We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Los medaka japoneses utilizados en este estudio fueron tratados con humanidad de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Toyo, con la debida consideración para el alivio de la angustia y el malestar. 1. La plata nanocoloides (SNC) <ol><li> Compra SNC purificada (20 mg / L -1, 99,99% de pureza, partícula significa diámetro de aproximadamente 28,4 ± 8,5 nm en suspensión en agua destilada). </li><li> Validar la pureza y la concentración de la plata por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) análisis según el manual de funcionamiento 8. El método de pretratamiento para ICP-MS análisis se describe en la sección 7. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones (SNC mezclas de plata de Coloides y Ag +) con diferentes salinidades <ol><li> Preparar 60 × ERM que consiste en 60 g de NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g de CaCl2 · 2H 2 O, y 9,78 g MgSO4 · 7H 2 O en 1 L de ULTrâpure agua; ajustar el pH a 7,0 con 1,25% de NaHCO3 en agua ultrapura. </li><li> Se agita la solución ERM a 25 ° C durante la noche. </li><li> Mezclar SNC con el MTC diluida. Preparar 40 ml de cada solución mixta SNC-MTC. La concentración final es de 10 mg / L -1 de SNC en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o). </li><li> Ajustar el pH de la solución mixta SNC-ERM a 7,0 con 0,625% de NaHCO3 en agua ultrapura. ajuste de pH es muy importante en la preparación de la solución de SNC, porque la liberación de Ag + es facilitado por las condiciones ácidas 9. </li><li> Utilice AgNO 3 como compuesto de referencia para SNC. <ol><li> Mezclar AgNO3 con el MTC diluido. Preparar 40 ml de AgNO 3 -ERM solución mixta a una concentración de AgNO 3 de 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 plata) en diferentes concentraciones de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, o 30x) . Nota: Para examinar la toxicidad coloide de plata, AgNO3solución, que es una fuente de plata soluble, se utiliza como compuesto de referencia para SNC, que son una mezcla de coloides de plata y plata soluble. </li></ol></li></ol> 3. Cultura Medaka y la recolección de huevos <ol><li> Obtener el medaka (O. latipes) (cepa de color naranja-rojo) (60 machos y 60 hembras). </li><li> Cultura medaka como grupos (20 hombres y 20 mujeres como un grupo) en ERM 1x en 3 tanques L mediante el uso de un sistema de cultivo de flujo a través medaka. <ol><li> Cultura en las siguientes condiciones: intervalo de pH del medio de cultivo: 6.2 a 6.5 ciclo de luz: oscuridad: 16: 8 hr la temperatura del medio de cultivo: 24 ± 0,5 ° C la presión osmótica del medio de cultivo: 257 mOsm </li></ol></li><li> Alimentar medaka en nauplios de Artemia salina a las 10:00 (una vez al día) y alimentar a una dieta artificial pescado seco a las 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (cinco veces al día). <ol><li> Obtener A. nauplios salina. </li> &lt;li&gt; Prepare 5 L de una solución de sal de 3,0% en un vaso de precipitados de plástico. </li><li> Añadir 30 g de huevos de camarón de salmuera a la solución de sal en el vaso de precipitados. </li><li> Incubar los huevos a 25 ° C durante 48 horas con burbujeo (4 L / min -1) utilizando una bomba de aireación. </li><li> Después de 48 horas, detener la propagación. </li><li> Deje reposar la solución durante 5 a 10 minutos para separar el tramado A. nauplios salina (parte baja de la solución) de los huevos no eclosionados y cáscaras de huevo (parte superior de la solución). </li><li> Eliminar la capa superior de la solución por decantación. </li><li> Se filtra la parte inferior de la solución a través de un tamiz con aberturas de 283 micras, y recoger los nauplios que pasan a través de una red con aberturas de 198 micras. </li><li> Alimentar a los nauplios de los medaka dentro de 6 horas. </li></ol></li><li> Tras el medaka femeninos han dado lugar, retire las masas de huevos externos suavemente de los cuerpos de las hembras o recoger los huevos de la parte inferior del tanque de peces mediante el uso de un smtodo neta (net tamaño de 5 cm x 5 cm, tamaño de orificio de 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Enjuague el cúmulo de huevo con un chorro de agua del grifo durante 5 seg. </li><li> Añadir todas las masas de huevos enjuagados con solución ERM 30x. </li><li> Retire los racimos de la solución después de 1 min y colocar las masas de huevos entre toallas de papel secas y girar suavemente. </li><li> Poner los huevos de nuevo en el MTC 30x. </li><li> Seleccionar huevos fecundados bajo un microscopio de disección. </li><li> Lugar seleccionado 810 huevos en el MTC 1x en seis pocillos de plástico mediante el uso de fórceps. </li><li> Se incuban los huevos a 25 ± 0,1 ° C en una incubadora hasta la etapa de desarrollo 21. (Etapas de desarrollo de los embriones medaka se definen a partir de la obra de Iwamatsu 10). </li><li> Escoja huevos incubados a 21 etapa de desarrollo bajo un microscopio de disección. </li><li> Enjuague los huevos seleccionados por el MTC 1x. </li><li> Someter los huevos enjuagados a experimentos de exposición (sección 4). </li></ol> 4. Ensayos de Toxicidad SNC o AgNO3 </sub&gt; A diferentes salinidades ERM <ol><li> Enjuague huevos de medaka (etapa 21) tres veces con solución de ensayo [SNC (10 mg / L -1) o AgNO 3 (15,7 mg / L -1 como 10 mg / L -1 plata) en cada concentración de ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, o 30x) a pH 7]. Como controles, utilice huevos en 1 × a 30 × MTC a pH 7. </li><li> Añadir 15 huevos enjuagados con 5 ml de cada solución de ensayo en seis pocillos de plástico. (Realizar los experimentos de exposición a tres veces por SNC o AgNO3 toxicidad pruebas utilizando cada solución de ensayo). </li><li> Envolver las placas en