We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI Transducción y Cultivo Celular <ol><li> FUCCI transducción <ol><li> Crear líneas celulares que expresan establemente el FUCCI construye mKO2-hCdt1 (30-120) y MAG-hGem (1-100) 15 utilizando lentivirus co-transducción de lo descrito previamente 7. Nota: El sistema FUCCI ya está disponible comercialmente. </li><li> Generar sub-clones con fluorescencia brillante por la clasificación de una sola célula. Ordenar células individuales positivas tanto para AG y KO (amarillo) por fluorescencia de células activadas por la clasificación en una placa de 96 pocillos como se describió previamente 7,16. </li></ol></li><li> Cultivo de células de melanoma <ol><li> Células de melanoma humano Cultura C8161 previamente descritos 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Esferoide Formación 3D (como se describió previamente 3,9) <ol><li> Preparación de la placa de agarosa <ol><li> Disolver 1,5% de agarosa (o agar noble) en 100 ml de solución de Hank salina equilibrada (HBSS) o Buffere fosfatod salino (PBS) por ebullición en el microondas durante 3-5 min con agitación. Asegúrese de que la agarosa se haya disuelto completamente. </li><li> Inmediatamente prescindir de 100 l de la solución de agarosa por pocillo a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo plano usando una pipeta multicanal. Nota: La agarosa puede solidificarse en la punta después de un corto período de tiempo, para superar este problema consejos deben ser cambiados entre las placas si toma más de una placa de agarosa. </li><li> Deja placa de 96 pocillos sobre una superficie plana para endurecer agarosa durante al menos 1 hr. </li></ol></li><li> Preparación de células y superposición en agarosa <ol><li> Cultivan las células a aproximadamente el 80% de confluencia en un matraz T75. Lavar con 10 ml de HBSS. </li><li> Separar las células usando 1,5 ml de 0,05% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y resuspender en 10 ml de medio normal. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro 18 u otro método de conteo automatizado. </li><li> Resuspender las células a una concentración final de 25.000 células / ml en normaal medio. </li><li> Superposición de pozos de agarosa con 200 l de la suspensión de células para un número final de 5.000 células por pocillo. </li><li> Placas de retorno a la incubadora de cultivo celular (5% de CO 2 y 37 C) para formar esferoides más de aproximadamente 3 días. Nota: El tiempo necesario para formar un esferoide varía entre las diferentes líneas celulares. Algunas líneas de células no forman esferoides utilizando este método en absoluto. </li><li> Image morfología esferoidal con un microscopio invertido usando un objetivo 4X y un filtro de contraste de fase. Una línea celular que se forma con éxito esferoides se producen compactos, agregados de células más o menos esféricas, y no debe haber sólo un esferoide por pocillo. Nota: Opcional: Una vez esferoides se han formado, se pueden trasplantar en colágeno u otra matriz para su posterior análisis del crecimiento y la invasión 3,7,17. Para eliminar esferoides a partir de colágeno, se trata con 500 l de 2 mg / ml de colagenasa a 37 ° C hasta que el colágeno se disuelve suficiente para que el spheroids que vienen gratis en los medios de comunicación (aproximadamente 30 minutos). Retire con cuidado esferoides utilizando una pipeta de 1 ml. </li><li> Para seccionar / formación de imágenes esferoides FIX (ya sea aisladas a partir de colágeno o cultivados durante 3-5 días en agarosa) en 10% de formalina tamponada neutra (PRECAUCIÓN: La formalina se debe utilizar en una campana de humos) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente (RT) , o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Esferoides pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días. </li></ol></li></ol> 3. esferoide Vibratome Seccionamiento <ol><li> Disolver 5 g de agarosa de bajo punto de fusión en 100 ml de HBSS en una botella de vidrio de 500 ml en un microondas. Utilice un ajuste fuego medio con turbulencia. PRECAUCIÓN: Mantenga la tapa suelta al hervir la solución para que la presión se puede liberar. Utilice guantes protectores resistentes al calor para protegerse las manos de quemaduras al manipular la botella de vidrio caliente. </li><li> Espere hasta que la agarosa se enfría un poco - por lo que la botella se puede tocar sin quemarse las manos. </li><li> Vierta approximamadamente 2 ml de agarosa en el fondo de una taza contador Coulter o molde plástico similar. Aspirar inmediatamente a un esferoide fijo (véase la sección 2.2.8) utilizando una pipeta de 1 ml en