Name: phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli
Uploaded: 2016-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli at JoVE.com

La financiación de este trabajo fue proporcionado por la Fundación Bettencourt Schueller en apoyo del equipo de París Bettencourt iGEM. Agradecemos a la unidad de investigación INSERM U1001 y Chantal Lotton para la asistencia técnica y asesoramiento. Fagémido Litmus28i_J23115-B0032-GFP fue proporcionado por Mónica Ortiz y Drew Endy, de Stanford.

1. Diseño y construcción de vectores fagémidos Teniendo sRNA silenciamiento Casetes <ol><li> De Novo Diseño de sRNA silencios en 8 Casetes <ol><li> Identificar la secuencia completa del mRNA para silenciar utilizando una base de datos secuencia de ADN. Para generar la secuencia diana, tenga en cuenta el primero 24 pb de la secuencia de codificación, de la posición 1 a 24 que comienza con el codón de inicio (por ejemplo, ATG). Nota: El silenciamiento es menos eficiente cuando otros sitios o segmentos del ARNm se dirigen 8. </li><li> Tome el complemento inverso de la secuencia diana para producir la secuencia guía para el casete sRNA. Ver Tabla 1 para ejemplos de secuencias diana y guías para cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). </li><li> Para el diseño del 292 pb casete de expresión sRNA completa, organizar el promotor pR, secuencia GUÍA, Hfq dominio de unión a proteínas y las secuencias de terminación de la transcripción T1 / TE en serie (Tabla 2). </li><li> Añadir sitios de clonación adicionales de elección para facilitar la clonación del casete sRNA en el vector objetivo. </li><li> Obtener la completa casete sRNA a través de la síntesis de genes comercial o un método similar y clonar en cualquier vector fagémido con un origen de replicación f1 funcional 11. Ver información de apoyo para la secuencia completa del vector fagémido final. </li></ol></li><li> La alteración de la secuencia diana por un casete de expresión sRNA existente usando sitio basada en PCR de mutagénesis dirigida al 12 <ol><li> Identificar la secuencia de guía 24 pb en un casete de expresión sRNA existente. Nota: El plásmido pAB.001 anotada, utilizado en este trabajo, está disponible como un archivo de secuencia complementaria. </li><li> Diseño cebadores directos e inversos con regiones cortas de homología con el casete sRNA existente que flanquean la nueva secuencia GUIDE 24 pb. Obtener los cebadores a través de la síntesis de oligonucleótidos comercial. Nota: Diseño de cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio es depicTed en la figura 2. plantilla de secuencias de cebadores exacta se proporcionan en la Tabla 3. </li><li> Preparar un cultivo de 5 ml de E. coli que lleva la plantilla de expresión fagémido sRNA. Cultivar las células durante la noche a 37 ° C con agitación, en medio LB con los antibióticos apropiados. </li><li> Extraer y purificar la expresión fagémido plantilla sRNA de los 5 ml de cultivo bacteriano utilizando un kit miniprep de ADN o método similar 12. </li><li> Preparar dos reacciones de PCR utilizando el fagémido plantilla de expresión sRNA y polimerasa de alta fidelidad, una con el delantero y una con el cebador inverso (Tabla 4). Utilice condiciones de PCR como se recomienda por el suministrador de la polimerasa (Tabla 5). Aumentar la concentración de plantilla para 10-50x más alta que una reacción estándar para tener en cuenta el hecho de que la reacción de un único cebador no produce la amplificación exponencial. </li><li> Combinar las dos reacciones de PCR anteriores en un tubo de microcentrífuga. Anneal los productos por calentamiento a 98 ° C en un baño de agua hirviendo. Inmediatamente después de colocar el tubo de microcentrífuga en el baño de agua, retire la fuente de calor y permitir que el baño para volver lentamente a temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Para eliminar la plantilla no mutada sRNA expresión fagémido, añadir 1 l. enzima de restricción DpnI a la mezcla y se incuba a 37 ° C durante 1 hora, o el tiempo recomendado por el fabricante para la digestión completa. Nota: DpnI digiere sitios diana solamente metilados, que están presentes en fagémidos huésped-replicado pero no los productos de PCR. </li><li> Transform comprados o preparados químicamente competentes E. 13 coli con 1-5 l del producto de PCR recocido. Aislar colonias individuales de la cepa transformada por siembra en medio selectivo en placas de agar LB que contenían antibióticos apropiados. </li><li> Para verificar la incorporación de la secuencia de GUÍA correcta, la pantalla de las colonias resultantes por PCR de colonias. Utilizando una punta de pipeta de 200 l, collect una pequeña cantidad de células a partir de una sola colonia transformada. Mark y preservar la colonia original para su uso aguas abajo después de la verificación. </li><li> Añadir las células recogidas a 50 l de agua libre de nucleasa en un tubo de microcentrífuga. Mezclar pipeteando arriba y abajo. </li><li> El uso de un termociclador de sobremesa o un baño de agua hirviendo, lisar las células por calentamiento a 95 ° C durante 2 min. </li><li> PCR-amplificar la región fagémido usando 1 l de células lisadas con el calor como un molde de ADN. Las condiciones de PCR y protocolos termociclador se proporcionan en las Tablas 6 y 7. Vea el archivo de secuencia de pAB.001 suplementario para las secuencias de cebador de verificación. </li><li> Secuenciar el producto de PCR para verificar la incorporación de la secuencia correcta guía. </li><li> Inocular un cultivo de 5 ml de la E. clon de E. coli