papel de aluminio. </li><li> Se incuban las placas envueltas a 25 ° C en la oscuridad hasta su nacimiento o durante 14 días. </li><li> Observar los huevos expuestos cada 24 horas para los cambios biológicos y los huevos muertos (Figuras 1 y 2). </li><li> Intercambiar las soluciones de ensayo cada 24 horas. </li><li> Realizar observaciones de la siguiente manera. <ol><li> En el día 6 de la exposición, contar el ritmo cardíaco (por 15 sec) of embriones medaka bajo un microscopio de disección mediante el uso de un cronómetro (Figura 3a). </li><li> En el día 6 de la exposición, medir el tamaño de los ojos (diámetro) de embriones de medaka bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3b). </li><li> En el día de la eclosión, medir las longitudes de cuerpo completo de larvas bajo un microscopio de disección usando un micrómetro (Figura 3c). </li><li> Contar el número total de huevos que eclosionan expuestos durante los 14 días (Figura 3d). </li></ol></li></ol> 5. Aislamiento de solubles de plata de la solución SNC, y Análisis de plata <ol><li> Aislar plata soluble a partir de cada solución de SNC (una mezcla de coloides de plata y plata soluble) por filtración a través de un filtro de membrana de 3 kDa a 14.000 x g y 4 ° C durante 10 min. Use un filtro de membrana de 3 kDa para aislar la plata soluble a partir de las segundas comunicaciones nacionales, debido a que el diámetro medio de conexiones de subred informado agregados en el MTC 1x es de 67,8 nm 11 unand la de Ag + es 0,162 nm 12; la membrana 3 kDa excluye partículas con diámetros de 2 nm o más 13. </li><li> Medir la concentración de plata en 50 l de solución filtrada (= la concentración de plata soluble) por ICP-MS análisis (Figura 3e) de acuerdo con el manual operativo ICP-MS 8. El método de pretratamiento para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7. </li></ol> 6. Medición de la plata de bioacumulación en medaka embriones <ol><li> Exponer los huevos de medaka (etapa 21) para conexiones de subred o AgNO3 como se describe en la sección 4. </li><li> En el día 6 de exposición, retire corion del huevo (es decir, dechorion) mediante el uso de medaka incubar enzima de acuerdo con el protocolo descrito en el libro Medaka 14. </li><li> Medir la concentración de plata de los huevos dechorioned por análisis ICP-MS de acuerdo con la ICP-MS Manual de instrucciones 8 (Figura 3f). El pretratamientométodo para la ICP-MS análisis se describe en la sección 7. </li></ol> 7. Medición de la concentración de plata por ICP-MS Análisis <ol><li> Añadir muestras [50 l de solución de plata (para la validación de la concentración de plata, la sección 1); tres embriones dechorionated (sección 5); o 50 l de solución filtrada (sección 5)] a un vaso de precipitados de teflón de 50 ml. </li><li> Añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura al vaso de precipitados de 50 ml. </li><li> Se calienta la mezcla sobre una placa caliente a 110 ° C hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas). </li><li> Para disolver la materia orgánica por completo, añadir 2,0 ml de ácido nítrico ultrapura y 0,5 ml de peróxido de hidrógeno al vaso de precipitados. </li><li> Se calienta la mezcla de nuevo en el plato caliente hasta justo antes de que se seque (aproximadamente 3 horas). </li><li> Disolver el residuo en 4 ml de solución de ácido nítrico 1,0% ultrapura. </li><li> Transferencia de 4 ml de solución a un tubo de centrífuga. </li><li> Repita 07/06 a 07/07 dos veces (un total de tres veces). El volumen final es 12,0ml. </li><li> Medir la concentración de plata de la muestra (disuelto en ácido nítrico ultrapuro 1,0%) mediante el uso de análisis ICP-MS de acuerdo con el manual de funcionamiento 8. <ol><li> Utilice una interna y una solución de patrón externo (Ver Lista de Materiales) para cuantificar la concentración de plata. La solución estándar interna y externa está acreditado por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorios (A2LA). Los límites de detección de la plata eran 0,0018 ng / ml-1 (solución) y 0,016 ng mg peso -1 (el cuerpo del embrión). </li></ol></li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Coastal Condition Report. , (2001).</li><li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka,+Oryzias+latipes.">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li><li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+(Oryzias+latipes)+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites.">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li><li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+(Oryzias+latipes).">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , (2006).</li><li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka,+Oryzias+latipes.">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , (2007).</li><li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions.">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES &amp; T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li><li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos.">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li><li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides.">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li><li>Wakamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Medaka es un pez de agua dulce que es altamente tolerante al agua de mar; no es bien sabido que el hábitat natural original de este pez era agua salada de la costa japonesa 6. Por lo tanto, los peces medaka tienen bien desarrollado células de cloruro de 7. Esta propiedad única proporciona a los científicos una nueva manera de probar la toxicidad de los productos químicos en el medio ambiente como una función de la salinidad (agua dulce al agua de mar) mediante el uso de una sola especie de pe...