el menor volumen de líquido posible. Añadir esferoide a la agarosa. A pocos esferoides (hasta 10) se pueden añadir por taza. </li><li> Cubrir los esferoides con 2 ml más de agarosa. Haga esto rápidamente para evitar el endurecimiento de agarosa antes de añadir la segunda capa. </li><li> Permitir que la agarosa se endurezca a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos 3 h. En este punto copas pueden ser almacenados durante un corto tiempo a 4 ° C con 2-3 ml de HBSS cubrió para evitar la deshidratación. </li><li> Retire agarosa de la copa. Recorte la agarosa que contiene los esferoides de forma que encaje en el bloque de metal vibratome, y esferoides están cerca de la parte superior de la agarosa. Los esferoides pueden ser vistos como pequeños objetos blancos dentro de la agarosa. Super Glue la agarosa al bloque. </li><li> Llene el vibratome con agua destilada y montar el bloque en el vibratome. Ajuste elvibratome para cortar 100 micras secciones usando baja velocidad (ajuste 2) y alta vibración (ajuste 8). Ajuste el ángulo de la hoja de corte a 16 °. Gire vibratome encendido, encender la luz vibratome y cortar secciones de la parte superior de la agarosa hasta 100 micras secciones esferoide se cortan. Coloque secciones esferoide cortadas en HBSS en una placa de 24 pocillos. </li><li> Elija secciones centrales para el análisis de imágenes. Mount secciones en las diapositivas mediante la transferencia de la sección plana sobre el portaobjetos con unas pinzas. Llene un cilindro de la jeringa de 10 ml con grasa de vacío; añadir una línea fina de grasa de vacío alrededor de los bordes de la sección con el fin de impedir que los medios de montaje se escurra de los bordes de la diapositiva y ayudar a sellar la sección bajo el cubreobjetos. Cubra la sección con medio de montaje y un cubreobjetos. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Tienda desliza a 4 ° C antes de la imagen. </li></ol> 4. confocal de adquisición de imágenes <ol><li> Tome una imagen z-rebanada de una sección esferoide FUCCI medio usando un 10Xu objetivo 20X a lo descrito previamente 7. Asegúrese de que no se solapan o diafonía se produce entre el Kusabira Orange2 y Azami Verde. Si la comparación de análisis de imagen entre varias secciones esferoide, mantenga la potencia del láser y otros ajustes de la misma entre las muestras. </li></ol> 5. Hoechst tinte ensayo de difusión para el flujo de Clasificación <ol><li> Transferencia esferoides vivos (3-5 días después de la siembra de agarosa) a un tubo de 15 ml. Deje esferoides gravedad depositan en el fondo del tubo. Varios esferoides pueden teñirse por tubo. Se necesitan aproximadamente 20 esferoides para obtener el número de células suficientes para citometría de flujo. </li><li> Retire el exceso de medio y agregar 1 ml de 10 mM Hoechst diluidas en medio normal. Incubar esferoides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hr. Utilice parpadeo suave para resuspender las esferoides una o dos veces durante la incubación. Nota: El tiempo de incubación puede variarse para alterar hasta qué punto el colorante Hoechst penetra en los esferoides. Esto puede variar en funciónel tamaño esferoide, la densidad y la línea celular. Para algunas grandes esferoides / densos puede haber una máxima penetración de tinte que es menor que 100%. </li><li> Lavar los esferoides suavemente con 5 ml de HBSS utilizando sedimentación por gravedad. <ol><li> Opcional: Para imágenes de penetración del colorante: Fix esferoides con 10% de formalina tamponada neutra por lo menos durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Preparar vibratome secciones, montar en portaobjetos y la imagen en la confocal como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores. </li></ol></li><li> Para preparar células para la citometría de flujo, trypsinize esferoides con 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min con parpadeo cada 10 min para romper los esferoides aparte. Nota: esferoides son difíciles de conseguir en suspensión de células individuales, pueden necesitar ser optimizado condiciones. Viabilidad de C8161 4 días de edad esferoides después de este proceso es de aproximadamente 95%. </li><li> Células mancha con un vivo en el infrarrojo cercano / mancha muertos según el protocolo de los fabricantes. Lavar con HBSS luego fijar con 1ml de 10% de formalina tamponada neutra durante aproximadamente 30 min. Las células pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días antes del análisis de flujo. </li></ol> 6. Citometría de Flujo Análisis de Hoechst manchadas Fucci esferoides <ol><li> Asegurar que las células no están agrupadas haciéndolas pasar a través de un colador celular. Resuspender el Hoechst manchada esferoides Fucci en hielo frío de lavado FACS (PBS con 5% suero de ternero fetal) a una concentración de 1-5 x 10 6 células / ml. Transferir 200 l de muestra de 5 ml a tubos de fondo redondo. </li><li> Preparar las siguientes muestras individuales de control de color según se describe en 6.1: las células del melanoma un-manchado; las células del melanoma adherentes se tiñeron con 10 M Hoechst durante 1 hora; Azami verde solamente expresan las células de melanoma; y Kusabira Naranja solamente expresan las células de melanoma. Nota: Los controles individuales de color pueden ser fijados en formalina y se almacenan en FACS lavar con 0,1% azida sódica a 4 ° C durante semanas o incluso meses. </li><li> Suspensiones de células individuales Ejecutar oflujo na citometría analizador con láseres adecuados y de un solo color / controles no teñidas como anteriormente descrito 7,16. </li><li> Utilice software de citometría comercial como FlowJo para analizar el interior frente a las células esferoides exteriores de la siguiente manera: <ol><li> Retire los residuos por gating en la población de células principal de luz dispersada hacia adelante (FSC) vs. Light Side Dispersos (SSC). </li><li> Retire dobletes por gating en células individuales utilizando FSC (Zona) vs. FSC (Altura) </li><li> Puerta de células vivas por gating en la población de bajos vivo / muerto. </li><li> Definir Hoechst pilas de gran, Recinto base a la señal positiva por parte de las células adherentes se tiñeron con Hoechst, como células &quot;exteriores&quot;. </li><li> Definir las células bajas o negativas Hoechst, cerradas en base a la señal del mando a un-manchado, como células &quot;internos&quot;. </li><li> Después de compuerta para las poblaciones interiores y exteriores, las células pueden urbanización cerrada más para el rojo FUCCI (G1), amarillo (a principios de S), verde (S / G2 / M) o negativo (a principios de G1). Nota: COMPENSACIÓN utilizando los controles de un solo color puede ser necesario para definir adecuadamente las poblaciones de color rojo, amarillo, verde y negativos Fucci. </li></ol></li><li> Una vez que el ensayo ha sido optimizado y validado a través de la penetración de Hoechst microscopía confocal, las células funcionar sin la colocación sobre un clasificador de células de flujo como se describió previamente 7,16 para su posterior análisis de las sub-poblaciones de células en vivo. </li></ol> Análisis 7. Imagen de FUCCI Esferoide Secciones <ol><li> Software por ejemplo, en Abrir. Volocity, elija la configuración SÓLO cuantificación. </li><li> Crear una nueva biblioteca. Importe el archivo de imagen confocal FUCCI esferoide en el software arrastrando el archivo de datos brutos de la confocal en la biblioteca. También puede utilizar el comando Archivo&gt; Importar. </li><li> Ve a la pestaña mediciones para construir un protocolo de análisis de imágenes. El Protocolo se construye arrastrando y soltando los comandos apropiados en el orden correcto de la siguiente en la ventana de protocolo. </li><li> Encuentra objeja en el canal verde: Arrastre el hallazgo de comandos (que se encuentra en &#39;Buscando&#39;) en la ventana del protocolo de objetos, seleccione el canal correcto en los objetos hallazgo protocol.Add un comando abierto (que se encuentra en el «tratamiento»), entonces A tocar objetos separados comando (que se encuentra en &#39;Procesamiento&#39; - esto separar las células). Excluir objetos por tamaño &lt;50 micras (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39; - esto va a excluir a los pequeños objetos no celulares). Nota: Variables como el umbral de encontrar objetos, el número de iteraciones abiertos, el tamaño de los objetos a separar y el tamaño de los objetos para excluir debe ser optimizado manualmente hasta que las máscaras de objeto coincide con la imagen. </li><li> Encuentra objetos en el canal rojo: Repetir encontrar los objetos que el anterior para el canal rojo. Protocolos verdes y rojas pueden necesitar ser ajustados por separado. Nota: Debido a los núcleos estar en G2, núcleos verdes son a menudo ligeramente más grande. </li><li> Confirme objetos encontrados son exactos Confirmar rojo y objetos verdes coinciden con elnúcleos rojos y verdes en la imagen apagando y en los canales verde y rojo (con la piel o mostrar comandos canal) mientras muestra las máscaras rojas y verdes que se encuentran por el protocolo. Opciones de comentarios (Medidas&gt; Opciones de comentarios) se pueden utilizar para modificar el aspecto de las máscaras de objetos. </li><li> Encuentra objetos