Este proyecto fue financiado por subvenciones del Ministerio de Educación de Singapur (MOE, el número de concesión 2013-T2-2-126) y el Instituto Nacional de Salud, EE.UU. (NIH, el número de concesión 1R21AT008452-01A1). TY recibió una beca de postgrado del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Singapur. Agradecemos a la unidad confocal del Centro de Ciencias de la Universidad Nacional de Singapur para Bioimagen (CBIS) por su apoyo constante.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con protocolos Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) aprobados de la Universidad Nacional de Singapur (R14-293). 1. Pescado Ganadería y la recogida de embriones <ol><li> Elevar WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HSE: PPC 24, y OSX: 21 mCherry simple o compuesto peces medaka transgénico a 26 ° C bajo un ciclo de luz controlada (14 h de luz, 10 h oscuridad) para inducir el desove. </li><li> desove tiene lugar todos los días durante los primeros 30 minutos después de que la luz se enciende. Los huevos se pegan entre sí a través de filamentos y se unen al abdomen de la hembra durante varias horas. Utilice una red de malla fina para atrapar una mujer adulta que lleva un racimo de huevos. Deje que los peces descansar brevemente en la red y luego masajear suavemente el abdomen del pescado para pelar cuidadosamente el clúster óvulo fertilizado desde el abdomen de la hembra. NOTA: Una mujer sana medakapuede producir 10 - 20 huevos por día durante aproximadamente 5 meses. </li><li> Coloque los huevos en una placa Petri de plástico de 60 mm. Usar una pipeta de plástico para enjuagar los embriones con 5 a 10 ml de de 0.3x Danieau medio solución de (pescado; NaCl 19,3 mM, KCl 0,23 mM, 0,13 mM MgSO 4, mM Ca 0,2 (NO 3) 2, y 1,7 mM HEPES, pH 7.0). Añadir 1 ml de una 0,25% (w / v) de solución de azul de metileno de la a 2,5 L de medio de pescado para prevenir el crecimiento de hongos. </li><li> rodar suavemente clúster huevo para formar un nudo de filamentos de fijación. El uso de fórceps para retirar cuidadosamente los filamentos de unión de las masas de huevos fertilizados para obtener embriones individuales (Figura 1A). </li><li> Organizar los embriones de acuerdo con Iwamatsu 2004 13. </li><li> Cultura 20 - 30 embriones por 60 mm placa Petri de plástico en un 28 ° C incubadora. Cambiar el medio a diario para garantizar el desarrollo normal de los embriones. NOTA: El tiempo de vuelta de la fase de eclosión (8 - 9 d después de la fecundación,DPF) es especialmente crítico para la supervivencia. Retire chorions de libre flotación para mantener limpio el medio y para asegurar buenas tasas de supervivencia de las larvas. </li></ol> 2. selección de embriones transgénicos <ol><li> Utilice un estereomicroscopio equipado con una lámpara de mercurio de imágenes de fluorescencia y GFP, RFP, y los filtros de la PPC para detectar embriones transgénicos para la expresión del indicador fluorescente utilizando magnificación de 40X. </li><li> Identificar visualmente OSX: mCherry embriones por la expresión del indicador mCherry en la temprana formación de los huesos craneales, como el cleithrum, en ambos lados de la cabeza posterior (Figura 1B, flecha), y el parasphenoid, en una posición central en el cráneo ventral ( la Figura 1B, punta de flecha). NOTA: la expresión del indicador comienza a partir de 5 DPF 21 en adelante. </li><li> Identificar ctsk: nlGFP embriones por fuerte expresión nlGFP en la cabeza (Figura 1C, flecha) y la cola (Figura 1C, punta de flecha), a partir de6 DPF. NOTA: los osteoclastos endógenos sólo se forman después del 21 de DPF. Las células en esta etapa temprana (6 DPF) nlGFP-expresión de los osteoclastos no son sino otra, hasta ahora no caracterizada, ctsk células positivas 24. </li><li> Identificar RANKL: HSE: PPC embriones transgénicos por la expresión ubicua PPC después de un tratamiento a corto choque de calor durante 20 minutos a 39 ° C, llevado a cabo en 2 DPF o posterior para fines de selección. NOTA: El RANKL y la PPC transgenes están bajo el control del mismo choque elemento de calor bidireccional (HSE). PPC expresión indica la inducción exitosa RANKL 24. </li><li> Realizar un 1,5 - tratamiento de choque térmico de 2 horas a 9 DPF o posterior para inducir a un gran número de osteoclastos ectópicos en la región del tronco, que en consecuencia resulta en un fenotipo similar a la osteoporosis 24. NOTA: RANKL expresión transgénica inducida a los 9 resultados DPF en una activación ectópica de células progenitoras de osteoclastos latentes, que forma endógena no se desencadenaantes del 21 de DPF. Use un baño de agua para obtener 39 ° C Condiciones estables. Deje que los embriones de medaka placa de Petri que contienen flotan en la superficie del agua. Asegúrese