Este protocolo permite la investigación de la morfología fina de neuronas retinianas y puede dar la penetración en los cambios morfológicos celulares y subcelulares que ocurren en estados de la enfermedad. Este método mejora perceptiblemente la transparencia óptica de la retina y permite la proyección de imagen de alta resolución, tridimensional, el cableado del circuito, y las estructuras subcelulares finas de neuronas retinianas en la preparación de la retina de la hormona. Enuclee los ojos del ratón con fórceps curvos y transfiéntelos en una pequeña placa de Petri con PBS de 0,1 M.
Haga un pequeño agujero a lo largo de la unión de la esclerótica de la córnea con la aguja debajo del microscopio de disección, luego transfiera el ojo a formaldehído de potencia al 4% durante una hora. Transferir el ojo de nuevo a un plato con PBS. Bajo un microscopio de disección, use tijeras de disección para cortar todo el camino alrededor de la unión corneoescleral.
Retire la córnea y el cristalino. Luego córtela en la base del nervio óptico y pela cuidadosamente la esclerótica con pórceps para aislar la retina. Haga cuatro pequeños cortes uniformemente alrededor de la retina y use un cepillo de punta fina sumergido en PBS para ponerlo plano GCL lateralmente hacia abajo en forma de trébol en un pequeño corte cuadrado de papel de filtro de nitrocelulosa.
Recoja la esquina del papel de nitrocelulosa con las autorórceps y colóquelo en una placa de 48 pocillos con formaldehído al 4% de potencia durante una hora, luego transfiera el papel de filtro y la retina a un pozo con PBS y lave tres veces durante cinco minutos cada uno. Descongelar la solución A4P0 sobre hielo. Luego transfiera la retina a la solución A4P0 e incube durante la noche a cuatro grados Centígrados con una agitación suave.
Agregue aceite vegetal en el pozo para cubrir completamente la solución A4P0. Incubar en un baño de agua a 40 grados centígrados durante tres horas sin agitar. Luego lavar tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado.
Incubar la retina en sulfato de dodecil al 10% de sodio a 40 grados centígrados durante dos días con agitación suave y luego transferir el papel de filtro y la retina a PBS con Triton X-100 y lavar cinco veces durante 90 minutos por lavado. Después del lavado final, almacene la retina a cuatro grados centígrados en PBS-T con azida de sodio al 0,01% o muévase directamente a la tinción inmunológica. Retire la retina del papel de filtro desprendiéndolo suavemente con un cepillo de punta fina en PBS-T.
Incubado en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo durante dos días a 40 grados centígrados con agitación suave. Después de la incubación, lavar cinco veces durante 90 minutos en PBS-T. Incubar la retina con anticuerpos secundarios apropiados diluido en solución de bloqueo durante dos días a 40 grados centígrados con temblores suaves.
Proteja las muestras de la luz durante el resto del procedimiento. Lave la retina cinco veces durante 90 minutos en tampón de fosfato de 0,02 M. Finalmente, incube la retina en una solución de coincidencia de índice de refracción a base de sorbitol a 40 grados centígrados durante la noche con una agitación suave.
Delinee un resbalón de cubierta de vidrio con un marcador permanente de punta fina para marcar un límite cuadrado en la parte posterior de un portaobjetos de microscopio de vidrio. Voltee la diapositiva y use una jeringa para trazar el límite con una delgada línea de grasa de silicona en la parte frontal de la diapositiva. Deje un pequeño espacio en una esquina para que se escape el exceso de solución de montaje.
Transfiera la retina al centro del área acotada y colóquela con un cepillo de punta fina para que quede plana con el lado del fotorreceptor contra el portaobjetos de vidrio. Pipetee aproximadamente 60 microlitros de sRIMS para que cubra la retina aplanada y se extienda hasta una esquina del recinto. Asegúrese de que la retina permanezca plana y en su lugar.
Aplique el resbalón de la cubierta, comenzando desde la esquina con el sRIMS y baje lentamente hasta que toque la grasa en todos los lados. Coloque una pila de tres resbalones de cubierta a cada lado de la retina montada como un espaciador. Utilice el borde largo de otra diapositiva para presionar hacia abajo el resbalón de la cubierta para que el montaje sea plano y uniforme.
Guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados hasta obtener imágenes. Comience colocando el portaobjetos en la etapa del microscopio y localizando la muestra. Para obtener imágenes Z apiladas de muestras, primero concéntrese en la señal en cada canal individualmente y establezca el tiempo de exposición o la velocidad de escaneo para microscopios de fluorescencia o confocales, respectivamente.
Establezca el rango para la pila Z estableciendo manualmente el plano focal en la parte superior e inferior del rango deseado o estableciendo el punto medio y luego especificando un rango alrededor del punto medio. Ajuste el tamaño del paso o el número de sectores como desee. Capture la imagen y guarde el archivo original.
A continuación, se exporta como un archivo TIF u otro formato deseado. Utilice el análisis de imágenes, software de elección para ajustar el brillo y el contraste en cada canal hasta que se logre una claridad óptima tanto en las imágenes individuales como en la representación tridimensional de la pila Z. Cuando se procesó con el protocolo CLARITY modificado se observó una transparencia óptica completa en todo el grosor de la retina en comparación con las retinas de control no procesadas.
Las imágenes apiladas Z para los conos etiquetados arrestin en ONL, los DAC etiquetados TH en INL, y los RGCs marcados RBPMS en GCL se muestran aquí. La localización relativa de neuronas a través del grueso entero de la retina fue observada en la imagen del recubrimiento. La coloración del TH y la CLARIDAD procesaron las retinas enteras del montaje fueron comparadas con las imágenes obtenidas de la preparación estándar.
Las dendritas y axón-como procesos de DAC fueron reveladas más claramente en una retina procesada claridad que en una retina estándar. Axón-como procesos de DAC exhibió completo anillo-como las estructuras en una retina de la claridad comparada a una retina estándar. Anillo-como las estructuras de la retina de la CLARIDAD tomadas usando microscopia de la fluorescencia eran casi idénticas a ésas observadas usando microscopia confocal.
Los procesos axón-como también funcionaron hacia la retina externa. La coloración inmunológica contra GluA2 y PSD-95 demostró el puncta distinto, revelando GluA2 individual que contenía los receptores de AMPA y los sitios sinápticos supuestos del poste, respectivamente. Una imagen de superposición mostró algunos puncta en los procesos DAC.
Los puntos de la co-localización supuesta fueron presentados en los planos XZ, YZ, y XY y el TH co-localizado claramente con GluA2 y PSD-95. Es importante que la retina permanezca plana durante el proceso de polimerización por hidrogel para que la retina despejada pueda colocarse plana para el proceso de montaje e imagen.
