La interferencia de ARN es una de las principales herramientas utilizadas para la genética inversa en mosquitos y la administración oral nos permite inducir y mantener el silenciamiento génico en mosquitos adultos sin necesidad de micro inyección. La administración oral de ARN de doble cadena a mosquitos adultos es un método de interferencia de ARN versátil y de bajo costo que reduce significativamente el trabajo y el tiempo y el esfuerzo para estudiar la función génica. Este método podría utilizarse para estudiar no solo otros genes diana en Anopheles gambiae, sino también en otros anopheles de interés como Anopheles albinamus.
Para comenzar, cultive un cultivo a partir de una sola colonia bacteriana de la cepa HT115(DE3) de Escherichia coli que contiene el plásmido que expresa ARN de doble cadena en cinco mililitros de libras que contienen ampicilina y tetraciclina en un agitador de plataforma durante 12 horas a 37 grados Celsius y 180 RPM. Después de 12 horas, tome 0.5 mililitros del cultivo bacteriano cultivado durante la noche y haga una dilución de uno en 1000 en 2X medios de triptona de levadura que contienen ampicilina y tetraciclina. Para inducir la producción de ARN de doble cadena, agregue IPDG a la concentración final de 40 micromolares.
Luego incubar el cultivo durante dos horas en condiciones de agitación como se demuestra. Al final de la incubación, cuando la densidad óptica del cultivo alcanza 0,4 a 600 nanómetros, gletear las células bacterianas por centrificación a 4.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y luego lavar las células en un volumen de PBS. Después de girar las células una vez más, vuelva a suspender las células en PBS e incube a 70 grados Celsius durante una hora.
Después de matar las bacterias por calor, haga alícuotas de 400 microlitros de volumen y guárdelas a 20 grados centígrados hasta su uso posterior. Mezcle una alícuota de 400 microlitros de bacterias muertas por calor de deshielo que expresan ARN de doble cadena con 1,6 mililitros de solución de azúcar al 12% que contiene 0,2% de metilparabeno. Remoje una pequeña bola de algodón en esta solución y colóquela dentro de una jaula que contenga mosquitos de cinco días de edad y asegúrese de que los mosquitos se alimenten de esta solución.
Cambie la bola de algodón empapada en solución de azúcar de ARN de doble cadena cada dos días durante ocho días consecutivos, asegurándose de que la jaula se mantenga en condiciones constantes. Para anestesiar a los mosquitos con frío, coloque el recipiente sobre hielo hasta que los mosquitos dejen de moverse, y luego coloque los mosquitos en una superficie fría para aislar a las hembras para la disección. Después de rociar los mosquitos con etanol, colóquelos en una superficie de vidrio con PBS.
Con un par de fórceps, asegure la cabeza del mosquito y tire del tórax muy lentamente permitiendo que las glándulas salivales se liberen en PBS. Una vez que las glándulas salivales se diseccionan de 10 mosquitos, tire de las glándulas para la extracción de ARN. Al finalizar la extracción de ARN, suspenda el pellet de ARN en 30 microlitros de agua libre de ARN.
Mida la absorbancia y calcule la concentración de ARN como se describe en el manuscrito de texto. Utilizando un kit comercial de transcripción inversa, sintetice ADNc a partir de un microgramo de ARN. Diluya el ADNc 10 veces y configure las reacciones RTPCR en triplicados para los genes objetivo y de limpieza según las recomendaciones del fabricante.
Amplifique el CDNA con condiciones estándar de PCR en tiempo real. Para evaluar la capacidad de alimentarse con sangre, coloque grupos de 15 mosquitos hembra tratados con ARN de doble cadena objetivo y controlado en jaulas pequeñas y déjelos morir de hambre durante cuatro horas. Proporcione sangre barata desfibrilada a los mosquitos utilizando un baño de agua circulante a 37 grados centígrados, comederos de vidrio para mosquitos y membrana de peryfill.
Observe, cuente y registre el número de intentos de sondeo para adquirir con éxito una comida de sangre de las primeras cinco hembras para que se llenen completamente en cada grupo. Después de aislar el tejido fresco y el PBS se ha demostrado previamente, fijarlo en acetona helada durante 90 segundos. Luego enjuague el tejido varias veces en PBS e incube con anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados Celsius con antisuero diluido en PBS.
Al final de la incubación, lave el tejido varias veces con PBS. Agregue anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos en PBS e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas. Agregue cualquier mancha de contador 30 minutos antes del final de las dos horas de incubación.
Después de dos horas, lave el tejido tres veces con PBS, luego monte los tejidos en 100% glicerol en un portaobjetos de microscopio estándar con un deslizamiento de cubierta de un milímetro de grosor y guárdelo a 20 grados Celsius hasta la toma de imágenes. Los datos de expresión de micro aray mostraron la expresión de todos los genes dirigidos elegidos en las glándulas salivales adultas y los niveles de AAPP y salvia fueron particularmente altos. El ARN de doble cadena redujo efectivamente la abundancia de transcripciones de la cabeza de la horquilla en la glándula salival.
Los mosquitos alimentados con ARN de doble cadena de cabeza de tenedor exhibieron cinco veces más intentos de alimentación que el grupo de control o FEG de doble sexo alimentado con ARN de doble cadena alimentó a mosquitos para estar completamente llenos de sangre. Los niveles de salvia y tinción de CrebA se redujeron notablemente en todos los lóbulos de las glándulas salivales después de la interferencia de ARN de la cabeza de la horquilla en comparación con la interferencia de ARN de control de hormigas. Al considerar proteínas componentes de saliva altamente abundantes, los niveles de AAPP se redujeron en los tres lóbulos de las glándulas salivales después de la interferencia de ARN de la cabeza de la horquilla en comparación con el tratamiento de interferencia de ARN de control.
Por otro lado, no se observaron cambios en los niveles de mucina. Estos datos sugieren que la cabeza de horquilla contribuye de manera diferente a la expresión de diferentes genes de proteínas de saliva. Se observó una reducción de la fluorescencia de Rab11 en los lóbulos laterales distales después del tratamiento de interferencia de ARN de la cabeza de la horquilla, sin embargo, también se produjo un aumento de la señal de Rab11 en los lóbulos laterales medial y proximal.
No se observaron diferencias perceptibles en la señal roja del Nilo después de la interferencia de ARN de la cabeza de la horquilla en comparación con el tratamiento de interferencia de ARN de control. algunas máquinas secretaria reaccionan de una manera compleja que difiere entre los lóbulos de las glándulas salivales. Esta técnica podría permitir a los investigadores silenciar genes cuya expresión puede reducirse mediante una sola inyección de ARN de doble cadena y explorar la administración oral de ARN de doble cadena para usar ARNi como un posible método de control de vectores.