que lleva el fagémido expresión sRNA secuencia verificada. Cultivar las células durante la noche a 37 ° C con agitación, en medios LB selectivo. </li><li> Preparar un stock de gliceroldel clon de secuencia verificada. Añadir 750 l de cultivo de la noche a 250 l de glicerol al 60% en un tubo criogénico con tapón de rosca. </li><li> Almacenar las existencias de glicerol a -80 ° C indefinidamente. El resto del cultivo de la noche se puede usar como una fuente para el fagémido expresión sRNA en el paso 2. </li></ol></li></ol> 2. Producción y Cosecha de las poblaciones de fagémidos empaquetados-M13 <ol><li> Preparar un cultivo de 5 ml de E. coli que lleva la expresión fagémido sRNA. Cultivar las células durante la noche a 37 ° C con agitación, en medio LB con los antibióticos apropiados. Nota: La expresión fagémido sRNA se puede obtener a través de novo de clonación tal como se describe en el paso 1.1.5, o modificada a partir de un fagémido existente y se cosecha en el paso 1.2.16. </li><li> Del mismo modo preparar un cultivo de 5 ml de E. coli que lleva el plásmido ayudante M13KO7. Cultivar las células durante la noche a 37 ° C con agitación, en medios LB selectivo. </li><li> Extraer y purificar el expressio sRNAn fagémido y plásmido auxiliar usando un kit de extracción de ADN o método similar 12. </li><li> Cotransform comprado o preparado 13 E. coli químicamente competentes con 1 l de cada uno de sRNA fagémido expresión y plásmido auxiliar. Seleccionar para cotransformants en placas sobre agar LB con antibióticos selectivos para ambas construcciones. </li><li> Preparar un cultivo de 10 ml de una sola colonia de la cepa cotransformed en LB con los antibióticos selectivos. Incubar a 37 ° C con agitación durante 8-12 hr o durante la noche. </li><li> Se centrifuga el cultivo a 3.300 xg durante 10 min. Recoger el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de 0,2 micras. Precaución: En caso de derrame de los medios de comunicación, limpie el área con lejía diluida (0,5%) para destruir las partículas de fago infecciosas. </li><li> Conservar el filtrado de fagémidos empaquetados a 4 ° C. Nota: Las muestras se pueden mantener durante días a semanas sin pérdida de actividad. </li></ol> 3. Preparación de las células F + objetivo para el silenciamiento <ol><li> Determinar si las células que se van dirigidas a silenciar expresan el pilus F 14. Si el pilus F es ya presente, continúe con el paso 4. Nota: las cepas comunes de laboratorio de E. coli anotados como F + o F &#39;para indicar la presencia de la pilus F en su genoma o en un plásmido. </li><li> Obtener una cepa de E. F + coli, tal como TOP10F &#39;. Nota: asegúrese de que la cepa diana lleva un marcador de resistencia único con el fin de ser separado del donante F-plásmido después de la conjugación. </li><li> Para introducir F pilus por conjugación con una cepa F +, preparar 5 ml de cultivos tanto de la cepa diana y donantes F-14 plásmido. Cultivar las células durante la noche a 37 ° C con agitación, en medio LB con los antibióticos apropiados. </li><li> El día siguiente, se diluye ambas cepas 1: 100 en 5 ml de LB selectiva y continuar el cultivo a 37 ° C con agitación. </li><li> Determinar la fase de crecimiento de las células mediante la medición de la optdensidad ical del cultivo a 600 nm (OD 600) usando un espectrofotómetro de mesa. Cultivar las células durante aproximadamente 2 horas hasta una DO600 de 0,3 se alcanza, lo que indica un crecimiento de fase log 15. </li><li> Preparar reacciones 3 Conjugación en tubos de microcentrífuga: 0,5 ml F-plásmido cepa donante + 0,5 ml de destino, 0,5 ml F-plásmido donante + 0,5 ml de medio LB (control negativo) y 0,5 ml cepa diana + 0,5 ml de medio LB (control negativo). Deje que la conjugación transcurriera durante 2 horas a 37 ° C con agitación. </li><li> Placa 100 l de cada reacción de conjugación en agar LB selectivo con antibióticos específicos para el F-plásmido (típicamente tetraciclina) y la tensión de destino. La placa de las reacciones de control negativo para confirmar que ni el donante o cepa receptora expresan ambas resistencias a antibióticos. </li></ol> 4. La infección con fagémidos empaquetados para el silenciamiento <ol><li> Se inocula una sola colonia de células diana F + en un cultivo de 5 ml de LB mediuna con los antibióticos apropiados. Incubar toda la noche a 37 ° C con agitación. </li><li> El día siguiente, diluir las células diana F + 1: 100 en 5 ml de medio LB selectivas y seguir de cultivo a 37 ° C con agitación. </li><li> Determinar la fase de crecimiento de las células mediante la medición de la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) usando un espectrofotómetro de mesa. Cultivar las células durante aproximadamente 2 horas hasta una DO600 de 0,3 se alcanza, lo que indica un crecimiento de fase log 15. Nota: La expresión de la eficiencia y la infección pilus F es más alta en la fase de registro. </li><li> Añadir los fagémidos empaquetados-M13 (de la etapa 2.6) a las células diana en una relación en volumen de 1: 100 para lograr la infección casi 99% de la población objetivo. Permitir que la infección de proceder a 37 ° C con agitación durante 30 a 60 min. </li><li> Ensayo, el fenotipo sRNA-silenciamiento de acuerdo con el método de elección. Nota: Para un objetivo de la proteína fluorescente, el efecto de silenciamiento puede cuantificarsedirectamente por fluorometría 10. Alternativamente, los ensayos fenotípicos pueden ser usados ​​para observar las consecuencias fenotípicas de gen desmontables 8. </li><li> Preparar un stock de glicerol para el anfitrión fagémido sRNA expresar siguientes pasos 1.2.14-1.2.16. Nota: el fagémido se propagará en la cepa huésped indefinidamente y puede ser mantenida con antibiótico similar a un plásmido convencional. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El presente procedimiento logra la reducción de 80% en los niveles de fluorescencia mKate comparación con los controles no orientados. Esto está en línea con otros métodos desmontables ARN, donde no se observa silenciamiento completo y la eficiencia del 50-90% es típico 16,17. A nivel fenotípico, caídas CAT orientados fueron capaces de atenuar de manera significativa la resistencia al cloranfenicol, y eliminarlo bajo algunas condiciones. El desmontables fenotipo detectable a nivel de la población después de sólo unas pocas horas después de la infección (Figura 3B). Esto ilustra una característica importante de suministro basado en el fago: a alta frecuencia desmontables se puede obtener directamente en cultivo discontinuo sin modificación genética previa. A diferencia de las modificaciones genéticas convencionales utilizando la transformación plásmido o integración genómica, la infección por fagos no requiere que una población se re-cultiva a partir de una sola colonia aislada. Esto permite que los efectos de la infección del fago para ser explored en poblaciones con dinámicas espaciales complejas 11, con estructuras espaciales pre-existentes, como biopelículas 18, o en las poblaciones naturales mezclados genéticamente 19. Un paso crítico en este método es la producción de fagémido empaquetados en alto título. La carga metabólica asociada con la producción de partículas de fago puede dar lugar a altas tasas de mutación o pérdida del plásmido en la cepa de producción fagémido. Se recomienda que la cepa de producción de fagémido se cultivó directamente de una sola colonia cotransformed y no refrigerado, congelado o sub-cultivadas antes de la cosecha del fago. A baja eficiencia de co-transformación también se puede observar cuando se introduce el fagémido y ayudante plásmido de E. coli simultáneamente. En este caso, las eficiencias más altas se pueden obtener mediante la transformación del plásmido auxiliar primero, a continuación, la preparación de células competentes que llevan el plásmido auxiliar para la transformación posterior con el fagémido. phagemid infección o expresión sRNA también impone una carga metabólica detectable en las células diana, y pueden dar lugar a alguna perturbación fenotípica. Por ejemplo, se observó una reducción en la fluorescencia mKate2 incluso cuando las células se infectaron con un fagémido orientación CAT (Figura 3). La infección con M13 no se cree que desencadenan respuestas de estrés sistémicos en E. coli 20, pero puede alterar patrones de transcripción indirectamente. Alternativamente, los marcadores GFP o resistencia a la ampicilina incluidos en el fagémido pueden competir por los recursos celulares, la reducción de la expresión y el crecimiento 9 mKate2. Por último, el propio casete sRNA puede alterar globalmente perfiles de expresión génica mediante titulación de la proteína Hfq, o a través de fuera del objetivo silenciamiento de ARNm. Efectos de destino situados son comunes en la orientación in vivo ARNi 21-23, pero que aún no se han investigado sistemáticamente para este sistema. Una limitación de este método es que la infección efieficiencia es menor que 100%, lo que permite algunas bacterias no infectadas a persisten en la población. Los resultados de este trabajo y el trabajo anterior 10 sugieren que las células no infectadas representan 1-10% de la población final, y son responsables de la mayor parte de los fenotipos observados nonsilenced. Se conoce una variedad de rutas a M13-resistencia, con el ser la pérdida de mutaciones más común de la expresión de pilus 24. A la luz de estas limitaciones, los controles deben ser usados ​​para confirmar altas tasas de infección y la eficiencia desmontables. Otra limitación potencial para algunas aplicaciones es la transferencia ocasional de contaminar el fago auxiliar. Aunque M13K07 contiene una señal de empaquetamiento mutada, puede ser empaquetado en la cápside del fago a baja frecuencia y se transfiere a las poblaciones infectadas, lo que resulta en células competentes para la producción de fago y la propagación continua de fago más allá del evento infección inicial 25. Modificaciones al fago auxiliar han demostrado ser eficacesen la reducción de los envases no específica, aunque a veces a costa de la reducción de la producción de fagos 26. Bacteriófago ingeniería se han convertido en una herramienta indispensable para E. la biología sintética coli, lo que permite la entrega rápida de nuevos genes de una población en crecimiento. Trabajos recientes han producido circuitos de comunicación intercelular 11 o expresado factores de transcripción para suprimir la resistencia a los antibióticos vías 27. El protocolo que aquí se presenta se suma a una creciente colección de herramientas que permiten el control de la fisiología bacteriana a través de los ARN programados. Nucleasas CRISPR-cas, cuando mutado para eliminar la actividad nucleasa, se ha demostrado que reprimir la transcripción en objetivos de genes de ARN de guiado 17,28. Por el contrario, sRNA silenciamiento funciona a nivel de traducción y no requiere expresión de la proteína exógena. La próxima generación de biotecnologías pueden unir control de la transcripción y de la traducción con la entrega mediada por fagos para programar fenotipo complejotipos en tiempo real.

