Este método permite facilitar la creación de plásmidos de expresión de ARN guía para experimentos facilitados por CRISPR. La principal ventaja de esta técnica es que la clonación se puede llevar a cabo en un solo paso y se pueden crear ARN guías emparejados utilizando plásmidos de expresión de ARN de una sola guía. Para comenzar este protocolo, diluya las imprimaciones liofilizadas en tampón 1X TE a una concentración final de 100 micromolares.
Aliquot una cantidad igual de imprimadores hacia adelante y hacia atrás en tubos de tapa de tira PCR. Vórtice para mezclar. A continuación, gire hacia abajo las mezclas de oligonucleótidos de ARN guía a 100 veces G durante 15 segundos.
Incubar la reacción a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de configurar la ligadura. Añadir entre uno y cinco microgramos del vector de expresión de guía PSB700 seleccionado a BSNB1 utilizando 0,5 microlitros de BSNB1 por cada microgramo de vector. Añadir agua destilada hasta que el volumen total sea de 40 microlitros y realizar la digestión durante una hora a 55 grados centígrados.
Ejecuta los productos de digestión con un gel de agarosa de fusión 1,5% bajo. Corte la banda de estructura básica vectorial digerida que corresponde a un fragmento de aproximadamente 9 kilobases de tamaño. Transfiera esta rodaja de gel a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Usando un kit comercial de purificación de gel, extraiga el ADN del gel de agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, diluir el ADN en 10-15 microlitros de tampón TE para obtener un elute concentrado. Cuando esté listo para realizar la ligadura, añada 15 microlitros de agua destilada a un vial.
Agregue 1 microlitro de los oligonucleótidos de ARN guía previamente recocidos, un microlitro del vector de expresión guía PSB700 digerido BSNB1 y 2 microlitros de tampón de reacción de ligasa de ADN 10XT4. A continuación, mezcle esta solución por vórtice. Agregue un microlitro de ligasa de ADN y vórtice de nuevo.
Gire hacia abajo la solución a 100 veces G durante 15 segundos. Incubar las reacciones a temperatura ambiente durante la noche asegurándose de incluir una reacción de control negativo sin inserción que tenga un vector digerido BSNB1 solo sin un inserto de oligote de ARN guía recocido. Para empezar, retire E.coli del almacenamiento a menos 80 grados Centígrados y descongele sobre hielo durante 5 a 10 minutos.
Añadir 0,5 microlitros de la mezcla de reacción preparada a ocho microlitros de E.coli competente. Mantener la mezcla sobre hielo durante 30 minutos. Golpee la mezcla a 42 grados Centígrados durante 45 segundos.
Luego deje reposar la mezcla sobre hielo durante dos minutos. Usando una coctelera giratoria, recupere el cultivo en 250 microlitros de medios SOC utilizando las condiciones enumeradas aquí para NEB DH5a o NEB Stables. Después de esto, plato 80 microlitros del cultivo en una placa de caldo de lisogenia de resistencia a antibióticos apropiada.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para NEB DH5a o a 30 grados Celsius para establos NEB. Para comenzar, utilice el protocolo PCR especial Phusion GC para crear el fragmento necesario como se describe en el protocolo de texto. Ejecute este producto PCR en un gel de 1% de agarosa y verifique que una banda se vea en aproximadamente 490 pares base.
Usando un kit de extracción de gel cortar y extraer este producto PCR. A continuación, aliquot una mezcla maestra 1X preparada en tubos PCR. Utilizar una pipeta multicanal para añadir un microlitro del producto PCR a una concentración de 40 femotocinas por microlitro.
En un microlitro del vector PSB700 añadir una concentración de 40 femtomoles por microlitro. Incluya un control sin inserción utilizando un microlitro de agua en lugar de los oligonucleótidos de ARN guía. Digerir el vector y ligar las inserciones en una reacción utilizando el protocolo Golden Gate descrito en el protocolo de texto.
Después de la reacción inicial de la puerta dorada añadir 0,5 microlitros adicionales de la enzima BSNB1 a cada reacción. Continúe la reacción a 55 grados centígrados durante una hora. Cuando la reacción de la puerta dorada esté completa, proceda al proceso de transformación de E.coli descrito anteriormente.
En este estudio, los vectores de expresión de ARN de guía única se crean correctamente utilizando dos métodos. En el primer método, la columna vertebral del vector se digiere previamente y se liga en una serie de oligonucleótidos cortos. El segundo método utilizaba la clonación de puerta dorada para digerir y ligar simultáneamente en una sola reacción.
ARN guía emparejado que expresa vectores, cada uno impulsado por su propio promotor independiente se crean con éxito mediante la clonación de un fragmento de PCR personalizado. La clonación exitosa para cualquiera de estos métodos dará lugar a la aparición de significativamente más colonias para transformaciones con el ADN de inserción adecuado en comparación con la placa de control sin inserción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no incluir ningún control de inserción en el paso de clonación.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la ingeniería de epigenomas para responder preguntas como qué efectos tienen las firmas de cromatina en la expresión génica.