de que la tapa de la caja de Petri es seco para evitar el hundimiento del plato. </li><li> Embriones de pantalla de líneas compuestas, tales como RANKL: HSE: PPC / ctsk: nlGFP doble transgénico y OSX: mCherry / RANKL: HSE: PPC / ctsk: nlGFP triple transgénico, de acuerdo con el patrón de expresión de cada transgén individual. NOTA: embriones transgénicos hemicigotos y homocigotos se distinguen por diferentes niveles de fluorescencia del transgén reportero. embriones homocigóticos tenían una intensidad de fluorescencia que aproximadamente se duplicó en comparación con la de los transgénicos hemicigotos. Líneas de compuestos que son homocigotos para ambos RANKL: HSE: PPC y ctsk: nlGFP fueron obtenidos por incrossing repetido durante varias generaciones. Para triple transgénico OSX: mCherry / RANKL: HSE: PPC / ctsk: peces nlGFP,<html> RANKL homocigotos: HSE: PPC / ctsk: peces nlGFP se cruzaron con OSX homocigotos: mCherry portadores. La progenie de triple transgénicos heterocigotos resultante se plantearon y incrossed para obtener embriones homocigotos para RANKL: HSE: PPC. El RANKL: HSE: PPC transgén debe ser homocigótico con el fin de obtener la inducción eficiente de los osteoclastos ectópicos. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55025/55025fig1.jpg" /> Figura 1: WT y transgénicos medaka embriones a las 7 D después de la fecundación (DPF). A. embriones WT observaron con iluminación de campo claro. B. Embriones transgénicos que muestran OSX: expresión mCherry alrededor del cleithrum (flecha) y parasphenoid (punta de flecha). C. Embriones transgénicos que muestran expresión ctsk: nlGFP en la cabeza (flecha) y la cola (punta de flecha). Barras de escala: 500 m.025 / 55025fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. El tratamiento con bisfosfonatos de Medaka larvas <ol><li> Se preparan soluciones que contienen diferentes concentraciones de bifosfonatos (BPS) para los estudios de dosis-respuesta. NOTA: El BP ejemplar utilizado en este protocolo es el alendronato. <ol><li> Disolver alendronato en medio de pescado a una concentración de 100 mg / ml para preparar una solución madre. </li><li> Utilice un mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. La solución madre, a 4 ° C. </li><li> Preparar diferentes soluciones de trabajo por dilución de la solución madre con medio de pescado a una serie de concentraciones (es decir, 25, 37,5, 50, 62,5, y 75 mg / ml). NOTA: Diferentes fármacos pueden tener diferentes, distribución, metabolismo y parámetros (ADME) Absorción de excreción, que deben tenerse en cuenta durante las pruebas usando este sistema larvas medaka. Además, la solubilidad del fármaco y la estabilidad pueden variar si seaplicado como una solución acuosa. compuestos solubles en agua menor que tenga que ser disuelto primero en disolventes orgánicos, tales como DMSO. En este caso, una solución de reserva se prepara en DMSO, que luego se diluyó adicionalmente en un medio de pescado. Tenga en cuenta que las soluciones de trabajo en el agua (medio de pescado) se pueden almacenar en la nevera durante varias semanas. Sin embargo, las soluciones que contienen DMSO se deben almacenar a temperatura ambiente para evitar la cristalización. </li></ol></li><li> Transferencia medaka larvas en placas de seis pocillos (seis larvas / pocillo) para su posterior tratamiento BP (alendronato). </li><li> Eliminar el medio de pescado con cuidado usando una pipeta de plástico limpio y añadir un volumen pequeño (aprox. 0,5 ml) de solución de alendronato a cada pocillo. </li><li> Evitar medio de pescados de sobra, como podría ser diluida la solución BP añadido, que es especialmente crítico para las soluciones de alendronato menos concentrada. </li><li> Retirar un pequeño volumen de solución de alendronato (hasta 0,5 ml) de cada pocillo con una pipeta de plástico limpio y sustituirla por una mayor volume (4 ml) de solución de alendronato. </li><li> Cambie medio diario para garantizar el desarrollo normal de embriones. </li></ol> 4. La tinción vivo de matriz mineralizada-hueso <ol><li> Disolver 0,5 g de alizarina complexona (ALC; ácido alizarina-3-metiliminodiacético) o 0,05 g de calceína en 50 ml de medio de pescado para preparar 1% y 0,1% de soluciones madre, respectivamente. Utilice un mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. NOTA: medio Fish sin la adición de azul de metileno se utiliza en este y en los pasos subsiguientes para reducir la autofluorescencia en las larvas. </li><li> Utilice un filtro de jeringa y de un solo uso (0,2 m) para filtrar la solución de tinción. Almacenar la solución filtrada en la oscuridad a temperatura ambiente. NOTA: El color de la solución de tinción filtrada, claro ALC es de color amarillo oscuro a naranja. El color de la solución