Desde el establecimiento de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo directrices de ensayo (OCDE) para las sustancias químicas de prueba en 1979, 38 directrices de ensayo se han publicado en la Sección 2 de las directrices, los efectos sobre los sistemas bióticos 1. Todos los organismos acuáticos objeto de ensayo han sido de hábitats de agua dulce, es decir, plantas de agua dulce; algas; invertebrados como las dafnias y quironómidos; y peces como el pez cebra, medaka, y la trucha arco iris. En comparación con los entornos de agua salada, ambientes de agua dulce están más directamente afectados por las actividades económicas e industriales humanos. Por lo tanto, ambientes de agua dulce se han priorizado para la prueba, ya que están en mayor riesgo de contaminación. En las zonas costeras, incluidos los estuarios, salinidades varían entre las condiciones del agua y el agua de mar salobre, y estas áreas son contaminados por la actividad industrial 2. Las zonas costeras y sus humedales asociados se caracterizan por hIGH biodiversidad ecológica y la productividad. Por lo tanto, los ecosistemas costeros deben ser protegidos de la contaminación química. Sin embargo, se ha limitado la investigación ecotoxicológico en hábitats de agua y agua de mar salobre. Sakaizumi 3 estudió las interacciones tóxicas entre el mercurio de metilo y la salinidad en los huevos de medaka japoneses y se encontró que el aumento de la presión osmótica de la solución de prueba aumentó la toxicidad del mercurio de metilo. . Sumitani et al 4 utilizaron huevos de medaka para investigar la toxicidad de los lixiviados de vertedero; encontraron que la equivalencia osmótica de los lixiviados de los huevos fue la clave para la inducción de anomalías durante la embriogénesis. Además, Kashiwada 5 informó que las nanopartículas de plástico (39,4 nm de diámetro) fácilmente permeado a través del corion medaka huevo en condiciones salobres (15x embrión crianza media (MTC)). Un típico modelo pequeño pescado, el medaka japoneses (Oryzias latipes </em&gt;) se ha utilizado en biología básica y ecotoxicología 6. Medaka japoneses pueden vivir en condiciones que van desde agua dulce al agua de mar debido a sus células de cloruro altamente desarrollados 7. Son por lo tanto probable que sea útil para probar en condiciones con una amplia gama de salinidades.

