This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Los experimentos con animales deben cumplir con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> Para la solución de monómero de hidrogel (A4P0): Añadir 20 g de acrilamida a 450 ml de 0,1x de buffer fosfato salino (PBS) y ajustar el volumen a 500 ml con 0,1 x PBS. PRECAUCIÓN: monómeros de acrilamida son tóxicos. Realizar todos los procedimientos en una campana de humos con el equipo de protección personal, incluyendo un protector facial, una bata de laboratorio, guantes y zapatos cerrados. <ol><li> Inmediatamente antes de usar, añadir 100 mg de 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] dihidrocloruro a 40 ml de solución de monómero de hidrogel (A4P0) en un tubo cónico de 50 ml bajo una campana de humos . </li></ol></li><li> Para el claro tampón electroforético tejido (ETC): Añadir 40 g de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 12,37 g de ácido bórico y 800 ml de H2O desionizada (dH2O). Ajustar el pH a 8,5 con NaOH y ajustar el volumen de1 litro con dH 2 O. adicional PRECAUCIÓN: El SDS es un producto químico nocivo; Por lo tanto, manejar con cuidado. </li><li> Para la solución CUBIC de montaje: Añadir 250 g de sacarosa, 125 g de urea, y 125 g de N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina a 150 ml de dH 2 O y llevar el volumen a 500 ml con dH2O </li></ol> 2. Preparación de muestras y Fijación <ol><li> La eutanasia del ratón. <ol><li> Preparar la alfaxalona (1 mg / kg) y xilazina (0,5 mg / kg) en la misma jeringa. </li><li> Intraperitoneal inyectar la mezcla de alfaxalona y xilazina y permiten 3 minutos para el ratón a la pérdida del conocimiento. </li><li> Espere hasta que el ratón anestesiado ya no responde a los estímulos dolorosos, como un pellizco de la cola, antes de continuar. PRECAUCIÓN: Siga las directrices institucionales apropiadas para el manejo de los animales. </li></ol></li><li> Transcardially perfundir el ratón con 100 ml de 0,9% de NaCl (pH 7.4 hasta 7.5) soluciónque contiene heparina (100 U / ml) para Exsanguinate, seguido de 100 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) en 1x PBS (pH 7,4) 14. PRECAUCIÓN: La solución de PFA es tóxico. La preparación de la solución de PFA y todas las manipulaciones posteriores debe llevarse a cabo en una campana de humos y con equipo de protección personal. </li><li> Cortar la cabeza del ratón, abrir la piel, y romper el cráneo entre los ojos utilizando unas tijeras pequeñas. </li><li> Retire las piezas del cráneo con unas pinzas pequeñas y curvadas. </li><li> Sacar el cerebro u órganos deseados. </li><li> Incubar el cerebro y los órganos en el post-fix solución PFA 4% a 4 ° C durante la noche. NOTA: para la limpieza de tejidos específicos de cada región, diseccionar la región específica o recortar el tejido después de la fijación del tejido. PRECAUCIÓN: La solución de PFA es tóxico. La perfusión transcardial y toda la manipulación posterior del ratón deben llevarse a cabo en una campana de humos y con equipo de protección personal. </li></ol> 3. Hidrogel monómero de infusión y Polymerization <ol><li> Incubar los órganos fijos en solución de monómero de hidrogel A4P0 a 4 ° C durante 12 a 24 h con agitación suave. </li><li> Hidrogel monómero-infundido polimerización tejido. <ol><li> Transferir la muestra a un tubo de fondo redondo de 10 ml con 5 ml de solución de monómero de hidrogel. Envolver la parte superior del tubo de fondo redondo con Parafilm. </li><li> Eliminar el oxígeno desde el tubo de fondo redondo que contiene la totalidad de ratón muestra cerebro de hidrogel infundido por burbujeo de nitrógeno a través del líquido durante 1 min. De forma rápida y cerrar herméticamente el tubo que contiene la muestra. </li></ol></li><li> Transferir el tubo a un baño de agua (37ºC) durante 2 h. </li><li> Lavar la muestra polimerizado brevemente con 0,1x PBS para eliminar el exceso de hidrogel. PRECAUCIÓN: monómeros de hidrogel son tóxicos. Para evitar el contacto de la piel con monómero de hidrogel, realizar todos los procedimientos en una campana de humos y con equipo de protección personal, incluyendo un protector facial, una bata de laboratorio y guantes. NOTA: Polimerizado tejidosse pueden almacenar en 0,1x PBS que contiene azida de sodio durante más de 2 semanas a 4 ° C. PRECAUCIÓN: La azida sódica es altamente tóxico y de forma aguda. Realizar todos los procedimientos en una campana de humos y con equipo de protección personal, incluyendo un protector facial, una bata de laboratorio y guantes. </li></ol> 4. electroforética Tejido de compensación (ETC) <ol><li> Transferir la muestra polimerizado a un recipiente de tejido y colocar el recipiente en la cámara de tejido ETC. </li><li> Llenar la cámara ETC ETC con tampón utilizando una bomba peristáltica. </li><li> Establecer las condiciones ETC y ejecutar el ETC. Utilice los siguientes ajustes. <ol><li> Para la configuración de ETC para órganos enteros, utilice los siguientes ajustes: (1.5 amperios), la temperatura (37 ° C), el tiempo (6.0 h), velocidad de la bomba (30 rpm) que se ejecuta. </li><li> Para la configuración de ETC para gruesas rebanadas de cerebro de ratón de 1 a 2 mm, utilice la siguiente configuración: actual (1.5 amperios), la temperatura (37 ° C), el tiempo (2,0 h), velocidad de la bomba (30 rpm) que se ejecuta. </li></ol></li><li> transferencia