filtrada calceína, claro es de color amarillo brillante. Las soluciones pueden ser utilizadas para varios meses. </li><li> Se diluye la solución filtrada ALC o calceína Stock 1:10 en medio de pecese incubar la larva medaka durante 1,5 - 2 h (0,1% de solución de ALC) o 2 - 2,5 h (solución de calceína 0,01%) en un 28 ° C incubadora si se utilizan larvas de entre 9 y 17 DPF. Mantener las muestras en la oscuridad. </li><li> Transferir las larvas al medio pescado fresco con una pipeta de plástico limpio. </li><li> Retire el medio de pescado con una pipeta de plástico limpia y se añade medio de pescado fresco. Repita este paso para 3 - 4 veces hasta que hay una solución rojas o de color amarillo manchado (ALC o calceína, respectivamente) son sobras. Deja las larvas en medio de pescado durante 30 - 60 min antes de su montaje para formación de imágenes para evitar epifluorescencia a partir del medio. NOTA: 0,1% de solución de tinción ALC es perjudicial para las larvas de medaka para tiempos de exposición prolongados. tiempos de incubación de más de 2 h afectan a la supervivencia de las larvas. por lo tanto, necesitan ser optimizados para las diferentes etapas con el fin de lograr la supervivencia del embrión y tinción resultados óptimos concentración y tiempo de tinción. </li></ol> 5. vivo la imagen de fluorescencia </<html> p&gt; <ol><li> Anestesiar a las larvas medaka con 0,01% Tricaína (etil metanosulfonato de 3-aminobenzoato) en medio de los peces. NOTA: anestesiados larvas se convierten en inmovilizada después de 5 - 10 minutos en solución Tricaína y por lo general están mintiendo, ya sea en sus lados o la espalda. </li><li> Use un microloader plástico para orientar las larvas de acuerdo a la región de interés. La orientación de las larvas utilizado en este protocolo es lateral. </li><li> Use un microscopio estereoscópico con iluminación de fluorescencia para la imagen. Utilice una gran ampliación al tomar imágenes, centrándose en diferentes partes de las larvas (cabeza, tronco anterior, posterior del tronco y cola). Cosa imágenes individuales juntos en regiones solapadas utilizando un software de procesamiento de imágenes adecuado (inserciones en la figura 3G). NOTA: Esto ayuda a mejorar la calidad de imagen de todas las partes del cuerpo correspondientes en el plano focal correcta. </li><li> Devolver las larvas al medio de pescado para la recuperación después de la formación de imágenes. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Vive Imagen confocal <ol><li> Anestesiar a las larvas con un 0,01% Tricaína en medio de pescado durante 5 - 10 minutos a hasta que se convierten inmovilizada. </li><li> Disolver bajo punto de fusión de agarosa al 1,5% en medio de pescado por calentamiento en un horno microondas. Enfriar esta solución a aproximadamente 30 ° C. </li><li> Añada 0,5 - 1 ml de líquido de 1,5% de agarosa de baja fusión en medio de pescado a una placa de Petri con fondo de vidrio. Transferir las larvas anestesiado en la solución con una pipeta de plástico limpio. NOTA: Tome precauciones especiales que la temperatura de la agarosa de bajo punto de fusión líquido es lo suficientemente bajo para no dañar las larvas. </li><li> Antes de que los solidifica de agarosa, utilizar un microloader plástico para empujar las larvas a la parte inferior de la placa de Petri y orientar las larvas de acuerdo con la región de interés. La orientación de las larvas utilizado en este protocolo es lateral. NOTA: Las muestras están listas para imágenes en vivo confocal después de la agarosa solidifica por completo. </li><li> Utilizar un microscopio confocal para ACQUIRE imágenes. </li><li> Utilice una línea de láser de 543 nm para el análisis y mCherry ALC tinción. Utilice una línea de láser de 488 nm para nlGFP y analiza la tinción de calceína. </li><li> Después de formación de imágenes, se añade medio de los peces a la placa de Petri y el uso de un par de finas agujas de jeringa (27 G x 1 ½ &quot;) para eliminar cuidadosamente las larvas de la agarosa. Transferencia de las larvas con residualmente adjunto de agarosa para una placa de Petri con medio de pescado para recuperar . </li><li> Procesar las imágenes usando un software de análisis de imagen 27. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o financieras.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Es esencial que las condiciones para el tratamiento de choque térmico son consistentes y estables cuando se comparan diferentes muestras. Condiciones de temperatura estables garantizan niveles similares de la inducción de RANKL en las larvas transgénicas y, en consecuencia, la formación de osteoclastos comparable, que puede ser confirmada por la detección de ctsk: expresión nlGFP. En última instancia, esto conduce a un grado similar de la...