caídas de genes de ARN mediada por proceder en dos etapas. En primer lugar, una molécula de ARN se introduce en una línea de célula u organismo de estudio. En segundo lugar, las proteínas de unión a ARN endógenos facilitar el reconocimiento de ARN diana y producen el efecto silenciador. Todas las tecnologías de ARN desmontables se benefician de la naturaleza adaptable de sRNAs sintéticos, que puede ser producido fácilmente para que coincida con un objetivo específico de interés. Sin embargo, los detalles moleculares de la absorción de ARN y silenciamiento varían ampliamente a través de sistema de modelo, lo que limita dónde y cómo caídas de ARN se pueden aplicar. En los nematodos, el ARN de doble cadena (dsRNA) moléculas se puede introducir directamente en los medios o mediante la alimentación de los gusanos con una población de dsRNA-expresión de E. células de E. coli de 1,2. En Drosophila, el ARNi se puede lograr mediante la microinyección de embriones con dsRNA 3, o implementadas en líneas celulares por simple adición de dsRNA al medio de cultivo 4. En líneas celulares de mamíferos,ARN de interferencia pequeños sintéticos (siRNAs) se pueden suministrar a las células vivas mediante electroporación 1,2,5, empaquetado en liposomas 3,6, o expresarse a partir de vectores de plásmidos de ADN de 4,7. Una vez que las especies de ARN alcanza el citosol, la vía de RNAi se basa en el complejo RISC para procesar dsRNA, facilitar el reconocimiento antisentido de la diana, y catalizar la represión de traducción, la degradación de mRNA, o la formación de heterocromatina, dependiendo del huésped. Debido a estos requisitos, clásica ARNi puede ser realizado solamente en los organismos que ocupan ARN exógeno de manera eficiente y expresan RISC o una actividad similar a RISC. En particular, esto excluye el modelo bacteria E. coli, que carece de la vía de RNAi. Sin embargo, los recientes avances en la biología sintética proporcionan las herramientas para resolver tanto el problema de la entrega y el problema silenciamiento. En este protocolo, las construcciones de sRNA se expresan en E. coli a partir de un vector de ADN entregado a living células utilizando el sistema de fagémido / M13 ayudante. Un fagémido es cualquier plásmido con un origen f1 de fago derivados de la replicación. Un plásmido auxiliar, en este caso M13KO, lleva toda la maquinaria necesaria para producir partículas virales, pero no es en sí competente para la replicación y el empaquetamiento. Cuando se co-transformaron un fagémido y el plásmido auxiliar, el fagémido solo se replica en el origen f1, envasa y se secreta. El fagémido vectorizado entonces será competente para infectar E. vivo coli mediante el pilus F. En este sistema, el efecto de silenciamiento es producido por cassettes sRNA cliente combinando una secuencia andamio con una secuencia de unión a la diana. La secuencia de unión a diana es de 24 pares de bases antisentido a un ARNm diana, típicamente en el sitio de unión de ribosomas (RBS). La secuencia andamio, desarrollado por Na y colegas 8, contiene un motivo de unión Hfq extraída del MICC, un pequeño ARN regulador endógeno de E. coli. La proteína Hfq estimula RNA-RNA binding y la degradación del ARNm, que sirve una función en este sistema similar al RISC en RNAi. La Figura 1 muestra un esquema completo para caídas sRNA de fagos mediada, incluyendo la estructura sRNA casete, vectorización fagémido, y el mecanismo de silenciamiento. Como un método para modular la expresión génica en E. coli, sRNA silenciamiento es simple, rápido y versátil. El E. dirigida coli no está cargado más allá de la propagación de la fagémido y expresando la sRNA. Esto puede ser relevante en el contexto de la biología sintética o de investigación básica, donde la expresión de las construcciones más grandes heterólogos puede tensar los recursos celulares 9. Los fagémidos con nuevos objetivos se pueden producir con una sola PCR y se recogieron un día después de la transformación de fagémido. Por último, casi cualquier ARNm puede ser objetivo. El casete de regulación sRNA (en un plásmido estándar) se ha demostrado que trabajar en una variedad de objetivos en el metabolismo con los niveles típicos de represión&gt; 90% 8. 10. En primer lugar, un fagémido empaquetado se introduce en un cultivo discontinuo de E. células de E. coli y se utiliza para silenciar la expresión de la proteína fluorescente mKate2. cambios de fluorescencia posteriores se controlan en tiempo real. En segundo lugar, derribando el gen CAT se muestra para reducir la resistencia fenotípica al cloranfenicol en placas de agar. En ambos casos, el fagémido en sí lleva un marcador GFP, permitiendo que la tasa de infección a medirse independientemente de la eficiencia de caída.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F&#039; Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