amarillos (células en fase S temprana): Para encontrar celdas amarillas, añadir una intersección rojo con células verdes de comandos (que se encuentra en &quot;Combinar&quot;). Excluir objetos por tamaño (&lt;50 micras, que se encuentran en &#39;filtrado&#39;) para excluir a los pequeños objetos no celulares. </li><li> Encuentra objetos exclusivamente rojos (células en fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente rojos, restar las celdas amarillas de los glóbulos rojos (que se encuentran en el &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos por tamaño &lt;50 m, (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39;) para eliminar cualquier objeto pequeño no celulares creadas. </li><li> Encuentra objetos exclusivamente verdes (células en fase S / G2 / M): Repita el procedimiento para el canal verde para encontrar exclusivamente verde. Note: Si todavía hay objetos no celulares restantes, un comando población filtro puede ser añadido a los protocolos de rojo, verde o exclusivos exclusivos (que se encuentran en &#39;Filtrado&#39;) para retener sólo los objetos con un factor de forma mayor que 0,25. Esto eliminará los objetos no circulares. </li><li> Encuentra el contorno esferoide: Encuentra el contorno esferoide utilizando un hallazgo de comandos (que se encuentra en &#39;Buscando&#39;) con el canal verde o rojo (el que tiene más células alrededor del borde del esferoide) objetos. Un umbral mucho más bajo (que se encuentra en el hallazgo de objetos de variables) tendrá que ser utilizado para determinar el contorno esferoide comparación con las células individuales. <ol><li> Utilice un comando cerca de unirse a objetos (que se encuentran en «tratamiento»), luego rellenar agujeros en objetos (que se encuentran en «tratamiento»), a continuación, utilizar un filtro fino (que se encuentra en el &#39;filtrado&#39;) para eliminar el ruido de los objetos. Finalmente, excluir objetos por tamaño para eliminar los objetos más pequeños &lt;30,000 m (dependiendo del tamaño esferoide). Nota: Tendrá que ser optimizado manualmente hasta que el contorno esferoide es exacta Este protocolo. Una imagen de campo claro también se puede utilizar - sin embargo esto es generalmente menos preciso con una sección esferoide, y un comando invertido (que se encuentra en &#39;combinación&#39;) tendrá que ser utilizado. </li></ol></li><li> Mida las distancias de los núcleos de contorno esferoide: Medir distancias (que se encuentra en &#39;relativa&#39;) de las poblaciones de color amarillo, verde y exclusivamente exclusivamente rojos desde el centroide celular hasta el borde del esferoide outline.To visualizar las distancias mínimas, que debe ser de la celular al borde esferoide más cercano, encender muestran distancias en la pestaña de relaciones en las opciones de retroalimentación (Medidas&gt; Opciones&gt; Relaciones de votos). </li><li> Guarde el protocolo. Este protocolo se puede volver a aplicar a otras imágenes mediante las mediciones&gt; Restaurar comando de protocolo. </li><li> Crear un elemento de medición (Medidas&gt; Crear Medición de artículos). Los datos pueden ser analizados mediante el análisisfunciones. <ol><li> Ir a la ficha de análisis en el tema mediciones. Ir al menú Analysis (Análisis&gt; Analizar) y analizar la distancia mínima desde el centroide celular (rojo, verde o amarillo) al borde esferoide, resumida por el conde y organizada por la población. </li><li> Para contar el número de células que se encuentran a una cierta distancia desde el borde crear un filtro (Análisis&gt; Filter). El filtro para la distancia mínima en la Figura 2 se basa en la penetración de Hoechst (por ejemplo, la distancia mínima es de menos de 80 da la población &quot;externa&quot;). Por otra parte, la exportación de datos en bruto a una hoja de cálculo para su posterior análisis. </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li><li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent.">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique.">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li></ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Análisis de imágenes semi-automatizado identifica la región G1 arrestado interior esferoide, y la proliferación de las capas exteriores. Este método puede ser utilizado en esferoides en vivo usando una sección óptica, o en secciones esferoide fijos, para identificar los cambios en no sólo el ciclo celular, pero la expresión del marcador (a través de inmunofluorescencia), la muerte celular, o la morfología celular en estas diferentes regiones. Motilidad celular dentro de las diferentes regiones esferoide tambi...

Esferoides multicelulares 3D se han conocido como un modelo de tumor durante décadas, sin embargo, es sólo recientemente que han llegado a ser de uso más común a medida un modelo in vitro para muchos cánceres sólidos. Ellos se utilizan cada vez en las pantallas de descubrimiento de fármacos de alto rendimiento como un intermediario entre el complejo, costoso y lento en modelos in vivo y el simple, el modelo de monocapa 2D bajo coste 6.1. Los estudios realizados en la cultura 2D a menudo no pueden ser replicados en vivo. Modelos Esferoide de muchos tipos de cáncer son capaces de imitar las características de crecimiento, sensibilidad a los fármacos, la penetración del fármaco, las interacciones célula-célula, la disponibilidad restringida de oxígeno y nutrientes y el desarrollo de la necrosis que se observa in vivo en tumores sólidos 6-11. Esferoides desarrollan un núcleo necrótico, una región de reposo detenido o G1 que rodea el núcleo, y las células que proliferan en la periferia del esferoide 7. El desarrollo de estas regionespuede variar dependiendo de la densidad celular, la tasa de proliferación y el tamaño del esferoide 12. Se ha planteado la hipótesis de que la heterogeneidad celular visto en estos diferentes sub-regiones puede contribuir a la resistencia a la terapia del cáncer 13,14. Por lo tanto la capacidad de analizar las células en estas regiones por separado es crucial para las respuestas de drogas comprensión tumorales. El sistema indicador de ciclo celular ubiquitinación de fluorescencia (FUCCI) se basa en el rojo (Kusabira Orange - KO) y verde (verde Azami - AG) marcación fluorescente de Cdt1 y geminin, que se degrada en diferentes fases del ciclo celular 15. Así núcleos celulares aparecen rojos en G1, amarillo a principios de S y verde en S / G2 / M fase. Se describe aquí dos métodos complementarios tanto usando FUCCI para identificar el ciclo celular, junto con el uso de software de formación de imágenes o un flujo de difusión de colorante ensayo de citometría para determinar si las células residen en el centro G1 detenida o el exterior proliferating anillo, y la distancia de las células individuales desde el borde del esferoide. Estos métodos se desarrollaron en nuestra publicación anterior, en el que demostraron que las células de melanoma en regiones hipóxicas en el centro del esferoide o / y en presencia de terapias dirigidas son capaces de permanecer en arresto G1 durante largos períodos de tiempo, y pueden re- entrar en el ciclo celular cuando se presentan condiciones más favorables 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose low melting point</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>noble agar&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5431</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose for spheroids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5014-1CS</td>
			<td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &#160;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead near IR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibratome</td>
			<td>Technical Products International, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coulture cup</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SIE936</td>
			<td>Mold for sectioning spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Invitro</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analyser</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flowjo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccuum grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI (commercial constructs)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36238</td>
			<td>Transient transfection only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 um</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Hay varios métodos de producción de esferoides tumorales, este protocolo utiliza el método de crecimiento no adherente, donde las células se cultivan en agar o agarosa 3,7,9. La figura 1 muestra un ejemplo de un esferoide melanoma C8161 después de 3 días en agar. Esferoides C8161 forman esferoides de tamaño regular con un diámetro de 500 a 600 m (media = 565, SD = 19, n = 3) después de 3 días. Otras líneas celulares de melanoma que formarán esferoides incluyen: WM793, WM983C, WM98...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K vistas.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Video: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Investigación

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.