El esqueleto de los vertebrados proporciona soporte estructural y la protección de órganos, permite la movilidad, y sirve como una fuente de calcio. A lo largo de la vida, la matriz ósea extracelular se gira constantemente a mantener la estabilidad del hueso y la rigidez. Este proceso requiere la actividad estrechamente coordinada y la interacción de los osteoblastos que forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los osteoblastos se derivan a partir de progenitores mesenquimales multipotentes y producen colágeno para formar el osteoide, la parte proteica de la matriz ósea 10. Los osteoblastos interactúan con los osteoclastos para lograr una actividad equilibrada de ambos tipos de células, que se requiere para el control de la homeostasis ósea 7. Debido a estas interacciones reguladoras intrincados, las respuestas al tratamiento de drogas y la homeostasis ósea no pueden ser examinadas utilizando plenamente los estudios in vitro. Por lo tanto, existe una fuerte demanda de los modelos animales. En comparación con la configuración de cultivo de células, en modelos in vivo puede proporcionarinformación valiosa sobre las redes multicelulares en el entorno de los huesos. Existen numerosos modelos de ratón para una variedad de trastornos de los huesos humanos, incluyendo osteoporosis 16. Sin embargo, el tamaño y la accesibilidad de los embriones de ratón representan limitaciones significativas para formación de imágenes en vivo de los procesos esqueléticos. Pequeños peces teleósteos, por otra parte, servir como una alternativa atractiva para formación de imágenes in vivo. El pez cebra (Danio rerio) y medaka (Oryzias latipes) se han convertido en modelos animales populares para la investigación del esqueleto en las últimas dos décadas 17, 19, 22, 24. Bone en peces teleósteos y en los mamíferos es muy similar, tanto en un estructural y en un nivel fisiológico, y muchos de los genes reguladores clave y vías de señalización se conservan 3. Como en los mamíferos, peces teleósteos regular cuidadosamente la actividad de los osteoblastos y osteoclastos para equilibrar la formación de hueso y la resorción 26. Lo más importante, la claridad óptica de fish larvas permite el uso de indicadores fluorescentes para etiquetar las células óseas y de la matriz ósea calcificada 8, 9, 12, 21, 23, lo que facilita la observación de procesos celulares en el animal vivo. Además, una serie de herramientas genéticas se ha generado para facilitar la investigación biomédica relevante en el pescado. Para medaka, en particular, los métodos para la mutación génica dirigida por CRISPR / Cas9 2, de células de linaje rastreo de 6 y específica del sitio transgénesis 14 se han establecido recientemente y ahora son ampliamente en uso 15. Pequeñas larvas de teleósteos se han utilizado con éxito para pantallas químicas, lo que llevó al descubrimiento de varios medicamentos farmacológicamente relevantes 1, 18. Las larvas de peces son tolerantes a bajas concentraciones de DMSO y son capaces de absorber compuestos de su medio ambiente acuático, ya sea a través de la piel o a través del tracto gastrointestinal 1, 5. Nuestro laboratorio previamente representanteorted líneas medaka transgénicos que expresan reporteros fluorescentes en células de hueso bajo el control de diferentes promotores y osteoblast--osteoclastos específico. Estos incluyen los osteoblastos prematuros (10a1 colágeno, Col10a1; osterix, OSX) 20, 21, osteoblastos maduros (osteocalcina, OSC) 27, y los osteoclastos (catepsina K, ctsk) 24. También generó una línea transgénica que expresa el factor de osteoclastos inductor activador del receptor de factor nuclear kappa B ligando (RANKL) bajo el control de un promotor de choque 24 inducible por calor. La inducción de RANKL en este sistema resulta en la formación ectópica de osteoclastos activos. Esto conduce a un aumento de la resorción ósea y una grave fenotipo osteoporosis similar, con reducido drásticamente la mineralización en los cuerpos vertebrales. Recientemente, hemos mostrado que la actividad de los osteoclastos en este modelo puede ser bloqueada por el etidronato y alendronato bifosfonatos, two Los medicamentos que se usan comúnmente en la terapia de la osteoporosis humana, validando así medaka como un sistema modelo adecuado para la osteoporosis 27. Debido a su gran tamaño de la camada, el rápido desarrollo, y el pequeño tamaño de los embriones, larvas medaka transgénico son especialmente adecuado para el cribado a gran escala de medicamentos para la osteoporosis y para el análisis in vivo de la conducta de las células óseas. Los estudios realizados en medaka por lo tanto pueden complementar de manera eficiente experimentos en cultivos celulares y en ratones que tienen como objetivo el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas y nuevas terapias para los trastornos óseos humanos. En el presente estudio, se describe un protocolo para el tratamiento de las larvas de hueso-reportero medaka con el medicamento para la osteoporosis común, alendronato. También describimos en detalle cómo las larvas tratadas están montados y preparados para la formación de imágenes en vivo de la matriz ósea y de células óseas. Estos protocolos pueden ser adaptados fácilmente a otros compuestos químicos pequeños que, o bien el trabajo como anabólico óseo o fármacos antirresortivos. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Alendronate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4978</td><td></td></tr><tr><td>alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone</td><td>Sigma</td><td>A3882</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (1.4.3.67)</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta confocal&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser (4.2.0.121)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html</td></tr><tr><td>Micro-loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Eppendorf ep T.I.P.S 20 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 3.0 software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6 (13.0.0.0)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drug treatment and in vivo imaging of osteoblast-osteoclast interactions in a medaka fish osteoporosis model

Formadoras de hueso osteoblastos interactúan con los osteoclastos de resorción ósea para coordinar la renovación de la matriz ósea y para el control de la homeostasis esquelética. Medaka y larvas de pez cebra se utilizan ampliamente para analizar el comportamiento de las células óseas durante la formación de hueso, degeneración y reparación. Su claridad óptica permite la visualización de las células óseas marcadas con fluorescencia y colorantes fluorescentes unidos a la matriz ósea mineralizada. Nuestro laboratorio ha generado peces medaka transgénicos que expresan el factor de osteoclastos inducir activador del receptor de factor nuclear kappa B ligando (RANKL) bajo el control de un promotor de choque inducible por calor. La expresión ectópica de los resultados de RANKL en el exceso de formación de osteoclastos activados, que pueden ser visualizados en líneas reportero con la expresión nlGFP bajo el control del promotor catepsina K (ctsk). inducción RANKL y la formación de osteoclastos ectópico conduce a graves fenotipos osteoporosis similares. Compuesto li medaka transgénicones que expresan ctsk: nlGFP en osteoclastos, así como mCherry bajo el control del promotor osterix (osx) en osteoblastos prematuros, se pueden usar para estudiar la interacción de ambos tipos de células. Esto facilita la observación in vivo del comportamiento celular bajo condiciones de degeneración ósea y reparación. A continuación, describimos el uso de este sistema para probar un fármaco comúnmente usado en la terapia de la osteoporosis humana y describir un protocolo para la formación de imágenes en vivo. El modelo de medaka complementa estudios en cultivo celular y de los ratones, y ofrece un nuevo sistema para el análisis in vivo de la acción del fármaco en el sistema esquelético.