caídas de ARN mediada se utilizan ampliamente para controlar la expresión génica. Esta familia versátil de técnicas hace uso de RNA corto (sRNA) que se puede sintetizar con cualquier secuencia y diseñado para complementar cualquier gen diana para silenciamiento. Debido sRNA construcciones pueden introducirse a muchos tipos de células directamente o utilizando una variedad de vectores, la expresión del gen puede ser reprimida en las células vivas sin modificación genética laborioso. tecnología desmontables El ARN más común, RNA de interferencia (RNAi), hace uso de la secuencia de reconocimiento de ARN inducida por silenciar complejo (RISC) para mediar endógeno y la escisión del ARNm diana. Las aplicaciones de esta técnica son, por tanto, limitadas a los organismos RISC que expresan, principalmente eucariotas. Recientemente, una nueva generación de los biotecnólogos de ARN han desarrollado mecanismos alternativos para controlar la expresión génica a través de RNA, y así hecho posibles caídas de genes de ARN mediada en bacterias. Aquí se describe un método para silenciar genes expressión en E. coli que funcionalmente se asemeja a RNAi. En este sistema un fagémido sintético está diseñado para expresar sRNA, que puede diseñado para dirigirse a cualquier secuencia. La construcción de expresión se suministra a una población de E. células de E. coli con el fago no lítico M13, después de lo cual es capaz de replicarse de forma estable como un plásmido. Reconocimiento antisentido y el silenciamiento de ARNm diana está mediada por la proteína Hfq, endógena a E. coli. Este protocolo incluye métodos para el diseño de la sRNA antisentido, construir el vector fagémido, el envasado del fagémido en bacteriófago M13, la preparación de una población de células vivas para la infección, y la realización de la propia infección. La proteína fluorescente mKate2 y el cloranfenicol acetiltransferasa de genes de resistencia a antibióticos (CAT) se orientan a generar datos representativos y cuantificar la eficacia desmontables.