<table><tbody><tr><td>Silver nanocolloids</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;) orange-red strain</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka flow-through culturing system</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii eggs</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>aeration pump</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Artificial dry fish diet</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plastic plates</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stopwatch</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa membrane filter</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml centrifugal-type filter</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Teflon beaker</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>For internal standard</td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>For external standard</td></tr><tr><td>ultrapure nitric acid</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide&amp;nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>for atomic absorption spectrometry</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

La salinidad es una característica importante del medio acuático. Para los organismos acuáticos que define los hábitats de agua dulce, agua salobre y agua de mar. Análisis de la toxicidad de los productos químicos y la evaluación de sus riesgos ecológicos para los organismos acuáticos se realizan con frecuencia en agua dulce, pero la toxicidad de los productos químicos para los organismos acuáticos depende del pH, la temperatura y la salinidad. , No hay ningún método, sin embargo para probar la dependencia de la salinidad de la toxicidad para los organismos acuáticos. En este caso, hemos utilizado medaka (Oryzias latipes), ya que pueden adaptarse al agua dulce, agua salobre y agua de mar. Diferentes concentraciones de medio de embrión de cría (MTC) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x y 30x) se emplearon para probar la toxicidad de las partículas nanocolloidal plata (SNCs) a Medaka huevos (MTC 1x y 30x MTC tienen presiones osmóticas equivalente de agua dulce y salada, respectivamente). En placas de seis pocillos de plástico, 15 huevos de medaka, por triplicado fueron expuestos a SNC a 10 mg / L &amp;# 8722; 1 en diferentes concentraciones de ERM a pH 7 y 25 ° C en la oscuridad. Se utilizó un microscopio de disección y un micrómetro para medir la frecuencia cardíaca por 15 seg y el ojo de diámetro en el día 6 y la longitud de todo el cuerpo de las larvas en el día de nacimiento (sección 4). Se observaron los embriones hasta la eclosión o el día 14; a continuación, nos contó el porcentaje de eclosión todos los días durante 14 días (sección 4). Para ver la acumulación de plata en los embriones, hemos utilizado acoplado inductivamente espectrometría de masas con plasma para medir la concentración de plata de soluciones de ensayo (sección 5) y embriones dechorionated (sección 6) .La toxicidad de las conexiones de subred a los embriones de medaka obviamente incrementado con el aumento de la salinidad. Este nuevo método nos permite probar la toxicidad de los productos químicos en diferentes salinidades.

El efecto de la salinidad sobre la toxicidad SNC era muy evidente: la inducción de la deformidad o la muerte dependía de salinidad (Figuras 1 y 2). Medimos biomarcadores fenotípicas (frecuencia cardíaca, el tamaño del ojo, la longitud de todo el cuerpo, y la tasa de eclosión) en el SNC (10 mg / L -1) -exposed embriones. Estos biomarcadores fenotípicas revelaron toxicidad SNC salinidad-dependiente. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

salinity-dependent-toxicity-assay-silver-nanocolloids-using-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.9K vistas.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

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Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Método ecotoxicológico con bacterias marinas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Evaluar la Toxicidad Aguda de los Contaminantes Ambientales