número de huevos abundantes, así como el pequeño tamaño de las larvas, hacen medaka un modelo excelente para la detección de drogas. Una placa de seis pocillos solo se utilizó para la cultura hasta 36 larvas, lo cual fue suficiente para proporcionar datos estadísticamente significativos. Otra gran ventaja de la utilización de pescado para el análisis del esqueleto es la posibilidad de hacer las imágenes en directo. La transparencia de las larvas de peces permite el uso de proteínas fluorescentes para etiqueta...

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

drug-treatment-vivo-imaging-osteoblast-osteoclast-interactions-medaka

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

9.2K vistas.  National University of Singapore. Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

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Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Biología del Desarrollo

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicina

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Bioingeniería

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de transferencia de genes y<em&gt; In vitro</em&gt; ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Método de ablación láser para estudiar la regeneración ósea en larvas de pez cebra

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using different methods such as fin amputation, scale plucking, skull trepanation, and microscopic approaches. Using a confocal laser scanning setup equipped with a two-photon laser, a laser ablation method was developed as a lesion paradigm to ablate bone-forming cells (osteoblasts) in the developing opercle of zebrafish larvae. The method described here allows the ablation of cells in a precise manner, as the area, shape, and depth can be finely adjusted. In addition, this method allows imaging of the area before and just after the ablation, so that short-term effects of the injury can be analyzed. In this experimental setup, the immune response after ablation of osteoblasts in the injured area was studied. An increase in the recruitment of macrophages was observed after ablation, indicating the relevance of their presence during bone regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Regeneración ósea mediada por el sistema inmunitario: el papel fundamental de los macrófagos y la inmunomodulación controlada en los procesos de r

This protocol describes a two-photon laser ablation approach carried out in zebrafish larvae, which serves as a model to study bone regeneration and the effects of the immune response to ablation.

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

El tratamiento de drogas y

Resumen

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Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Secuencial

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

A Novel

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo