Name: optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
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The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Preparación de fotoactivos Sustratos <ol><li> Preparar una P3HT: PCBM solución (1: 1 w / w) en clorobenceno a una concentración de 20 g P3HT / L. Mezclar la solución con un agitador magnético durante al menos 4 horas a 60 ° C. Considere un volumen de 150 l de solución para cada sustrato que se preparó. </li><li> Limpiar los portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO (R = 10 Ω s / sq, 18x18 mm 2, el espesor de 170 micras) con baños consecutivos de agua desionizada, acetona e isopropanol en un aparato de ultrasonidos (10 min para cada paso). Seque el cubreobjetos con una pistola de nitrógeno. Poner las muestras en un limpiador de plasma a 100 W de potencia durante 10 min. </li><li> Deposita una fina capa de la capa activa en los sustratos limpios a través de spin-coating. <ol><li> Con una punta de diamante, corte un portaobjetos de vidrio de microscopio, (espesor ≈ 1 mm) para las mismas dimensiones laterales de los sustratos recubiertos de ITO. Retire la P3HT: solución PCBM de la placa de cocción y deje que se enfríe a temperatura ambiente. </li><li> Set de dos-steps programa spin-revestidor: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Posicionar el cursor en el mandril de la escisión revestidor e iniciar el vacío para arreglarlo. Ponga una gota de acetona en la diapositiva y, a continuación el sustrato limpiado, con la cara recubierta con ITO hacia arriba. Inicie el giro spin-recubridora para deshacerse del exceso de acetona. </li><li> Poner 150 ml de P3HT: solución PCBM sobre los sustratos y empezar de nuevo el spin-revestidor (usar el mismo protocolo descrito en 1.3.2). </li><li> Después de la escisión revestidor ha terminado, retire la muestra y separar cuidadosamente el sustrato revestido de la lámina de vidrio. Limpiar la parte posterior del sustrato con un hisopo de sala limpia por inmersión en acetona. Nota: Los sustratos fotoactivos se pueden almacenar durante algunos días en una caja oscura hasta su uso. Para períodos más largos, los mantienen en una guantera con gas inerte. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de cultivos celulares de media y Electrofisiología Soluciones <ol><li> Preparar el medio de crecimiento completo (CGM) paraHEK-293 células: Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor no, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Esterilizar el medio de un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar la solución extracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 glucosa, 1,8 CaCl 2, 1 de MgCl 2. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar la solución intracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl2, 0,1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Tenga en cuenta que la ATP-Na 2 es sensible al calor y agregarlo pasado. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración, la alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C. </li></ol> 3. Revestimiento HEK-293 célulassobre los sustratos activos <ol><li> Coloque el sustrato fotoactivo en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con aluminio o un plato Petri cerrada y poner en un horno a 120 ° C durante 2 hr para la esterilización. Desde este momento en adelante, realizar todas las operaciones en condiciones estériles. Poner las muestras en una campana estéril y dejar enfriar. </li><li> Revestir el sustrato fotoactivo con una capa de adhesión para reducir la hidrofobicidad de la superficie y para promover la adhesión celular. <ol><li> Coloque los sustratos activos en un P35 placa Petri o una placa de múltiples pocillos 6. Dada la hidrofobicidad de la capa de polímero conjugado, hacer un polidimetilsiloxano (PDMS) para fijar bien la muestra y confinar las soluciones. <ol><li> Mezclar PDMS y el catalizador en un 10: 1 proporción con una varilla de vidrio para obtener una suspensión viscosa. </li><li> Se vierte la suspensión en una placa de múltiples pocillos 6, dispensando una cantidad suficiente para cubrir la mitad de cada pocillo. </li><li> Espere a que la polimerización PDMS a RT. </li><li> Cortar las PDMS curados en el centro para obtanando una forma cuadrada de la misma dimensión de la muestra de polímero. </li><li> Esterilizar el PDMS pozos por inmersión en una mezcla de etanol-agua 70% durante al menos 30 min. </li></ol></li><li> Si bien el uso de los PDMS, rayar la capa fotoactiva a lo largo de toda la frontera del pozo con pinzas puntiagudas, con el fin de evitar el desprendimiento de toda la capa cuando la eliminación de los PDMS bien después de cultivo de células. </li><li> Cubrir toda la superficie de cada muestra con una solución de fibronectina (2 mg / L en PBS). Un volumen de entre 500 a 750 l por muestra suele ser suficiente si un PDMS también se utiliza (superficie transparente del pozo: 15x15 mm 2). Sin los PDMS así, alrededor de 2 ml de solución de fibronectina son necesarios para sumergir completamente la muestra; prestar atención a que el sustrato no flota, mientras que la adición de la solución. Incubar las muestras a 37 ° C durante al menos 1 hr. </li><li> Eliminar la solución de fibronectina con una pipeta de vidrio y lavar una vez con 2 ml de PBS. </li></ol></li><li> Plcomió HEK-293 células en las muestras tratadas con fibronectina a una densidad de 15.000 células / cm2 en medio de crecimiento completo. Use un volumen de 750-1.000 l de CGM para cada muestra si un PDMS también se utiliza, en caso contrario 2-3 ml de CGM son necesarios. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 a 48 horas. </li></ol> 4. protocolo de estimulación óptica y electrofisiológicos mediciones <ol><li> Ponga la solución extracelular en un baño de agua a 37 ° C a termalizar; descongelar la solución intracelular, lo puso en una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 34 y mantenerlo en contacto con el hielo para evitar la degradación del ATP. </li><li> Tome un sustrato celular recubierto de la incubadora, retirando cuidadosamente los PDMS bien si está presente. Retire el medio de cultivo con una pipeta de vidrio y enjuague la muestra con solución extracelular. Proceda lentamente para evitar el desprendimiento de células. </li><li> Ponga el dispositivo en la muestra-titular de la estación de electrofisiología con solutio extracelularn y el electrodo de referencia. Preparar micropipetas de vidrio frescos para patch-clamp con un extractor (resistencia ideal es en el rango de 2-4 mO). Llene la mitad de la pipeta con solución intracelular y montarlo en el micromanipulador. </li><li> Busque una célula sana parchear en el dispositivo. Para evitar la excitación no deseada del sustrato fotoactivo, utilice iluminación IR para formación de imágenes, la colocación de un filtro de paso de longitud de onda larga (por ejemplo, un corte de longitud de onda λ = 750 nm se puede utilizar para los polímeros que absorben en el visible) en frente de la iluminador de microscopio. </li><li> Parche la celda seleccionada y aplicar el protocolo deseado para la estimulación óptica mediante la entrega de la luz a la muestra a través de la trayectoria de excitación de fluorescencia del microscopio (Figura 1). Una descripción detallada del protocolo de patch-clamp se puede encontrar en la referencia 20. <ol><li> Coloque el parche pipeta en estrecha proximidad a la membrana celular con un manipulador micrométrica. Durante el posicionamiento, aplicar overpressure para la pipeta con el fin de evitar que se pegue la suciedad en la punta. La pipeta debe ser pocas micras por encima de la célula. </li><li> Empezar a bajar la pipeta hacia la membrana celular mientras se controla la resistencia de la pipeta en el software de control de parche. Cuando la resistencia de la pipeta se ha incrementado aproximadamente 1 MW, eliminar la sobrepresión de la pipeta mientras se aplica una succión suave, con el fin de formar el gigaseal entre la pipeta y la membrana celular (es decir, la resistencia medida debe aumentar a valores mayores que 1 GΩ) . </li><li> Aplicar un potencial negativo de la pipeta cerca de la celda esperada potencial de reposo (por HEK293 célula un potencial de -40 mV se puede utilizar) para ayudar a estabilizar el sello. Compensar los transitorios capacitivos debido a la capacitancia pipeta con los comandos relativos sobre el amplificador de parches y / o el software de control de parches. </li><li> Romper la membrana para permitir el acceso eléctrico a la citoplasma de la célula mediante la aplicación de una breve e intensa del pulso de succióna la pipeta. Ajuste el amplificador de patch al modo de pinza de corriente (I = 0, es decir, sin corriente inyectada en la célula) para realizar el seguimiento del potencial de la membrana celular. Esperar unos minutos para ver si el potencial de la pila es estable. </li><li> Aplicar el protocolo de iluminación deseada a la célula y registrar el efecto sobre el potencial de membrana. Nota: La iluminación puede ser entregado a la muestra ya sea desde la parte inferior o desde la parte superior, dependiendo de la arquitectura microscopio. <ol><li> Seleccione una longitud de onda de excitación que es bien absorbido por el material activo; para la P3HT: PCBM mezcla, una longitud de onda en el intervalo de 450-600 nm se puede utilizar. Fotoexcitación densidades adecuadas están en el rango de 10-100 mW / mm 2. Nota: pulsos cortos de luz (por debajo de 10 a 20 ms) resultan en una despolarización transitoria de la célula, mientras que con la iluminación prolongada (cientos de milisegundos o pulsos más largos) se observa una hiperpolarización sostenida hasta que la luz se apaga. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Los pasos críticos del protocolo reportado para in vitro estimulación óptica de células concierne principalmente la elección del polímero sensible a la luz, los parámetros de esterilización térmica, la intensidad y la duración de los estímulos luminosos. Un P3HT: película delgada PCBM fue seleccionado aquí, ya que garantiza una buena estabilidad temporal y electroquímica. Sin embargo, hay que notar que no todos los polímeros sensibles a la luz pueden ofrecer interpretaciones analógicas, 22<...

La posibilidad de manipular la actividad celular con una resolución espacial y temporal precisa representa una estrategia clave en la investigación neurocientífica y en el tratamiento de trastornos neurológicos y psiquiátricos. 1 Los métodos tradicionales se basan en la estimulación eléctrica de las células utilizando electrodos colocados en la proximidad o en contacto con el sistema de destino, 2 que puede ser de diferente complejidad (una sola célula, red celular, rodajas de cerebro, in vivo tejidos cerebrales). Durante el siglo pasado, el uso de patch-clamp, metal y electrodos de sustrato integrado han proporcionado una imagen detallada de la fisiología y la fisiopatología de las neuronas individuales y de los mecanismos de funcionamiento de las redes neuronales. Sin embargo, la estimulación eléctrica sufre de limitaciones importantes. La primera de ellas está relacionada con una generalmente pobre resolución espacial debido a las dimensiones físicas de los electrodos y su geometría fija, que no se pueden adaptar fácilmentea los sistemas organizados complejos como los tejidos biológicos. Además, los problemas relacionados con la impedancia de los electrodos y de la diafonía entre los sistemas de estimulación y de registro se pueden deteriorar la relación final de señal a ruido de las mediciones. 3 Por otro lado, el uso de la luz para la estimulación puede ayudar a superar muchas limitaciones del enfoque eléctrica. En primer lugar, ofrece espacial sin precedentes (&lt;1 m) y la resolución temporal (&lt;1 ms), por lo que es posible dirigir tipos de células específicas e incluso compartimentos de células sub. Además, es altamente no invasivo ya que evita cualquier contacto físico con el tejido de interés y desenreda la estimulación de grabación. Además, tanto la intensidad de luz de longitud de onda y se pueden regular con precisión y por lo tanto diversos protocolos de estimulación se pueden aplicar. 3,4 Sin embargo, la gran mayoría de las células animales no presentan ninguna sensibilidad específica a la luz. Varias estrategias para stimulatio óptican por lo tanto se han propuesto, ya sea explotando mediadores moleculares sensibles a la luz cerca o dentro de las células, o el uso de dispositivo de fotoactivo colocado externamente, cerca de la célula. La primera categoría se refiere a los mecanismos endógenos como el estímulo a través de (IR) de luz visible o infrarroja, así como el uso de cualquiera de los compuestos fotoisomerizables / fotoescindible o la expresión genética de los actuadores moleculares fotosensibles (optogenética). La última clase incluye técnicas para la estimulación exógena logrado con el uso de nano / micro-partículas inorgánicas o sustratos de silicio fotoconductores. 5 Sin embargo, todos estos sistemas tienen lados brillantes e inconvenientes. En particular, la absorción endógena de las células en el rango visible es débil y no fiable, y la generación concomitante de especies reactivas de oxígeno puede ser perjudicial para la célula. En general, IR se utiliza para inducir el calentamiento térmico local debido a la absorción de agua, pero el coeficiente de extinción de agua es pequeño, por lo que requiere stluz infrarroja rong (de decenas a cientos de W / mm 2), que es difícil de administrar a través de la óptica del microscopio estándar y puede plantear problemas de seguridad para aplicaciones en vivo. Por otra parte, los compuestos de introducción en jaulas foto-conmutable tienen una acción limitada en el tiempo y, a menudo requieren de luz UV que es difícil de entregar debido a la penetración de tejido limitado. Además sufren de problemas de difusión de los compuestos activados sobre la fotólisis fuera de la zona iluminada. Por último, las herramientas de optogenética han permitido a los científicos para apuntar subpoblación celular específica y sub-compartimientos y están emergiendo rápidamente como una de las tecnologías clave en la investigación neurocientífica. Sin embargo, la inserción de un segmento de ADN exógeno a través de un vector viral plantea problemas de seguridad importantes, sobre todo en vista de la adopción en pacientes humanos. 5,6 Por estas razones, la investigación sobre nuevos materiales y dispositivos capaces de manipulación óptica celular es un tema muy caliente. Recientemente, una novela, se ha propuesto enfoque basado en el uso de polímeros conjugados sensibles a la luz, capaces de transducir eficientemente un estímulo óptico en una modulación de la actividad eléctrica celular. La estimulación de células por Polymer fotoexcitación (CSPP) técnica explota muchas características clave que permite típica de los semiconductores orgánicos: son intrínsecamente sensible a la luz en el rango visible; 7 que son biocompatibles, suave y conformable, y su flexibilidad mecánica permite una interfaz íntimo con el tejido tanto in vitro e in vivo 8-10. Aparte de eso, pueden ser fácilmente funcionalizados para adaptarse mejor a la interfaz con las células vivas, y para permitir la excitación específica, sondeo y detección de capacidades. 11,12 Además, soporte electrónico, así como el transporte iónico, lo que es ideal para la combinación del anuncio de la electrónica de la biología. 13,14 Curiosamente, pueden trabajar en modo fotovoltaico, evitando la necesidad de aplicar un sesgo f exterioro la estimulación óptica celular eficiente. 15 La fiabilidad de la técnica CSPP se ha demostrado previamente en varios sistemas, incluyendo las neuronas primarias, 15,16 astrocitos, 17 líneas de células secundarias 18 y los tejidos de la retina explantadas. 16 En este trabajo, todas las medidas necesarias para fabricar un bio-polímero sensible a la luz interfaz 19 para la estimulación óptica de los sistemas in vitro se describen en detalle. Como caso de estudio, una mezcla fotovoltaica orgánica prototípico de la región regulares poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), que funciona como el donador de electrones, y éster fenil-C61-butírico-ácido-metilo (PCBM), que actúa como el se emplea aceptor de electrones. A medida que el sistema biológico, se usan células embrionarias humanas de riñón (HEK-293). Se proporciona un ejemplo de un protocolo fotoestimulación con la grabación relativa de la actividad celular a través de mediciones electrofisiológicas. La plataforma descritaSin embargo, es de validez general, y se puede extender fácilmente a la utilización de otros polímeros conjugados (ajustando correctamente el proceso de solución de la preparación y los parámetros de deposición), diferentes tipos de células (cambiando adecuadamente el protocolo de cultivo celular, procedimiento y tiempo solicitado chapado para la siembra y la proliferación celular) y diferentes protocolos de estimulación (longitud de onda de luz, de frecuencia estímulos y duración, densidad fotoexcitación).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Las células pueden ser fácilmente cultivadas en P3HT: PCBM sustratos, siempre que una capa de adhesión se deposita adecuada (como la fibronectina utilizado en la etapa 3.2 del protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorción óptica en la parte verde del espectro visible; Sin embargo, otros polímeros conjugados sensibles a la luz se pueden seleccionar, de acuerdo con el rango de longitudes de onda de fotoestimulación preferida (Figura 2). Biocompatibilidad de est...

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Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K vistas.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Video: Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Investigación

Genética

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Bioingeniería

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Oro nanorod asistida estimulación óptica de las células neuronales

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Neurociencias

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic location. To achieve this, we co-transfected cells with nuclear-targeted cAMP sensors and our laboratory-developed optogenetic protein, bacterial photoactivatable adenylyl cyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, when stimulated with 445 nm light or luciferase substrates, generates adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (cAMP). We employed a solid-state laser illuminator connected to a point scanning system that allowed us to create a grid/matrix pattern of small illuminated spots (~1 &#181;m2) throughout the cytoplasm of HC-1 cells. By doing so, we were able to effectively track the distribution of nuclear-targeted bPAC-nLuc and generate a comprehensive cAMP response map. This map accurately represented the cellular distribution of bPAC-nLuc, and its response to light stimulation varied according to the amount of protein in the illuminated spot. This innovative approach contributes to the expanding toolkit of techniques available for investigating cellular optogenetic proteins. The ability to map its distribution and response with high precision has far-reaching potential and could advance various fields of research.

This protocol involves transfecting cAMP sensors and bPAC-nLuc, an optogenetic protein, to accurately track its cellular distribution and response to light stimulation. The innovative approach of creating a cAMP response map using a point scanning system holds the potential for advancing research with optogenetic proteins in different fields.