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Investigación

Medio ambiente

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Biología del Desarrollo

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong antimicrobial effects. They also may be released into the environment and accumulate in the ocean. Therefore, AgNPs are the major source of Ag contamination, and public awareness of the environmental toxicity of Ag is increasing. Previous studies have demonstrated the bioaccumulation (in producers) and magnification (in consumers/predators) of Ag. Cetaceans, as the apex predators of ocean, may have been negatively affected by the Ag/Ag compounds. Although the concentrations of Ag/Ag compounds in cetacean tissues can be measured by inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS), the use of ICP-MS is limited by its high capital cost and the requirement for tissue storage/preparation. Therefore, an autometallography (AMG) method with an image quantitative analysis by using formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue may be an adjuvant method to localize Ag distribution at the suborgan level and estimate the Ag concentration in cetacean tissues. The AMG positive signals are mainly brown to black granules of various sizes in the cytoplasm of proximal renal tubular epithelium, hepatocytes, and Kupffer cells. Occasionally, some amorphous golden yellow to brown AMG positive signals are noted in the lumen and basement membrane of some proximal renal tubules. The assay for estimating the Ag concentration is named the Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), which is a regression model established by the data from image quantitative analysis of the AMG method and ICP-MS. The use of AMG with CHAA to localize and semi-quantify heavy metals provides a convenient methodology for spatio-temporal and cross-species studies.

A protocol is presented to localize Ag in cetacean liver and kidney tissues by autometallography. Furthermore, a new assay, named the cetacean histological Ag assay (CHAA) is developed to estimate the Ag concentrations in those tissues.

Uso de Autometallography para localizar y plata semi-cuantificar en cetáceos tejidos

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal toxicity test is frequently used in regulatory risk assessment of chemicals. In order to achieve high reliability and reproducibility the development of standardized guidelines is vital. For algal toxicity testing, the guidelines require stable and uniform conditions of parameters such as pH, temperature, carbon dioxide levels and light intensity. Nanomaterials and other so-called difficult substances can interfere with light causing a large variation in results obtained hampering their regulatory acceptance. To address these challenges, we have developed LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). The setup utilizes LED illumination from below allowing for a homogenous light distribution and temperature control while also minimizing intra-sample shading. The setup optimizes the sample volume for biomass quantification and does at the same time ensure a sufficient influx of CO2 to support exponential growth of the algae. Additionally, the material of the test containers can be tailored to minimize adsorption and volatilization. When testing colored substances or particle suspensions, the use of LED lights also allows for increasing the light intensity without additional heat generation. The compact design and minimal equipment requirements increase the possibilities for implementation of the LEVITATT in a wide range of laboratories. While compliant with standardized ISO and OECD guidelines for algal toxicity testing, LEVITATT also showed a lower inter-sample variability for two reference substances (3,5-Dicholorophenol and K2Cr2O7) and three nanomaterials (ZnO, CeO2, and BaSO4) compared to Erlenmeyer flasks and microtiter plates.

We demonstrate algal toxicity testing for difficult substances (e.g., colored substances or nanomaterials) using a setup illuminated vertically with an LED.

Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

Química

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Biología

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicina

Batería de pruebas de comportamiento para evaluar los efectos neurotóxicos en el pez cebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor destacado: Evaluación de los cambios de comportamiento ambientales e inducidos por drogas en el pez cebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Ensayo de toxicidad dependiente de la salinidad del Plata nanocoloides Usando Medaka huevos

Resumen

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Capítulos en este video

Método ecotoxicológico con bacterias marinas

El tratamiento de drogas y

Uso de Autometallography para localizar y plata semi-cuantificar en cetáceos tejidos

Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

Evaluación de la Neurotoxicidad en Danio rerio Adulto mediante una Batería de Pruebas de Comportamiento en un Tanque Único

Evaluación de la Neurotoxicidad en Danio rerio Adulto mediante una Batería de Pruebas de Comportamiento en un Tanque Único

Evaluación de la Neurotoxicidad en Danio rerio Adulto mediante una Batería de Pruebas de Comportamiento en un Tanque Único