El silenciamiento de mKate2 fluorescencia en medios líquidos La figura 1 representa el esquema de caídas sRNA mediada descritos en este trabajo, incluyendo el diseño sRNA casete, vectorización fagémido, y el mecanismo de silenciamiento. Siguiendo el protocolo 1.2, el casete de silenciar sRNA del plásmido pAB.001 fue alterado para apuntar mKate. El casete sRNA fue sintetizado y clonado en fagémido Litmus28i_J23115-B0032-GFP, un regalo de Mónica Ortiz y Drew Endy 11. Este fagémido lleva marcadores de expresión de GFP y la resistencia a la kanamicina, permitiendo infecciones exitosas para ser rastreados. las existencias de fagémidos empaquetados se prepararon siguiendo el protocolo 2. Un derivado de E. coli K12 MG1655 que lleva un constitutivamente expresado, marcador mKate2 cromosómicamente integrado se preparó para la infección de fagos mediante conjugación<html> con una cepa de plásmido donante F siguiente protocolo 3. Las células fueron cultivadas a mediados de la fase de registro y el fagémido introducido siguiente protocolo 4. Después de la infección de fagémido, cultivos de 200 l se transfirieron a un lector de placas de fluorescencia y la fluorescencia se controló de forma continua durante 24 hr. La Figura 3 muestra el efecto de silenciamiento sRNA mediada por la expresión mKate2. La cepa infectada con un fagémido anti-mKate2 no mostró fluorescencia mKate2 detectable respecto. Por el contrario, esta cepa hizo expresar el marcador de GFP, indicando la absorción exitosa del fagémido. las células de control no infectadas producen mKate2 fluorescencia pero no GFP. Un control adicional, en la que el dominio de dirección anti-mKate2 fue sustituida por una secuencia de direccionamiento CAT, no tuvo efecto sobre la fluorescencia mKate2. El silenciamiento de la resistencia a cloranfenicol en placas de agar contenido &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Siguiendo el protocolo 1.1, un casete de silenciar sRNA fue producido para apuntar CAT Un derivado de E. coli K12 MG1655 que lleva un expresado constitutivamente, cromosómicamente integrada marcador CAT estaba preparado. la infección por fagos por conjugación con una cepa donante F-plásmido siguiendo el protocolo 3. las células se cultivaron hasta la fase logarítmica media y el fagémido introdujo siguiente protocolo 4. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, las células infectadas se diluyeron en serie y se sembraron a una intervalo de concentraciones de cloranfenicol. las placas se incubaron durante la noche, y la proporción de células resistentes a cada concentración de cloranfenicol se determinó contando unidades formadoras de colonias (UFC) al día siguiente. La Figura 4 muestra el efecto de silenciamiento mediado por sRNA en el fenotipo de resistencia a cloranfenicol. Las células no infectadas, o células infectadas con el fagémido de orientación mKate2, fueron resistentes a lacloranfenicol a todas las concentraciones ensayadas. En contraste, las células infectadas con el fagémido de orientación CAT mostraron reducción de la supervivencia a bajas concentraciones de cloranfenicol, y casi 99% de destrucción a concentraciones más altas. La adición de ampicilina, para seleccionar sólo las bacterias que portan el fagémido, redujo la supervivencia cloranfenicol a niveles indetectables. Esto es consistente con los trabajos anteriores que muestran que escape de la infección por fagos es una ruta común para escapar de silenciamiento 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figura 1: el silenciamiento de genes en E. coli con sRNA casetes de expresión Entregado por el fago M13 El casete sRNA se compone de 4 módulos:. el promotor P (un promotor constitutivo derivado de bacteriófago lambda), un dominio de dirección de 24 pb, un dominio de unión Hfq extrae de MICC y un terminador transcripcional 8 </sup&gt;. El casete se incorpora en un fagémido que lleva el origen de replicación f1 M13 y se empaqueta en la cápside M13 usando el fago auxiliar M13KO7. Fagémidos empaquetados son capaces de infectar E. coli que expresa el pilus F, donde comienza la expresión sRNA. El sRNA, se movilizan la proteína Hfq (representado en rojo) y se une a un objetivo ARNm antisentido cerca del sitio de unión al ribosoma, lo que resulta en la represión de traducción y de la degradación del ARNm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figura 2:. Diseño de cebadores y mutagénesis dirigida de sitio de destino sRNA dos cebadores están diseñados con una homología parcial a un casete de sRNA existente. El cebador directo contiene 20 pb homóloga al promotor pR en el extremo 5 &#39;, seguido de24 pares de bases que representa la nueva secuencia guía, y luego 18 pb homóloga al dominio de unión Hfq-en el extremo 3 &#39;. El cebador inverso es el complemento inverso exacto del cebador directo, con regiones de homología con el casete sRNA existente que flanquea el complemento inverso de la nueva secuencia GUIDE. Primer secuencias exactas se dan en la Tabla 3.-Cebador único reacciones de PCR separadas con el avance y los cebadores inversos producen lineal, ADN de cadena sencilla con la secuencia modificada deseada. Recocer el avance y retroceso de los productos de reacción, después de la limpieza como se describe en el protocolo, los resultados en el ADN de doble cadena plásmido que lleva el casete sRNA modificado deseado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figura 3: Knockdown de un reportero integrado cromosómicamente mKate2 fluorescente. E. coli K12 MG1655 expresar mKate2 se dejaron sin tratar (líneas rojas) y las barras de izquierda, infectado con un fagémido anti-mKate2 (líneas verdes y bares), o se infecta con un control fagémido CAT orientación (líneas azules y bares). (A) Sin tratamiento E. coli creció hasta densidades de saturación más altos, lo que indica un coste metabólico para la infección por fagos. Las líneas de puntos indican las desviaciones estándar de 3 repeticiones. (B) La señal mKate2 se redujo a niveles de fondo cerca de la anti-mKate2 cepa tratados, pero no en las cepas de control. Fluorescencia (C) GFP, también transportado por el fagémido, era detectable sólo en los controles de fagémidos tratada. (D, E) lecturas de fluorescencia final después de 24 horas de crecimiento se normalizaron a OD. GFP señal, que indica infección fagémido, estuvo ausente en los controles no tratados, sino que también reduce sustancialmente tras anti-CAT phagemid tratamiento. Esto puede indicar fuera de objetivo efectos del fagémido. La señal mKate2 se redujo mediante el tratamiento fagémido anti-mKate2 comparación con los controles no tratados. El fagémido de control CAT-dirigida mostró ningún efecto sobre la fluorescencia mKate2. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figura 4: Derribo de CAT restaura la sensibilidad de cloranfenicol a una población genéticamente resistente E.. coli K12 MG1655 que expresa un gen CAT cromosómicamente integrado se dejaron sin tratar (barras rojas), se trata con un fagémido control de la orientación mKate2 (barras verdes), o se trata con un fagómido que expresa un anti-CAT Srna (barras azules). Después de 1 hora de infección, la viabilidad de la hormiga se indicaibiotics se evaluó mediante diluciones seriadas y de las planchas. Las cepas tratadas con fagémido anti-CAT murieron significativamente (&gt; 90%) por cloranfenicol a concentraciones más altas, mientras que los tratamientos de control no se vieron afectados. La adición de ampicilina a las placas de cultivo selecciona positivamente para la infección fagémido y elimina las células no infectadas. En estas condiciones, no se observaron colonias resistentes a cloranfenicol después del tratamiento anti-CAT. Esto indica que la mayoría de los supervivientes representan un fracaso de la infección, en lugar de un fracaso de silenciamiento. Las barras de error representan la desviación estándar de 3 repeticiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> secuencia diana CAT </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> GUÍA secuencia de CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Un ejemplo DIANA y GUÍA secuencia para el gen CAT Tenga en cuenta la relación inversa complemento. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> promotor pR </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> secuencia GUÍA </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> dominio de unión hfq </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / terminador TE </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Cuadro 2:. componentes de secuencia de la sRNA casete Cada secuencia está escrito 5&#39;-3 &#39;. El casete completa es la concatenación de estos 4 elementos en orden y comprende 292 pb. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> cebador </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUÍA] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> cebador inverso </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Primer diseño para alterar elementos de guía existente, el cebador directo incluye los últimos 20 pb del promotor pR, la nueva secuencia GUÍA, y la primera de 18 pb del dominio de unión Hfq.. La secuencia diana es el complemento inverso exacto de la secuencia GUÍA. El cebador inverso es el complemento inverso exacto del cebador directo. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> plásmido plantilla </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 M Primer </td><td> 2,5 l </td></tr><tr><td> dNTPs 10 mM </td><td> 0,4 l </td></tr><tr><td> Polimerasa de alta fidelidad (2 U / l) </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 5x PCR Buffer </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 50 l </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Condiciones sugerido para el Single-cebador mutagénico de PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Temperatura </td><td> Hora </td></tr><tr><td> La desnaturalización inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 98 ° C </td><td> 10 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td> extensión final </td><td> 72 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Almacenamiento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 5: Protocolo sugerido termociclador para el Single-cebador mutagénico de PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> El ADN molde </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> 10 mM Cebador </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 10 M cebador inverso </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> Taq Mix 2X Maestro </td><td> 25 l </td></tr><tr><td> finales libre de nucleasar </td><td> 23 l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 50 l </td></tr></tbody></table> Tabla 6: Condiciones sugerido para la verificación de la secuencia de PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Temperatura </td><td> Hora </td></tr><tr><td> La desnaturalización inicial </td><td> 95 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 segundos </td></tr><tr><td> extensión final </td><td> 68 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Almacenamiento </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 7: Sugerido termociclador ProProtocolo para la verificación de la secuencia de PCR.

