We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

本研究で用いたメダカは、苦痛や不快感の軽減に配慮し、東洋大学の制度ガイドラインに従って人道的に処理しました。 1.シルバーナノコロイド（SNCが） <ol><li>精製されたのSNCを購入した（20mg / L -1、純度99.99％、粒子は、蒸留水に懸濁28.4±8.5 nm程度の直径を意味します）。 </li><li>誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により、銀の純度および濃度を検証するには、取扱説明書8に記載の分析します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。 </li></ol> SNCソリューション異なる塩分と（シルバーコロイドとAg +の混合物）の調製<ol><li> 60グラムのNaCl、1.8グラムのKCl、2.4グラムののCaCl 2・2H 2 O、およびULTの1L中9.78グラムのMgSO 4・7H 2 Oからなる60×ERMを準備rapure水;超純水中の1.25％NaHCO 3でpHを7.0に調整します。 </li><li>一晩25℃でのERMソリューションをかき混ぜます。 </li><li>希釈したERMとのSNCを混ぜます。各SNC-ERM混合溶液40mlを準備します。最終濃度は、ERMの異なる濃度でのSNCの10 mg / Lで-1である（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍）。 </li><li>超純水中の0.625パーセントのNaHCO 3で7.0にSNC-ERM混合溶液のpHを調整します。 Ag +放出は酸性条件9により促進されるため、pH調整は、SNCの溶液を調製する際に非常に重要です。 </li><li> SNCのための参照化合物としてのAgNO 3を使用してください。 <ol><li>希ERMとのAgNO 3を混ぜます。 15.7 mg / LでのAgNO 3濃度でのAgNO 3 -ERM混合溶液の40ミリリットルを準備-1 ERMの異なる濃度で（10 mg / Lで-1銀）（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、または30倍） 。 注：銀コロイド毒性を調べるために、 硝酸銀可溶性銀の供給源である溶液を、銀コロイドと可溶性銀の混合物であるのSNCのための参照化合物として使用されます。 </li></ol></li></ol> 3.メダカ文化と卵の収穫<ol><li>メダカ（O.のメダカ ）（橙赤色株）（60人の男性と60人の女性）を取得します。 </li><li>メダカフロースルー培養系を用いて、3 Lタンク内の1倍ERMで（1グループとして20人の男性と20人の女性）グループなどの文化メダカ。 <ol><li>以下の条件での文化： 培養液のpH範囲：6.2〜6.5 光：暗サイクル：16：8時間 培養液の温度：24±0.5°C 培地の浸透圧：257ミリオスモル</li></ol></li><li> （1日5回）（一日一回）10:00にアルテミア・サリナノープリウスにメダカをフィードし、午前9時、11時、午前13時、午後03時、および17時に人工乾燥魚食を食べます。 <ol><li> Aを得ました。サリナノープリウス。 </li> &lt;LI&gt;プラスチックビーカー中の3.0％塩溶液の5 Lを準備します。 </li><li>ビーカー内の塩溶液にブラインシュリンプの卵の30グラムを追加します。 </li><li>曝気ポンプを用いて、（4 L /分-1）を吹き込みながら48時間、25℃で卵をインキュベートします。 </li><li> 48時間後、バブリングを停止します。 </li><li>解決策は、斜線のA.を分離するために5〜10分間放置します未孵化卵や卵の殻（溶液の上部）からサ ​​リナノープリウス（溶液の下部）。 </li><li>デカンテーションにより溶液の上層を削除します。 </li><li> 283ミクロンの開口部を有するふるいを通してソリューションの下部をフィルタし、198ミクロンの開口部がネット上を通過ノープリウスを収集します。 </li><li> 6時間以内にメダカにノープリウスを養います。 </li></ol></li><li>女性のメダカが生み出した後、メスの体からそっと外部卵クラスタを削除するか、SMを使用して水槽の底から卵を集めますすべてのネット（正味サイズ5センチメートル×5センチ、穴の大きさ0.2ミリメートルX 0.2ミリメートル）。 </li><li> 5秒間水道水を流しながら卵のクラスタをすすぎます。 </li><li> 30倍ERM溶液にすすぎ卵クラスターのすべてを追加します。 </li><li> 1分後に溶液からクラスタを削除して、乾いたペーパータオルとロールとの間に卵のクラスタを配置します。 </li><li> 30倍ERMに戻って卵を入れてください。 </li><li>解剖顕微鏡下で受精卵を選択します。 </li><li>鉗子を用いて、6ウェルプラスチックプレートに1×ERMで選択した810卵を置きます。 </li><li> 21.発達段階までインキュベーター中に25±0.1℃で卵をインキュベート（メダカ胚の発達段階は岩松10の仕事から定義されていました。） </li><li>解剖顕微鏡下で発達段階21でインキュベートした卵を取り出します。 </li><li> 1倍ERMで選択した卵をすすぎます。 </li><li>曝露実験（セクション4）にすすいで卵をかけます。 </li></ol> 4.毒性のSNCの試験または硝酸銀 </sub&gt;別のERMの塩分で<ol><li>メダカの卵をすすぐ（ステージ21）試験溶液[SNCは（10 mg / Lの-1）または硝酸銀で3回ERMの各濃度（1×、5×で（15.7 mg / Lで-1は10mg / L -1銀など） 、10倍、15倍、20倍、または30倍）pH7の]。対照として、pH7で30×ERMに1×で卵を使用しています。 </li><li> 6ウェルプラスチックプレートの各試験溶液5mlに15すすい卵を加えます。 （各試験液を使用してSNCかのAgNO 3毒性試験のための露光実験三回実行）。 </li><li>アルミホイルでプレートを包みます。 </li><li>孵化するまで、または14日間暗所で25℃で包まれたプレートをインキュベートします。 </li><li>生物学的変化と死んだ卵のために露出卵ごとに24時間を守って（ 図1および図 2）。 </li><li>試験溶液を24時間毎に交換します。 </li><li>次のように観測を行います。 <ol><li>曝露の6日目に、O（15秒ごとに）心拍数を数えますストップウォッチ（ 図3a）を用いて、解剖顕微鏡下でのFメダカ胚。 </li><li>曝露の6日目に、マイクロメーター（ 図3b）を使用して、解剖顕微鏡下でメダカの胚の眼の大きさ（直径）を測定します。 </li><li>孵化日に、マイクロメーター（ 図3c）を使用して、解剖顕微鏡下で幼虫のフルボディの長さを測定します。 </li><li> 14日（ 図3d）の上に孵化露出した卵の総数をカウントします。 </li></ol></li></ol> 5. SNC溶液からの可溶性銀の単離、およびシルバー分析<ol><li> 14,000 xで3 kDaの膜フィル​​ターを通して濾過することにより、各SNC液（銀コロイドと可溶性銀の混合物）から水溶性銀を分離 gで10分間4°C。 1×ERM中の凝集のSNCの報告平均直径は67.8 nmの11であるため、SNCのから水溶性銀を分離するために3 kDaの膜フィルターを使用しますNDのAg +のそれは0.162 nmの12です。 3 kDaの膜が2nm以上13の直径を有する粒子を除外します。 </li><li> ICP-MS取扱説明書8に記載の ICP-MS分析（ 図3E）により濾過した溶液の50μl中銀濃度（=可溶性銀濃度）を測定します。 ICP-MS分析のための前処理方法は、項7に記載されています。 </li></ol>メダカ胚におけるシルバー生物蓄積の6.測定<ol><li>セクション4で説明したようにSNCのかのAgNO 3にメダカの卵（ステージ21）を公開します。 </li><li>曝露の6日目に、 メダカブック 14に記載のプロトコルに従って酵素を孵化メダカを用いて、卵（ すなわち 、dechorion）から絨毛膜を除去します。 </li><li> ICP-MS取扱説明書8（ 図3F）に応じてICP-MS分析によりdechorioned卵の銀濃度を測定します。前処理ICP-MS分析のための方法は、第7章に記載されています。 </li></ol> ICP-MS分析による銀濃度の7.測定<ol><li> （;セクション1の銀濃度の検証のための）サンプル[銀溶液50μlを追加します。 3 dechorionated胚（第5節）。または50ミリリットルのテフロンビーカーに濾過した溶液を50μl（セクション5）]。 </li><li> 50ミリリットルのビーカーに超純硝酸の2.0ミリリットルを追加します。 </li><li>それは（約3時間）乾く直前まで110℃のホットプレート上で混合物を加熱します。 </li><li>完全に有機物を溶解するために、ビーカーに超純硝酸と過酸化水素の0.5ミリリットルの2.0ミリリットルを追加します。 </li><li>それは（約3時間）乾く直前までホットプレート上で再び混合物を加熱します。 </li><li> 1.0％超高純度の硝酸溶液4mlに残留物を溶解します。 </li><li>転送遠心チューブに溶液4ml。 </li><li> （3回の合計）を2回7.7から7.6を繰り返します。最終容量は12.0ですミリリットル。 </li><li>取扱説明書8に記載のICP-MS分析を用いて（1.0％超純粋硝酸に溶解した）サンプルの銀の濃度を測定します。 <ol><li>内部および外部の標準液を使用して銀濃度を定量化するために（ 物質 一覧を参照してください）。内部および外部標準溶液は米国試験所認定協会（A2LA）の認定を受けています。銀の検出限界は0.0018 ng / mlで-1（溶液）と0.016 ngのMG-重量-1（胚体）でした。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Coastal Condition Report. , (2001).</li><li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka,+Oryzias+latipes.">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li><li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+(Oryzias+latipes)+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites.">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li><li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+(Oryzias+latipes).">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , (2006).</li><li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka,+Oryzias+latipes.">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , (2007).</li><li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions.">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES &amp; T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li><li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos.">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li><li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides.">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li><li>Wakamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

