantidades de mitocondrias. La relación del control respiratorio calculado (RCR) para este ensayo es de 7,95, lo que indica que la preparación mitocondrial es de alta calidad. Además, 3u estado OCR es ligeramente mayor que el de estado 3, lo que confirma la calidad mitocondrial. A fin de comparar la consistencia de los resultados cuando perfiles diferentes cantidades de mitocondrias, se realizó un ANOVA (análisis de varianza) y se calculó la suma de cuadrados (SS) como valores reales de varianza utilizando 1,0 g, 2,5 g, y 5,0 g de mitocondrias cargada por así (Figura 4). SS se presenta para el estado 2, el estado 3, 3u estado, antimicina A, y RCR. Para el estado 2 y el estado 3 mediciones, una manera ANOVA fue estadísticamente significativa (p &lt;0,01 yp &lt;0,05, respectivamente). Del mismo modo, el ANOVA de una vía fue estadísticamente significativa para antimicina y RCR (p &lt;0,01 yp &lt;0.0001, respectivamente. No se observaron diferencias significativas para 3u estado entre los grupos. ThESE resultados indican que 5,0 g de mitocondrias por pocillo dio el más bajo SS en comparación con otras concentraciones y es la cantidad óptima para utilizar en el sistema XF 24 con nuestra población de participantes. La figura 5 sirve como una guía para indicar cómo se puede esperar que la cantidad de proteína mitocondrial basada en el tamaño inicial de la muestra de músculo. Como era de esperar hay una fuerte correlación entre la cantidad de músculo (mg) procesado y el contenido total de proteína mitocondrial (mg) de la muestra final. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampón Chappel-Perry I (IPC) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tampón Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> -Ácido graso libre BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensayo Solución (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> La sacarosa </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> -Ácido graso libre BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensayo Solución (MAS) con complejos II condiciones iniciales </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinato </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> La rotenona </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensayo Solución (MAS) con complejos I condiciones iniciales </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Todos los tampones que se hagan en agua desionizada </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Solución y recetas de amortiguamiento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Pasos del protocolo </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Comando </td><td> Tiempo (min) </td><td> Puerto </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Esperar </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> La </td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Inyectar </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Mezclar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Mezclar, medir y mezclar ajuste de ciclo para el medidor de respiración. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de todo el protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Un representante de Western blot para el tejido muscular esquelético conjunto, así como las mitocondrias aisladas. Extracto de tejido conjunto, así como las mitocondrias aisladas se inmunotransfirieron con el anticuerpo de la COX IV como marcador mitocondrial y anticuerpos GAPDH para el control no mitocondrial. No se observó una banda de GAPDH en las mitocondrias aisladas que indica poca o ninguna contaminación de fuentes no mitocondriales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figura 3. Perfil respirométrico Representante de las mitocondrias aisladas de vasto lateralis humana. Tres concentraciones de mitocondrias aisladas, 5,0 mg, 2,5 mg y 1,0 mg nosotros<html> re utilizado en este ensayo. Las concentraciones finales de los compuestos después de las inyecciones de puerto fueron 2 mM ADP (puerto A); 2 mM oligomicina (puerto B); 6 micras FCCP (puerto C); y 2 mM antimicina A (puerto D). RCR Calculado para esta carrera era 7.95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figura 4. Suma de cuadrados. La suma de los cuadrados de los diferentes estados de la respiración mitocondrial y RCR utilizando 5,0 mg, 2,5 mg y 1,0 mg mitocondrias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Esto se puede utilizar como una guía para estimar la cantidad de proteína mitocondrial que se puede esperar basado en el análisis inicial de la muestra del músculo peso de regresión:. De cantidad de músculo (mg) y rendimiento de proteína mitocondrial total (mg). Como era de esperar, hay una correlación positiva directa entre la cantidad de músculo y la proteína mitocondrial total obtenida.

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Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.2K vistas.  Wake Forest School of Medicine.  Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica. 

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Investigación

Medicina

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Evaluación del ventrículo derecho Estructura y función en modelo de ratón de la constricción de la arteria pulmonar mediante ecocardiografía transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimientos de biopsia de músculo esquelético humano utilizando la técnica de Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the lack of a standardized definition for STG. Biopsy is often required to differentiate benign from malignant lesions. Unlike cervical thyroid, the overlying sternum precludes ultrasound-guided percutaneous fine needle aspiration of STG. Consequently, surgical mediastinoscopy is performed in the majority of cases, causing significant procedure related morbidity and cost to healthcare. Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA) is a frequently used procedure for diagnosis and staging of non-small cell lung cancer (NSCLC). Minimally invasive needle biopsy for lesions adjacent to the airways can be performed under real-time ultrasound guidance using EBUS. Its safety and efficacy is well established with over 90% sensitivity and specificity. The ability to perform EBUS as an outpatient procedure with same-day discharges offers distinct morbidity and financial advantages over surgery. As physicians performing EBUS gained procedural expertise, they have attempted to diversify its role in the diagnosis of non-lymph node thoracic pathologies. We propose here a role for EBUS-TBNA in the diagnosis of substernal thyroid lesions, along with a step-by-step protocol for the procedure.

Substernal thyroid lesions are common, and need to be differentiated from malignancy. Obtaining percutaneous fine needle biopsy is not possible due to its retrosternal location. This article proposes a protocol for biopsy of substernal thyroid lesions using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA).

Subesternal tiroides Biopsia Usando guiada por ecografía endobronquial punción transbronquial

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

En Vivo, percutánea, Aguja Based, tomografía de coherencia óptica de las masas renales

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) are increasing. Such infections are largely attributable to quinolone resistant microorganisms which colonize the rectal vault and are translocated into the bloodstream during the biopsy procedure. A povidone iodine rectal preparation (PIRP) at time of biopsy is a simple, reproducible method to reduce rectal microorganism colony counts and therefore resultant infections following TRUS PNB.
All patients are administered three days of oral antibiotic therapy prior to biopsy. The PIRP technique involves initially positioning the patient in the standard manner for a TRUS PNB. Following digital rectal examination, 15 ml&#160;of a 10% solution of commercially available povidone iodine is mixed with 5 ml&#160;of 1% lidocaine jelly to create slurry. A 4 cm x 4 cm sterile gauze is soaked in this slurry and then inserted into the rectal vault for 2 min after which it is removed. Thereafter, a disposable cotton gynecologic swab is used to paint both the perianal area and the rectal vault to a distance of 3 cm from the anus. The povidone iodine solution is then allowed to dry for 2 - 3 min prior to proceeding with standard transrectal ultrasonography and subsequent biopsy.
This PIRP technique has been in practice at our institution since March of 2012 with an associated reduction of post-biopsy infections from 4.3% to 0.6% (p = 0.02). The principal advantage of this prophylaxis regimen is its simplicity and reproducibility with use of an easily available, inexpensive agent to reduce infections. Furthermore, the technique avoids exposing patients to additional systemic antibiotics with potential further propagation of multi-drug resistant organisms. Usage of PIRP at TRUS PNB, however, is not applicable for patients with iodine or shellfish allergies.

Here, we present a protocol for use at the time of transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) that is a simple and cost-effective means to reduce infections following the procedure.

Povidona yodada Preparación rectal al momento de la próstata Biopsia con aguja es un medio simple y reproducible para reducir el riesgo de infección Procesal

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto externo</em&gt; Esquelético biopsia muscular utilizando el Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...