tse aclaró la muestra a un tubo cónico de 50 ml con 45 ml de PBS 0,1x. Lavar la muestra varias veces compensados ​​con 0,1x PBS hasta que no se ven burbujas cuando el tubo se agita brevemente (para confirmar la eliminación completa de SDS). </li></ol> 5. Immunolabeling de los tejidos de ACT-procesado <ol><li> Para el conjunto de cerebro de ratón: Se incuba la muestra en un volumen de 3 ml de solución de anticuerpo que contiene 1x PBS, 6% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% de Triton X-100, y azida sódica al 0,01% (solución de dilución de anticuerpo) con una dilución factor 1/500 para tirosina hidroxilasa anticuerpo (TH) durante 4 días a 37 ° C con agitación suave. Vuelva a colocar la solución de anticuerpos al final del día 2. <ol><li> Lavar la muestra en un tubo cónico de 50 ml con 45 ml de 0,1 x PBS durante 3 - 5 h y cambiar el tampón cada hora. </li><li> Incubar la muestra en un volumen de 3 ml de solución de dilución de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 de burro anti-conejo 488 anticuerpo secundario durante 4 días a 37 ° C con agitación suave. replas de las soluciones diluidas de anticuerpos en el día 2. </li></ol></li><li> Para 1- a grueso tejido cerebral en rodajas 2-mm: Incubar la muestra durante la noche o durante un máximo de 1 día en un volumen de 0,5 a 1 ml de la solución de dilución de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 para el anticuerpo de colágeno de tipo IV en 37 ° C con agitación suave. <ol><li> Lavar la muestra en un tubo cónico de 15 ml con un volumen de 12 ml de 0,1 x PBS durante 1-2 h. Cambiar el tampón cada hora. </li><li> Incubar la muestra en un volumen de 0,5 a 1 ml de la solución de dilución de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 para Cy3 conjugado con anti-anticuerpo secundario de conejo durante la noche o durante un máximo de 1 día a 37 ° C con agitación suave. </li></ol></li><li> Lavar la muestra con 0,1 x PBS por 3 - 5 horas; cambiar el tampón cada hora. </li><li> Antes de la proyección de imagen, se incuba la muestra en una cantidad apropiada de solución cúbicas de montaje para 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Reemplazar con solución cúbicas montaje fresco y se incuba durante 1 hora adicional. NOTA: </b&gt; 76 Tipo de anticuerpos funcionó bien en el tejido ACT-procesado de ratón, incluyendo 31 14 anticuerpos monoclonales. tejido Pre-marcado se puede combinar con la inmunomarcación de dos fluorocromos más en el tejido procesado-ACT. </li></ol> 6. Immunolabeling de tejidos densos (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO NOTA: c-PRESTO es adecuado para muestras de pequeño tamaño, como los testículos conjunto, riñón entero, o pequeñas secciones de los órganos más grandes. <ol><li> Transferir la muestra en un tubo de 1,5 ml, añadir 500 l de solución de dilución de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 de anticuerpo de colágeno de tipo IV, y se centrifuga el tubo a 600 xg durante 2 h. </li><li> Lavar la muestra teñida con 0,1x PBS mediante centrifugación a 600 xg durante 30 min. </li><li> Añadir 500 l de solución de dilución de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 para Cy3 conjugado con anti-anticuerpo secundario de conejo y se centrifuga a 600 xg durante 2 h. </li><li> Lavar la muestra teñida con 0.1x PBS mediante centrifugación a 600 xg durante 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO NOTA: s-PRESTO es adecuado para tejidos más grandes. <ol><li> Preparar una jeringa (volumen 30 ml) y conectarlo a una válvula de 3 vías (Figura 1A). Pegue la válvula con una pistola de pegamento para las condiciones de alta presión (Figura 1B). </li><li> Transferir la muestra en la jeringa válvula de 3 vías conectadas en la posición cerrada de la válvula. </li><li> Añadir 5 - 7 ml de diluyente de anticuerpo con un factor de dilución de 1/500 de anticuerpo de colágeno de tipo IV. Soltar la solución de anticuerpo en la muestra con la apertura de la válvula. </li><li> Establecer el émbolo de la jeringa hasta la posición de 17 ml para proporcionar suficiente espacio para el movimiento de infusión / extracción. Esto se puede hacer en la posición de válvula abierta. Cierre la válvula de 3 vías después de que el ajuste de la jeringa está terminado. </li><li> Ponga la jeringa que contiene la muestra en una bomba de jeringa. Establecer las condiciones de la bomba de jeringa a un volumen de infusión / retirada de 10 mL / min y un 4-min tiempo de pausa en el modo de ciclo continuo (Figura 1C). Nota: La bomba infunde hasta que alcanza el volumen objetivo (10 ml), y entonces la dirección de los cambios de flujo después de una breve pausa (4 min). </li><li> Haga funcionar la bomba de jeringa durante 3 - 24 horas a temperatura ambiente (Figura 1F). </li><li> Abrir la válvula de 3 vías y reemplazar la solución con 0,1 x PBS. </li><li> Lavar la muestra teñida dos veces con 0,1x PBS durante 1 h cada vez usando la bomba de jeringa. </li><li> Cambie con solución de dilución de anticuerpo que contiene conjugado con Cy3 anti-anticuerpo secundario de conejo (factor de dilución de 1/500) y ejecutar la bomba de jeringa por 3 - 24 h. </li><li> Abrir la válvula de 3 vías y reemplazar la solución con 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Antes de la proyección de imagen, se incuba la muestra teñida en una cantidad apropiada de solución cúbicas de montaje para 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Reemplazar con solución cúbicas montaje fresco y se incuba durante 1 hora adicional. </li></ol> 7. Iforjamagia <ol><li> Coloque el tejido etiquetados en un plato confocal y añadir solución cúbicas de montaje hasta que se cubrió el tejido. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido. Utilizar un microscopio confocal para la imagen del tejido 14 bajo el objetivo de 10X. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Poor fijación o la inmersión del hidrogel en los tejidos pueden causar la pérdida de proteínas y la distorsión de los tejidos durante el proceso de compensación de tejido. Todo el cerebro adulto de ratón debe ser incubado en 4% de paraformaldehído durante la noche, seguido de inmersión en un volumen mínimo de 20 ml de solución de monómero de hidrogel durante 12 - 18 h con agitación suave. Para grandes tejidos, incluyendo tejido humano, tales como cortes de cerebro y la médula espinal, extendida remojo vez en la solución de monómero de hidrogel se requiere. El protocolo de ACT es fácilmente aplicable a la limpieza de tejidos fijados porque los pasos de fijación del tejido y la infusión de polímero se separan. Después de borrar los tejidos, los tejidos humanos estaban bien teñidas con varios anticuerpos. Tenga en cuenta que la técnica de ACT de compensación no es compatible con los fijadores de alcohol, tales como etanol y metanol. La etapa de polimerización tejido hidrogel también es fundamental para producir tejidos de buena calidad siguiendo el proceso de compensación. Porqueoxígeno inhibe la polimerización de la acrilamida, debe ser eliminado por la desgasificación de la solución que contiene el tejido bajo un sistema de infusión de gas nitrógeno. Alternativamente, desoxigenación se puede ejecutar utilizando una cámara de vacío con un bloque de calor durante 23 h. La tasa de compensación depende de numerosos factores, incluyendo el tamaño de los órganos, el contenido de lípidos o proteínas fibrosas ECM, la condición de fijación, etc. La mayoría de los tejidos de ratón adulto se pueden borrar ETC durante la noche. Sin embargo, hay un riesgo de innecesaria sobre-compensación y la hinchazón del tejido; Por lo tanto, las diferencias en el tiempo de compensación son de consideración importante. las condiciones de limpieza de tejido deben ser determinadas empíricamente. Es importante destacar que, el contenido de la ECM pueden afectar la apariencia del tejido despejado. El color de los tejidos sigue siendo blanca u opaca, incluso después de la ACT en tampón ETC, porque ACT no borra las fibras de proteínas densos. Sin embargo, cuando estos órganos se sumergieron en solución de juego RI, lay se volvió transparente. La velocidad de hinchazón del tejido parece ser dependiente de los contenidos de ECM de los tejidos y los órganos blandos, tales como el cerebro, exhiben una mayor relación de hinchamiento de órganos densos. Debido a que el aumento de la inflamación del tejido ayudará a que el procedimiento de limpieza de tejido, ACT utiliza rutinariamente destila tampón a base de agua en la mayoría de los casos. En algunos casos, cuando no es deseable, como en los embriones de la hinchazón del tejido o deformidad transitoria, tampón que contiene 0,1 x PBS se puede aplicar para obtener imágenes de alta resolución. Cabe también señalar que el aumento de las concentraciones de sal en el tampón podrían causar la contracción de los tejidos. El método de ACT puede aclarar órganos enteros e incluso todo el cuerpo de un ratón 14. Sin embargo, las imágenes de tejidos profundos del tejido transparente requiere microscopios y objetivos especiales. Por lo tanto, de espesor de tejido cerebral de 1 a 2 mm es más eficaz para formación de imágenes con un microscopio confocal convencional. En nuestras manos, la eliminación de la etiquetaed anticuerpos a partir de tejidos de ACT-procesado es dependiente de anticuerpos, y no se recomiendan rondas de etiquetado anticuerpo diferente. Varios anticuerpos, tales como TH y GFAP, trabajaron especialmente bien para todo el cerebro immunolabeling 14. Por otro lado, algunos anticuerpos, tales como Tuj1 o Map2, a menudo etiquetados sólo la superficie de los tejidos. Esto podría ser mejorada por otros métodos, tal como el conmutador 15. Otra limitación potencial es que puede ser difícil de conservar las estructuras de proteínas finas en el tejido ACT-procesado debido a la inflamación del tejido y la contracción durante la etapa de limpieza de tejido. La técnica PRESTO es aplicable a una amplia variedad de técnicas de etiquetado tejido. Por ejemplo, en métodos de tejido transparente utilizando tejido pre-marcado, como SeeDB 4 y iDISCO 7, immunolabeling de tejido denso requiere periodos de incubación de más de varios días a semanas. Sin embargo, PRESTO puede acortar el tiempo de incubación a varias horas, enabling la realización de todo el proceso dentro de un día con un grueso tejido denso 1-mm. PRESTO puede mejorar la eficacia de deep-etiquetado de espesor, tejidos densos o tejidos gruesos, incluso con despacho de la ONU. Debido PRESTO utiliza una centrífuga de sobremesa o bomba de jeringa y no requiere ningún equipo especial, es relativamente fácil de implementar esta técnica con los procedimientos de laboratorio de rutina.