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Fagos mediada por la entrega de apuntado sRNA Construye para derribar la expresión génica en<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K vistas.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Investigación

Bioingeniería

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Genética

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

ADN vectorial basado en el ARN de interferencia para estudiar la función génica en el cáncer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Medicina

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by pathogenic and virulent bacteria of the genus Leptospira, either by direct contact with the bacteria or indirectly by exposure to contaminated water or soil. Domestic and wild animals act as reservoir hosts of infection, shedding leptospires from colonized renal tubules of the kidney, via urine, into the environment. The generation of mutant strains of Leptospira is critical to evaluate and understand pathogenic mechanisms of infection. CRISPR interference (CRISPRi) has proven to be a straightforward, affordable, and specific tool for gene silencing in pathogenic Leptospira. Therefore, the methodological details of obtaining the plasmid constructs containing both dCas9 and guide RNA, delivery of plasmids to Leptospira by conjugation with the E. coli strain &#946;2163, and transconjugant recovery and evaluation, will be described. In addition, the recently described Hornsby-Alt-Nally (HAN) media allows for the relatively rapid isolation and selection of mutant colonies on agar plates.

Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Here, the application of CRISPR interference (CRISPRi) for specific gene silencing in Leptospira species is described. Leptospira cells are transformed by conjugation with plasmids expressing dCas9 (catalytically "dead" Cas9) and a single-guide RNA (sgRNA), responsible for base pairing to the desired genomic target. Methods to validate gene silencing are presented.

Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Entrega bacteriana de RNAi efectores: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Biología

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1 
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA
Transduction is a form of genetic exchange between bacteria that utilizes bacteriophages, or phages, a class of virus that infects exclusively prokaryotic organisms. This form of DNA transfer, from one bacterium to another by way of a phage, was discovered in 1951 by Norton Zinder and Joshua Ledererg, who termed the process &#34;transduction&#34; (1). Bacteriophages were first discovered in 1915 by British bacteriologist Frederick Twort, then independently discovered again in 1917 by French-Canadian microbiologist Felix d&#39;Herelle (2). Since then, the structure and function of these phages have been widely characterized (3), dividing these phages into two classes. The first of these classes are the lytic phages which upon infection multiply within the host bacterium, disrupting the bacterial metabolism, lysing the cell, and releasing progeny phage (4). As a result of this anti-bacterial activity and the increasing prevalence of antibiotic-resistant bacteria, these lytic phages have recently proved useful as a substitute treatment for antibiotics. The second of these classes are the lysogenic phages which can either multiply within the host via the lytic cycle or enter a quiescent state in which their genome is integrated into that of the host (Figure 1), a process known as lysogeny, with the ability for phage production to be induced in multiple later generations (4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig1.jpg" /> 
Figure 1: Infection of host cell by bacteriophage. Adsorption by the phage to the bacterial cell wall via interactions between the tail fibers and receptor (purple). Once on the cell surface, the phage is irreversibly attached to the bacterial cell using the base plate (black) which is moved to the cell wall by the contractile sheath (yellow). Phage genome (red) then enters the cell and integrates into the host cell genome.
While bacterial transduction is a naturally occurring process, using modern technology it has been manipulated for the transfer of genes into bacteria in the laboratory setting. By inserting genes of interest into the genome of a lysogenic phage, such as phage, one is able to transfer these genes into the genomes of bacteria and consequently express them within these cells. While other methods of gene transfer, such as transformation, use a plasmid for gene transfer and expression, the insertion of the phage genome into that of the recipient bacterium not only has the potential to confer new traits to this bacterium, but also allows for naturally occurring mutations and other factors of the cellular environment to alter the function of the transferred gene.
Compared to other methods of horizontal gene transfer, such as conjugation, transduction is fairly flexible in the criteria required for donor and recipient cells. Any genetic element that can fit inside the genome of the phage being used can be transferred from any strain of donor bacteria to any strain of recipient bacteria as long as both are permissive to the phage, requiring the expression of necessary phage receptors on the cell surfaces. Once this gene is moved out of the donor genome and packaged into the phage, it can be transferred to the recipient. Following transduction, it is necessary to select for recipient bacteria that contain the gene of interest have to be selected for. This could be done by use of a genetic marker, such as a FLAG-tag or polyhistidine-tag, to mark the gene of interest, or the intrinsic function of the gene, in the case of genes that encode for antibiotic resistance. Additionally, PCR could be used to further confirm successful transduction. By using primers for a region within the gene of interest and comparing signal to a positive control, bacteria that has the gene of interest, and a negative control, bacteria that underwent the same steps as the transduction reaction with no phage. While bacterial transduction is a useful tool in molecular biology, it has and continues to play an important role in the evolution of bacteria, particularly with regard to the recent rise of antibiotic resistance.
In this experiment, bacterial transduction was used to transfer the gene encoding for resistance to the antibiotic ampicillin from the W3110 strain of E.coli to the J53 strain via the P1 bacteriophage (5). This experiment consisted of two main steps. First, the preparation of P1 phage containing the ampicillin resistance gene from the donor strain. Second, the transfer of this gene to the recipient strain by transduction with the P1 phage (Figure 1). Once carried out, the successful transfer of the ampicillin resistance gene could be determined by qPCR (Figure 2). If transduction was successful, the J53 strain of E. coli would be resistant to ampicillin, and the gene conferring this resistance detectable by qPCR. If unsuccessful, there would be no detection of the ampicillin resistance gene and ampicillin would still function as an effective antibiotic against the J53 strain.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig2.jpg" /> 
Figure 2: The confirmation of successful transduction by qPCR. By comparing the Cq values detected for the gene of interest from the transduction reaction and the negative control reaction, and normalizing these values against a housekeeping gene, one was able to confirm that bacterial transduction was successful.

Phage Transduction: Transferring Ampicillin Resistance in E. coli

Transducción de fagos: Un método para transferir resistencia a ampicilina de un donante una E. coli receptora

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

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JoVE Science Education

Biología avanzada

Microbiología

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

Siembra de ARNi para la alimentación de C. elegans: una técnica para inducir la expresión de dsRNA diana en E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

Fagos mediada por la entrega de apuntado sRNA Construye para derribar la expresión génica en

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