メダカは、海水に対して非常に寛容である淡水魚です。よくこの魚の本来の自然の生息地は、日本の沿岸6オフ海水だったことは知られていません。したがって、メダカは塩化セル7よく発達してきました。このユニークなプロパティは、魚の単独種のみを使用して、塩分（海水への淡水）の関数として、環境中の化学物質の毒性を試験するための新しい方法で科学者を提供し?...

1979年の試験化学物質のための経済協力開発機構（OECD）の試験のガイドラインについては組織の設立以来、38テストガイドラインはガイドライン、生物的システム1への影響の第2節で公開されています。テストした水生生物のすべては、淡水の生息地、すなわち淡水植物からなっています。藻類;このようなミジンコやユスリカなど無脊椎動物。そして、このようなメダカ、ゼブラフィッシュ、およびニジマスなどの魚。塩水環境と比較して、淡水環境はより直接的に人間の経済・産業活動の影響を受けています。彼らは汚染からリスクが高いので、したがって、淡水環境は、テストのために優先順位付けされています。 河口などの沿岸地域では、塩分は汽水や海水条件の間で変動し、これらの領域は、多くの場合、産業活動2によって汚染されています。沿岸地域とそれに関連する湿地は、時間によって特徴付けられます生態系の生物多様性と生産性IGH。沿岸の生態系は、したがって、化学物質汚染から保護されなければなりません。しかし、汽水、海水の生息地での限られた環境毒性学の研究がなされてきました。 Sakaizumi 3は、日本のメダカの卵中のメチル水銀と塩分との間に毒性の相互作用を研究し、試験溶液の浸透圧を増加させることがメチル水銀の毒性を増強することを見出しました。炭谷ら 4は、埋立地浸出水の毒性を調べるために、メダカの卵を使用。彼らは卵への浸出水の浸透等価が胚形成中に異常を誘発するための鍵であることがわかりました。また、柏田5は、プラスチック製のナノ粒子（直径39.4 nm）と簡単に塩気の条件の下でメダカ卵の漿膜（15X胚飼育培地（ERM））を透過していることを報告しました。 典型的な小魚モデル、日本のメダカ（ メダカ </emは&gt;）基礎生物学および生態毒性6で使用されてきました。日本のメダカは、その高度に発達した塩化セル7の淡水から海水までの条件で生きることができます。したがって、それらは、塩分の広い範囲の条件で試験するために有用である可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Silver nanocolloids</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;) orange-red strain</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka flow-through culturing system</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii eggs</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>aeration pump</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Artificial dry fish diet</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plastic plates</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stopwatch</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa membrane filter</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml centrifugal-type filter</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Teflon beaker</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>For internal standard</td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>For external standard</td></tr><tr><td>ultrapure nitric acid</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide&amp;nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>for atomic absorption spectrometry</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

塩分は水生環境の重要な特徴です。水生生物にとっては、淡水、汽水、海水の生息地を定義します。化学物質や水生生物への生態リスクの評価の毒性のテストは頻繁に淡水で実行されますが、水生生物への化学物質の毒性はpH、温度、および塩分濃度に依存します。何の方法は、水生生物への毒性の塩分濃度依存性を試験するために、しかし、ありません。彼らは淡水、汽水、海水に適応することができますので、ここでは、メダカ（ メダカ）を用いました 。胚飼育培地（ERM）の異なる濃度は、（1倍、5倍、10倍、15倍、20倍、および30倍）が卵をメダカする銀ナノコロイド粒子（SNCが）の毒性を試験するために使用した（1×ERMと30X ERMは、浸透圧相当を持っています）は、それぞれ、淡水と海水へ。 6ウェルプラスチックプレートでは、三連で15メダカの卵は、10mg / L＆でのSNCにさらされました＃8722;暗所でpH7のERMの異なる濃度で1〜25°C。 私たちは、日（セクション4）の孵化に6日目に15秒、眼の直径あたりの心拍数と幼虫のフルボディの長さを測定するために解剖顕微鏡やマイクロメーターを使用していました。胚を孵化または14日目まで観察されました。私たちは、その後、14日（第4章）のために毎日孵化率を数えました。胚における銀の蓄積を確認するために、我々は銀のテスト・ソリューション（第5節）の濃度とdechorionated胚（セクション6）明らかに増加塩分濃度とともに増加したメダカ胚へのSNCの選択図毒性を測定するために、誘導結合プラズマ質量分析法を使用していました。この新しい方法は、異なる塩分中の化学物質の毒性を試験することを可能にします。