Uno de los retos de la neurociencia es la visualización de cableado de circuitos neuronales y las células individuales dentro del tejido cerebral intacta. Hasta hace poco tiempo, lo que demuestra las conexiones entre las neuronas de esta manera la necesidad 1) cortes seriados de los tejidos; 2) el etiquetado molecular de objetivos específicos, como los axones o proteínas; y 3) la visualización de reconstrucción en 3D de todo el cerebro a través de registro o alineación de imágenes 2D en serie 1 computacional. Estos pasos son laboriosos, requieren una gran cantidad de tiempo, y son susceptibles de perder información durante el corte y el etiquetado, haciendo asignación de red neuronal extremadamente difícil. Sin embargo, se han desarrollado muchos métodos que permiten la visualización de tejido intacto sin seccionar. Los tejidos biológicos pueden hacerse ópticamente transparente mediante técnicas de limpieza de tejido 2-10. Uno de los principales métodos es reducir las diferencias de índice de refracción entre el tejido intacto y la solución de inmersión con el finpara reducir la dispersión de la luz en el tejido intacto, reduciendo así al tejido transparente y que permite la observación de estructuras profundas. Algunos tipos de soluciones de inmersión tienen propiedades hidrófobas, que dan como resultado la extinción fluorescente rápido durante el procedimiento de deshidratación. Por lo tanto, estos métodos no son compatibles con imágenes fluorescentes durante un largo período de tiempo 11,12. En lugar de reactivos hidrófobos, otros métodos utilizan reactivos hidrófilos para la compensación de tejido, tales como SeeDB 4 y Sca l e 6, que mantienen la información estructural y de fluorescencia de la 4,6,8 tejido biológico. Sin embargo, macromoléculas, incluyendo anticuerpos, pueden no alcanzar el núcleo de tejido intacto solamente por difusión. Por lo tanto, el pre-etiquetado de moléculas diana en las zonas profundas de los tejidos densamente empaquetadas-es técnicamente difícil. En un método de limpieza de tejido desarrollado recientemente, CLARITY 3, un tejido biológico i hidrogel incrustados forman con acrilamida, y los lípidos se eliminan mediante electroforesis en dodecil sulfato de sodio solución -Con (SDS). La muestra se sumerge luego en una solución con un índice de reflexión a juego para reducir la luz de dispersión 3. El sistema de eliminación de lípidos se modificó posteriormente en CLARIDAD avanzada 13 y PACT (técnica claridad pasiva) 10. Después de la polimerización, las cadenas de acrilamida reticulan con proteínas, formador de hidrogel tejido. componentes lipídicos no se puede reticular con acrilamida; Por lo tanto, los lípidos pueden ser eliminados por electroforesis en el tampón que contiene SDS. A través de la eliminación activa de los lípidos, el tejido cerebral aumenta notablemente en la transparencia 9. Sin embargo, estos métodos no se ocupan de la imposibilidad de etiquetado de profundidad por difusión libre. Para superar esta limitación, se requieren técnicas para el transporte activo de los reactivos en las partes más profundas de los tejidos gruesos. Aunque CLARIDAD permite limpieza de tejidos y de tejidos profundosvisualización, no es un procedimiento fácil o rápida. Puede tomar varias semanas para borrar todo un 7,14 cerebro de ratón. compensación rápida de los tejidos es esencial para la aplicación de tales métodos en los ajustes básicos o clínicos de laboratorio para la investigación de ciencias de la vida o el diagnóstico de volumen. El protocolo actual proporciona un proceso simplificado para la remoción de tejido biológico y la detección de proteínas posterior por asistida por presión y entrega inmuno-tinción. Es conveniente para la alta resolución de imagen de volumen de los sistemas de procesamiento de datos grandes y presentada en 3D a través de combinación con métodos de imagen.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&amp;nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&amp;nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

