El protocolo optogenético estandarizado está diseñado para laboratorios interesados en usar la luz como estímulo para controlar las propiedades celulares en sistemas celulares de mamíferos diseñados. Este protocolo es fácil de implementar en laboratorios que de otro modo no estarían familiarizados con la optogenética y proporciona métodos para el control temporal espacial preciso de sistemas biológicos diseñados. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones en áreas de investigación específicas donde la información espaciotemporal puede ser importante, incluida la biología del cáncer, la biología de sistemas y la diferenciación de tejidos.
Para empezar, seleccione los componentes genéticos para combinar que se unen en un solo circuito genético o plásmido. Por ejemplo, sitios de integración de ADN de mamíferos, elementos sensibles a la luz o genes funcionales. Después de ensamblar y examinar todas las características necesarias, como codones de inicio, secuencias regulatorias o traducidas, utilice cualquier software de ingeniería genética y clonación molecular, anote y almacene las secuencias de ADN para su uso posterior y como referencia.
Valide los cebadores computacionalmente para la construcción de plásmidos a través de las características integradas del software de clonación molecular, por ejemplo, la alineación de secuencias. Para generar una línea celular estable, transfecte los circuitos genéticos de diseño y las células deseadas utilizando una mezcla de liposomas del ADN del circuito génico con la recombinasa adecuada. Después de que las células sean de 80 a 100% confluentes, congele las células en una mezcla de 45% de medios antiguos, 45% de medios frescos y 10% de DMSO.
Transfiera las células restantes a un tubo estéril y realice una clasificación de una sola célula para aislar las células monoclonales en una placa de 96 pocillos. Aproximadamente dos o tres semanas después de la clasificación monoclonal, los pozos dentro de la placa de 96 pocillos deben tener focos. Cuando se logra una confluencia del 50 al 60%, divida las células en una placa de 12 pocillos.
Agregue el firmware al circuito LPA ensamblado utilizando un programador de microcontroladores. A continuación, combine las piezas impresas en 3D en la placa de circuito ensamblada utilizando la placa de montaje, la placa de circuito, el espaciador LED, el adaptador de placa, una placa de 24 pocillos, una tapa de placa, pernos de montaje, tuercas de ala y componentes de apilamiento. Para comenzar un experimento optogenético, utilice el software Iris disponible en el sitio web de Tabor Lab para programar una tarjeta SD para el LPA y explorar las condiciones de luz apropiadas.
A continuación, introduzca los valores de intensidad con las réplicas técnicas para el esquema experimental deseado. Agregue aproximadamente 75, 000 células por pozo en una placa negra de 24 pocillos en un volumen total de 500 microlitros, luego coloque las células en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono para permitirles asentarse durante dos a seis horas. Después de transferir las células en la campana de cultivo de tejidos al final de la incubación, retire la tapa de plástico y agregue una tira de lámina adhesiva a la parte superior de la placa para minimizar la transferencia de luz entre los pozos para que la luz solo pueda ingresar a través del LED ubicado en la parte inferior del pozo.
Coloque la placa en las partes 3D instaladas del LPA, luego cubra la placa con la tapa LPA impresa en 3D que se ajusta sobre los tornillos del dispositivo en cada esquina. Conecte el dispositivo a la fuente de alimentación y presione el botón de reinicio en el dispositivo LPA para asegurarse de que se aplique la configuración actualizada del experimento LPA e incube las células. Después de la incubación, dentro de la campana de cultivo de tejidos, retire la tira de papel de aluminio de la placa y deje que la placa repose durante uno o dos minutos para evitar que se forme condensación en la tapa de plástico.
A continuación, vuelva a colocar la tapa de plástico original en la placa y obtenga imágenes de las células con el contraste de fase apropiado o el microscopio de fluorescencia. Después de 24 a 72 horas después de la inducción, seguida de tripsinización, transfiera todo el contenido de cada pozo de aproximadamente 500 microlitros a los tubos etiquetados equipados con el colador celular. Luego, utilizando el software de instrumento de citometría de flujo apropiado, cree una puerta de dispersión hacia adelante y hacia afuera para capturar las células individuales del tamaño y la granularidad apropiados para excluir los desechos y los grupos celulares.
Una vez que se establece la puerta, capture aproximadamente 10, 000 celdas con la puerta adecuada y ajuste el número de celdas según la cantidad de datos celulares requeridos y repita la captura de células experimentales en cada tubo. Después de la inducción y la tripsinización, transfiera todo el contenido de cada pocillo de aproximadamente 500 microlitros a los tubos etiquetados. Centrifugar las células durante cinco minutos a 400 veces G.Después de desechar el sobrenadante, mueva las muestras a una campana de humos químicos.
Resuspender las células en 750 a 1,000 microlitros de 4% PFA diluidos en PBS y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper los grupos celulares. Después de 15 minutos de incubación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros de PBS y nuevamente pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego pegue las células durante cinco minutos a 400 veces G a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, mueva las muestras a una campana de humos químicos y resuspenda las células en 750 a 1, 000 microlitros de metanol helado como se ha demostrado y permita que las células se asienten durante 30 minutos en un congelador de menos 20 grados centígrados.
Después de la incubación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros de PBS mientras pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, después de centrifugar las células durante cinco minutos a 400 veces G, deseche el sobrenadante y mueva las muestras a una campana de humos químicos. Resuspender las células en 100 microlitros u otra dilución adecuada del anticuerpo primario marcado y pipetear hacia arriba y hacia abajo de seis a ocho veces, luego incubar durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, agregue de 750 a 1, 000 microlitros del tampón de incubación y la solución de pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces, luego centrifugue las células durante cinco minutos a 400 veces G.A continuación, resuspenda las células en 500 microlitros de PBS y rompa los grupos mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera todo el contenido de cada tubo a tubos etiquetados con coladores de células. Lleve las células a instrumentos de citometría de flujo apropiados con láseres de las longitudes de onda correctas.
La calibración óptica se realizó para los dispositivos. Utilizando la imagen adquirida, se calcularon los valores de compensación para el LED, se restó la señal de fondo y se dedujo la intensidad de los píxeles. El coeficiente de variación fue mínimo entre 96 pozos.
El software de calibración demostró la variación del LED por ubicación y creó un ajuste de escala de grises para que cada LED se normalice a la misma intensidad. La expresión génica se indujo en células más ligeras diseñadas a través de microscopía de fluorescencia a diferentes duraciones de pulso de luz en el LPA y las células se tomaron imágenes para la expresión de Brightfield y GFP. Usando citometría de flujo, las células fueron inducidas a diferentes valores de longitud de pulso y mostraron una respuesta a la dosis de expresión génica cuantificada a nivel de la población de más de cuatro veces el cambio de los estados no inducidos.
La retroalimentación negativa logró una reducción del ruido de expresión génica de más de cinco veces, como se muestra al comparar varios valores de intensidad de luz para el sistema más ligero versus vívido o ligero encendido. El análisis de qPCR mostró que las células más ligeras diseñadas expresaron los niveles de ARN de una manera sensible a la dosis con más de diez veces la inducción de estados no inducidos, coincidiendo con la cuantificación de citometría de flujo. El circuito genético más ligero diseñado mostró cantidades crecientes de luz azul que resultaron en un aumento de los niveles de proteína KRAS y niveles de ERK fosforilados.
Se pueden realizar varios ensayos funcionales, incluidos los ensayos de crecimiento, motilidad celular, cicatrización de heridas, proliferación o invasión. Estos métodos podrían proporcionar información específica sobre los mecanismos de la biología del cáncer, la diferenciación de tejidos o la resistencia a los medicamentos.