SNCの毒性に対する塩分の影響は非常に明白であった：奇形や死の誘導は、塩分濃度依存（ 図1および図 2）でした。我々は（10 mg / Lで-1）-exposed胚SNCで表現型のバイオマーカー（心拍数、アイサイズ、フルボディの長さ、および孵化率）を測定しました。これらの表現型のバイオマーカーは、塩分濃度依存SNC毒性を明らか?...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

salinity-dependent-toxicity-assay-silver-nanocolloids-using-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K ビュー.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

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Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

海洋細菌の生態毒性学的方法<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt;環境汚染物質の急性毒性を評価する

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

環境学

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

発生生物学

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong antimicrobial effects. They also may be released into the environment and accumulate in the ocean. Therefore, AgNPs are the major source of Ag contamination, and public awareness of the environmental toxicity of Ag is increasing. Previous studies have demonstrated the bioaccumulation (in producers) and magnification (in consumers/predators) of Ag. Cetaceans, as the apex predators of ocean, may have been negatively affected by the Ag/Ag compounds. Although the concentrations of Ag/Ag compounds in cetacean tissues can be measured by inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS), the use of ICP-MS is limited by its high capital cost and the requirement for tissue storage/preparation. Therefore, an autometallography (AMG) method with an image quantitative analysis by using formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue may be an adjuvant method to localize Ag distribution at the suborgan level and estimate the Ag concentration in cetacean tissues. The AMG positive signals are mainly brown to black granules of various sizes in the cytoplasm of proximal renal tubular epithelium, hepatocytes, and Kupffer cells. Occasionally, some amorphous golden yellow to brown AMG positive signals are noted in the lumen and basement membrane of some proximal renal tubules. The assay for estimating the Ag concentration is named the Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), which is a regression model established by the data from image quantitative analysis of the AMG method and ICP-MS. The use of AMG with CHAA to localize and semi-quantify heavy metals provides a convenient methodology for spatio-temporal and cross-species studies.

A protocol is presented to localize Ag in cetacean liver and kidney tissues by autometallography. Furthermore, a new assay, named the cetacean histological Ag assay (CHAA) is developed to estimate the Ag concentrations in those tissues.

ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal toxicity test is frequently used in regulatory risk assessment of chemicals. In order to achieve high reliability and reproducibility the development of standardized guidelines is vital. For algal toxicity testing, the guidelines require stable and uniform conditions of parameters such as pH, temperature, carbon dioxide levels and light intensity. Nanomaterials and other so-called difficult substances can interfere with light causing a large variation in results obtained hampering their regulatory acceptance. To address these challenges, we have developed LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). The setup utilizes LED illumination from below allowing for a homogenous light distribution and temperature control while also minimizing intra-sample shading. The setup optimizes the sample volume for biomass quantification and does at the same time ensure a sufficient influx of CO2 to support exponential growth of the algae. Additionally, the material of the test containers can be tailored to minimize adsorption and volatilization. When testing colored substances or particle suspensions, the use of LED lights also allows for increasing the light intensity without additional heat generation. The compact design and minimal equipment requirements increase the possibilities for implementation of the LEVITATT in a wide range of laboratories. While compliant with standardized ISO and OECD guidelines for algal toxicity testing, LEVITATT also showed a lower inter-sample variability for two reference substances (3,5-Dicholorophenol and K2Cr2O7) and three nanomaterials (ZnO, CeO2, and BaSO4) compared to Erlenmeyer flasks and microtiter plates.

We demonstrate algal toxicity testing for difficult substances (e.g., colored substances or nanomaterials) using a setup illuminated vertically with an LED.

ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

化学

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

生物学

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

医学

成体ゼブラフィッシュの神経毒性影響を評価するための行動試験バッテリー

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

著者スポットライト:成体ゼブラフィッシュにおける環境および薬物誘発性行動変化の評価 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

要約

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海洋細菌の生態毒性学的方法

薬物治療と

ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

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薬物治療と

ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana

ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダニオ・レリオの神経毒性評価