La identificación y la exploración de la organización detallada de los órganos o de todo el cuerpo a nivel celular son retos fundamentales de la biología. métodos transitorias requieren una cantidad sustancial de tiempo y esfuerzo para obtener una imagen en 3D y que incluye seccionar el tejido intacto, immunolabeling, y de formación de imágenes de tejido seccionada en serie, que produce una pérdida de información en cada paso del proceso. En los enfoques desarrollados recientemente para obtener imágenes de alta resolución dentro de tejido intacto, la caracterización molecular se ha restringido al etiquetado de proteínas. Sin embargo, los protocolos disponibles en la actualidad para la compensación de órganos requieren un tiempo considerablemente largo proceso, por lo que es difícil de poner en práctica las técnicas de limpieza y eliminación de tejido en el laboratorio. Recientemente hemos establecido un protocolo rápido y altamente reproducible denomina ACT-PRESTO (a ctivo c laridad t echnique- p resión r eufórico e ficiente y s tabla TRANSFERENCIAde macromoléculas en o rgans), que permite para el despacho de tejido dentro de varias horas. Por otra parte, ACT-PRESTO permite immunolabeling rápido con los métodos convencionales y acelera la penetración de anticuerpos en la capa profunda de formados densamente especímenes, de espesor mediante la aplicación de flujo de la presión o de convección. Se describe cómo preparar los tejidos, cómo borrar mediante la eliminación de lípidos mediante electroforesis, y la forma de inmuno-mancha por un parto asistido por presión. La rapidez y la consistencia del protocolo serán agilizar el curso de la investigación histológica 3D y diagnósticos basados ​​en el volumen.

Compensación ACT-tejido Un factor importante que afecta el tejido de compensación es la fijación del tejido. la fijación de PFA y la infusión de acrilamida son pasos separados en este protocolo. Después de la etapa de polimerización de tejido de hidrogel, la solución A4P0 libre no se polimeriza, aunque hidrogeles infundido tejidos son reticulado con macromoléculas endógenas. Por lo tanto, no debe formar gel fuera de los tejidos (Figura 2A). Los resultados del procedimiento reaccionar en menos entrecruzamiento entre las proteínas y acrilamida en comparación con el protocolo de la claridad. De acuerdo con ello, la muestra de tejido de hidrogel es más poroso. Esta característica permite la extracción rápida de los lípidos y la difusión de macromoléculas. Las secciones de cerebro de ratón de 1 a 2 mm de espesor fueron aclarado suficientemente dentro de 1 - 2 h (Figura 2B), e 5 - 6 horas de ETC fue suficiente para clearance de cerebros de ratones enteros (Figura 2C). compensación de tejido de hidrogel mediada indujo la expansión del tejido después de la etapa ETC, pero el tejido vuelve a su tamaño original en solución índice de concordancia reflectante. La muestra de tejido de hidrogel formado en el procedimiento de ACT es altamente poroso, y por lo tanto, pequeños compuestos y macromoléculas podía penetrar de manera eficiente y difundirse fácilmente (Figura 3). Después de un 2-h de incubación de las secciones de cerebro de 1 mm con tirosina hidroxilasa (TH) y el anticuerpo de colágeno de tipo IV, un posterior 2 h de incubación con un anticuerpo secundario era suficiente para marcar las neuronas dopaminérgicas en una profundidad 500 mm (Figura 3) . Immunolabeling PRESTO-tejido órganos densos tienen generalmente altas concentraciones de fibras de ECM, que afecta a la penetración de los anticuerpos en los tejidos. Por lo tanto, los anticuerpos Penetclasificar a una profundidad de sólo 20 a 30 micras en los tejidos densos, como el tejido del riñón, después de 12 h de incubación. Para superar esta limitación, hemos diseñado métodos de penetración macromolécula activos que permiten la entrega de reactivos en los tejidos profundos, a saber PRESTO (presión relacionados con la transferencia eficiente y estable de macromoléculas en los órganos) (Figura 4). En comparación con la incubación estática de tejido renal ACT-procesado con soluciones de anticuerpos, la aplicación de fuerzas centrífugas (600 xg) con una centrífuga de sobremesa (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) mejorado en gran medida la entrega de anticuerpos en el tejido profundo (Figura 5). Cuando se aplicó el procedimiento de c-PRESTO a los tejidos densos, 3 h de incubación fue suficiente para marcar de 250 a estructuras profundas de 300 micras. Para mejorar la distorsión del tejido sin daño tisular significativa, así como para diseñar una máquina que proporciona un flujo de convección con una bomba de jeringa (PRESTO jeringa, s-PRESTO). Este proceso mejorado de manera similar pe anticuerposnetration en comparación con la difusión pasiva (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figura 1. Preparación del aparato s-PRESTO. A. Una jeringa (30 ml) y llave de tres vías. B. La llave de tres vías conectada y pegado a la jeringa. C. La jeringa que contiene la solución de muestra y el anticuerpo, y la jeringa se coloca en la bomba de jeringa. D. La bomba de jeringa y la configuración de condiciones de trabajo. E. La bomba infunde una solución que contiene los reactivos de marcaje en la muestra. Cuando se alcanza el volumen designado, los cambios de dirección de bombeo y se retira la solución después de un período de tiempo determinado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. ACT compensación tejido de cerebro de ratón. A. Después de la polimerización, soluciones A4P0 libres no se polimerizan; hidrogeles infundido tejidos se gelifica por reticulación con macromoléculas endógenas. B. 1 a gruesas rodajas de cerebro de 2 mm se limpiaron durante 1 - 2 h, y el grado de expansión y la recuperación del tamaño de índice de refracción (RI) Solución De equiparación se registraron. C. El espesor de todo el cerebro del ratón es de aproximadamente 0,8 cm, e 5 - 6 horas de ETC fue suficiente para borrar por completo el cerebro. Después de 3 h de ETC, había una cantidad significativa de tejido no despejado. A los 6 h de ETC, sin embargo, se había producido la limpieza de todo el cerebro. El color de los tejidos después de ACT en el búfer de ETC es blanca u opaca. Mediante el ajuste RI, los tejidos se vuelven transparentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic en ella</a>e para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figura 3. Immunolabeling con el tejido cerebral del ratón ACT-limpiado. Imágenes de cortes de cerebro de ratón 1 mm de ACT-procesado que muestran la corteza de cerebro de ratón teñidas con un anticuerpo para el colágeno de tipo IV y parte del cerebro medio se tiñeron con un anticuerpo para tirosina hidroxilasa (TH). Barra de escala, 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figura 4. PRESTO métodos immunolabeling. Los anticuerpos no pueden penetrar en los tejidos densos por difusión. PRESTO métodos immunolabeling fueron diseñados para infundir activamente macromoléculas y para entregar los reactivos entejidos densos. La aplicación de las fuerzas centrífugas utilizando una centrífuga de sobremesa estándar (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) marcadamente facilitó la entrega de anticuerpos. Appling flujo de convección con una bomba de jeringa (PRESTO jeringa, s-PRESTO) mejorar la penetración de anticuerpos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figura 5. PRESTO immunolabeling de tejido denso ACT-limpiado. Para c-PRESTO, los tejidos se centrifugaron a 600 xg durante 3 h usando una centrífuga de mesa estándar con el fin de acelerar la penetración de los anticuerpos primario y secundario. Por s-PRESTO, una bomba de jeringa se utilizó para entregar los anticuerpos. órganos de ratón, tales como los riñones y el hígado, se marcaron con colágeno tipo IV. En comparación con los métodos convencionales, 3 h deC o s-PRESTO mejora notablemente la profundidad etiquetado. En el riñón y el hígado, la profundidad del eje Z alcanza 300-350 micras o más profundo en muestras PRESTO (derecha), mientras que las muestras de control se etiquetan a una profundidad de solamente 40 - 50 micras (izquierda). Una imagen reconstruida 3D se obtuvo con un microscopio confocal. Barra de escala, 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (claridad técnica de presión activa derivada de la transmisión eficiente y estable de macromoléculas en órganos) permite el despeje rápido de los tejidos, eficiente, pero de bajo costo y la penetración rápida de anticuerpos en los tejidos aclarados por difusión pasiva o el parto asistido por presión. Usando este método, una amplia gama de tejidos se puede borrar, immunolabeled de múltiples anticuerpos, y la imagen de volumen.

ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K vistas.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (claridad técnica de presión activa derivada de la transmisión eficiente y estable de macromoléculas en órganos) permite el despeje rápido de los tejidos, eficiente, pero de bajo costo y la penetración rápida de anticuerpos en los tejidos aclarados por difusión pasiva o el parto asistido por presión. Usando este método, una amplia gama de tejidos se puede borrar, immunolabeled de múltiples anticuerpos, y la imagen de volumen. 

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Investigación sobre el cáncer

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neurociencias

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density and the location of immune cells in the TME have important diagnostic and prognostic values. Multiomic profiling of the TME has exponentially increased our understanding of the numerous cellular and molecular networks regulating tumor initiation and progression. However, these techniques do not provide information about the spatial organization of cells or cell-cell interactions. Affordable, accessible, and easy to execute multiplexing techniques that allow spatial resolution of immune cells in tissue sections are needed to complement single cell-based high-throughput technologies. Here, we describe a strategy that integrates serial imaging, sequential labeling, and image alignment to generate virtual multiparameter slides of whole tissue sections. Virtual slides are subsequently analyzed in an automated fashion using user-defined protocols that enable identification, quantification, and mapping of cell populations of interest. The image analysis is done, in this case using the analysis modules Tissuealign, Author, and HISTOmap. We present an example where we applied this strategy successfully to one clinical specimen, maximizing the information that can be obtained from limited tissue samples and providing an unbiased view of the TME in the entire tissue section.

Here, we describe a simple and accessible strategy for visualizing, quantifying, and mapping immune cells in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue sections. This methodology combines existing imaging and digital analysis techniques with the purpose of expanding the multiplexing capability and multiparameter analysis of imaging assays.

Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Inmunología e Infección

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medicina

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

El uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biología

Reconstrucción 3D de alta resolución del cerebro humano con SHORT y LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

Autor destacado: Avance del análisis de citoarquitectura 3D: reconstrucción volumétrica rápida del cerebro humano 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.

ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

Resumen

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Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

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Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

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El uso de

Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala

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Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala