This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

ניסויים בבעלי החיים חייבים לעמוד בכל התקנות הממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הפתרון מונומר הידרוג&#39;ל (A4P0): להוסיף 20 גרם של acrylamide 450 מ&quot;ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו 0.1x (PBS) ולהתאים את עוצמת הקול עד 500 מ&quot;ל עם 0.1x PBS. זהירות: מונומרים Acrylamide רעילים. לבצע את כל ההליכים במנדף עם ציוד מגן אישי, כולל מגן פנים, מעיל מעבדה, כפפות, נעליים סגורות הבוהן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להוסיף 100 מ&quot;ג של 2,2&#39;-Azobis [2- (2-imidazolin-2-י.ל.) פרופאן] dihydrochloride 40 מ&quot;ל של תמיסת מונומר הידרוג&#39;ל (A4P0) בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל תחת במנדף . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסליקת רקמות electrophoretic (ETC) חיץ: הוסף 40 גרם של סולפט dodecyl נתרן (SDS) ו 12.37 גרם של חומצת בור ל -800 מ&quot;ל של deionized H 2 O (O DH 2). התאם את ה- pH ל -8.5 עם NaOH ולהתאים את עוצמת הקול כדי1 ליטר עם 2 dH הנוסף O. זהירות: SDS הוא כימיקל מזיק; ולכן, להתמודד עם זה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הפתרון מעוקב-הר: להוסיף 250 גרם של סוכרוז, 125 גרם של אוריאה, ו 125 גרם של N, N, N &#39;, N&#39; -tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine 150 מ&quot;ל של DH 2 O ולהביא את נפח 500 מ&quot;ל עם dH 2 O. </li></ol> 2. הכנת דוגמאות &amp; קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתת חסד של העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את alfaxalone (1 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באותו מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intraperitoneally להזריק את התערובת של alfaxalone ו xylazine ולאפשר 3 דקות העכבר כדי להפוך ללא הכרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד העכבר מורדם כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון צביטה זנב, לפני שתמשיך. זהירות: פעל בהתאם להנחיות מוסדיות מתאימות לטיפול בבעלי חיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transcardially perfuse את העכבר עם 100 מ&quot;ל של 0.9% NaCl (pH 7.4-7.5) פתרוןהמכילה הפרין (100 U / mL) כדי ולגרום לדימום מחודש, ואחריו 100 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS (pH 7.4) 14. זהירות: פתרון PFA הוא רעיל. הכנת פתרון PFA וכל הטיפול העוקב חייבת להתנהל במנדף ועם ציוד מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את ראש העכבר, לפתוח את העור, לשבור את הגולגולת בין העיניים בעזרת מספריים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פיסות הגולגולת באמצעות מלקחיים קטנים, מעוגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את המוח או איברים רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המוח ואיברים בתמיסת PFA פוסט לתקן 4% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: לניקוי רקמות ספציפי באזור, לנתח את האזור המסוים או לקצץ את הרקמה לאחר קיבוע רקמה. זהירות: פתרון PFA הוא רעיל. זלוף transcardial וכל טיפול העכבר עוקב חייב להתנהל במנדף ועם ציוד מגן אישי. </li></ol> 3. עירוי מונומר הידרוג&#39;ל ו Polymerization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת האיברים הקבועים בתמיסת מונומר הידרוג&#39;ל A4P0 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידרוג&#39;ל מונומר חדור פילמור רקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם כדי צינור 10 מ&quot;ל מסביב לתחתית עם 5 מ&quot;ל של תמיסת מונומר הידרוג&#39;ל. עוטפים את החלק העליון של הצינור מסביב לתחתית עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החמצן מהצינור מסביב לתחתית המכיל מדגם במוח העכבר כולו רווי-הידרוג&#39;ל ידי מבעבע חנקן דרך נוזל דקות 1. במהירות ובעוצמה לסגור את צינור המכיל מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצינור כדי אמבט מים (37 מעלות צלזיוס) במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם polymerized בקצרה עם 0.1x PBS להסיר הידרוג&#39;ל עודף. זהירות: מונומרים הידרוג&#39;ל רעילים. כדי למנוע מגע עם העור עם מונומר הידרוג&#39;ל, לבצע את כל ההליכים במנדף ועם ציוד מגן אישי, כולל מגן פנים, מעיל מעבדה, וכפפות. רקמות polymerized: הערהניתן לאחסן אזיד הנתרן המכיל 0.1x PBS במשך יותר מ 2 שבועות ב 4 ° C.. זהירות: יזיד הנתרן הוא מאוד בחריפות רעילה. לבצע את כל ההליכים במנדף ועם ציוד מגן אישי, כולל מגן פנים, מעיל מעבדה, וכפפות. </li></ol> 4. ניקוי רקמות Electrophoretic (ETC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם מפולמר מיכל רקמות למקם את המיכל רקמות בתא ETC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר ETC עם חיץ ETC באמצעות משאבת peristatic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תנאי ETC ולהפעיל את ETC. השתמש בהגדרות הבאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הגדרות וכו &#39;עבור איברים שלמים, להשתמש בהגדרות הבאות: (1.5 אמפר), טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס), זמן הריצה (6.0 שעות), מהירות משאבה (30 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הגדרות וכו &#39;עבור פרוסות מוח עכבר עבות 1 עד 2 מ&quot;מ, השתמש את ההגדרות הבאות: נוכחי (1.5 אמפר), טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס), זמן ריצה (2.0 שעות), מהירות משאבה (30 סל&quot;ד). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדבקהוא פינה מדגם צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 45 מ&quot;ל של 0.1x PBS. לשטוף מספר פעמים מדגם פינה עם PBS 0.1x עד בועות לא נראים כאשר הצינור הוא מזועזע בקצרה (כדי לאשר את הסרה מלאה של SDS). </li></ol> 5. immunolabeling של רקמות ACT-מעובד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור במוח העכבר כולו: דגירה המדגם בנפח 3 מ&quot;ל של פתרון נוגדנים המכיל PBS 1x, 6% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.1% Triton X-100, ו אזיד הנתרן 0.01% (פתרון דילול נוגדן) עם דילול גורם של 1/500 עבור hydroxylase טירוזין (TH) נוגדן במשך 4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד קל. החלף את פתרון הנוגדן בסוף היום 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם בתוך שפופרת חרוטי 50 מ&quot;ל עם 45 מ&quot;ל של 0.1x PBS עבור 3 - 5 שעות ולשנות את חיץ כל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם בנפח 3 מ&quot;ל של תמיסת דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 עבור נוגדנים משני נגד ארנב החמור 488 במשך 4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד קל. Replאס פתרונות הנוגדן המדולל ביום 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 1 עד 2 מ&quot;מ רקמת המוח פרוס עבה: דגירה המדגם לילה או עד 1 יום בנפח 0.5- עד 1 מ&quot;ל של תמיסת דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 נוגדן מסוג IV קולגן ב 37 ° C עם רעד קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם בתוך שפופרת חרוטי 15 מ&quot;ל עם נפח של 12 מ&quot;ל של PBS 0.1x עבור 1-2 שעות. שינוי למאגר כל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם בנפח 0.5- עד 1 מ&quot;ל של תמיסת דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 עבור נוגדנים משני נגד ארנב Cy3 מצומדות לילה או עד 1 יום ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד קל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם ב 0.1x PBS עבור 3 - 5 שעות; לשנות את החיץ בכל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, דגירת המדגם ב כמות מתאימה של פתרון מעוקב-mount עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר עם רעד עדין. חלף עם פתרון מעוקב הר טרי דגירת h 1 נוסף. הערה: </b&gt; 76 סוג של נוגדנים עבד היטב ברקמות ACT-מעובד עכבר, כולל 31 נוגדנים חד שבטיים 14. רקמה טרום שכותרתו ניתן בשילוב עם immunolabeling של שני fluorochromes יותר ברקמת מעובד ACT. </li></ol> 6. immunolabeling של רקמות דחוסות (פרסטו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג-PRESTO הערה: ג-PRESTO מתאים מדגמים קטנים בגודל, כגון אשך כולו, כולו כליות, או חלקים קטנים של איברים גדולים יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל, ולהוסיף 500 μL של פתרון דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 עבור נוגדן מסוג IV קולגן, ו צנטריפוגות צינור לעבר גרם 600 × 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם מוכתם PBS 0.1x על ידי צנטריפוגה ב g 600 × למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פתרון דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 עבור נוגדנים משני Cy3 מצומדות נגד ארנב צנטריפוגות ב 600 × גרם במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם מוכתם 0.1x PBS על ידי צנטריפוגה ב g 600 × למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> s-PRESTO הערה: s-PRESTO מתאים רקמות גדולות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מזרק (נפח של 30 מ&quot;ל) ולחבר אותו (איור 1 א) 3 כיווני שסתום. מדביק את השסתום עם אקדח דבק על התנאים בלחץ גבוה (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את המדגם לתוך מזרק 3 הכיוונים מחוברים שסתום במצב-שהסתום הסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5 - 7 מ&quot;ל של תמיסת דילול נוגדן עם גורם לדילול של 1/500 עבור נוגדן מסוג IV קולגן. שחרר את פתרון הנוגדנים לתוך המדגם ידי פתיחת השסתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבוכנה במזרק למצב 17 מ&quot;ל לספק מספיק מקום לתנועה עירוי / נסיגה. ניתן לעשות זאת במצב-שסתום פתוח. סגור את שסתום 3 כיוונים לאחר הגדרת המזרק נגמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את המזרק המכיל את המדגם על משאבת מזרק. הגדר את התנאים משאבת מזרק כדי נפח עירוי / נסיגה של 10 מ&quot;ל / דקה 4-דקות להשהות זמן על מצב מחזור מתמשך (איור 1 ג). הערה: המשאבה ממלאה עד שהוא מגיע בנפח היעד (10 מיליליטר), ולאחר מכן לכיוון שינויים בזרימה לאחר הפסקה קצרה (4 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת מזרק במשך 3 - 24 שעות בטמפרטורת החדר (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתום 3 כיוונים ולהחליף פתרון עם PBS 0.1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם מוכתם פעמיים עם 0.1x PBS עבור h 1 בכל פעם באמצעות משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה עם פתרון דילול נוגדן המכיל Cy3 מצומדות נגד ארנב נוגדנים משני (גורם לדילול של 1/500) ולהפעיל את משאבת מזרק במשך 3 - 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתום 3 כיוונים ולהחליף פתרון עם PBS 0.1x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה, דגירה מדגם מוכתם הכמות המתאימה של פתרון מעוקב-mount עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר עם רעד עדין. חלף עם פתרון מעוקב הר טרי דגירת h 1 נוסף. </li></ol> 7. אניmaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה שכותרתו בצלחת confocal ולהוסיף פתרון מעוקב-mount עד הרקמה מכוסית. מניחים coverslip על הרקמה. שימוש במיקרוסקופ confocal לתדמית הרקמה 14 תחת המטרה 10X. </li></ol>

<ol>
	<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Dodt, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Ert&amp;#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Kim, S. -. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li><li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+for+optical+anatomy.">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631 (2016).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

קיבעון או טבילת הידרוג&#39;ל מסכן לרקמות יכול לגרום לאובדן של חלבונים ואת העיוות של רקמות במהלך תהליך ניקוי רקמות. מוח עכבר הבוגר כולה צריך להיות וטופחיו paraformaldehyde 4% בין לילה, ואחריו טבילת נפח מינימאלי של 20 מיליליטר של תמיסת מונומר הידרוג&#39;ל במשך 12 - 18 שעות עם רעד עדין. עבור רקמות גדולות, כולל רקמה אנושית כגון פרוסות המוח וחוט השדרה, הוארך השריה זמן בפתרון מונומר הידרוג&#39;ל נדרש. פרוטוקול ACT ישימה בקלות פעולות הסליקה של רקמות קבועות משום ששלבי עירוי פולימר קיבעון רקמות מופרדים. לאחר ניקוי רקמות, רקמות אנושיות היו היטב מוכתם כמה נוגדנים. ראוי לציין, כי טכניקת סליקת ACT אינה תואמת fixatives אלכוהול, כגון אתנול, מתנול. צעד פילמור הידרוג&#39;ל הרקמות חיוני גם כדי לייצר רקמות באיכות טובה לאחר תהליך הסליקה. כיחמצן מעכב את פילמור של acrylamide, יש להסירו ידי degassing הפתרון המכילים הרקמה תחת מערכת עירוי גז חנקן. לחלופין, דה-חמצון ניתן לבצע באמצעות תא ואקום עם גוש חום במשך 23 שעות. שיעור הסליקה תלוי בגורמים רבים, כולל גודל האיבר, את התוכן של שומנים או חלבונים סיביים ECM, התנאי של קיבעון, וכו רקמות עכבר רוב הבוגרים ניתן לסליקה על ידי ETC הלילה. עם זאת, קיים סיכון של מיותר על סליקה ונפיחות רקמות; וכך, ההבדלים בזמן סליקה של שיקול חשוב. תנאי רקמות סליקה יש לקבוע באופן אמפירי. חשוב לציין, את התוכן של ECM עשוי להשפיע על המראה של רקמת הפינה. הצבע של הרקמות נשאר לבן או אטום, גם לאחר ACT במאגר וכו &#39;, כי אין דבר לנקות סיבי חלבון צפופים. עם זאת, כאשר גופים אלה היו שקועים פתרון התאמת RI, אתy הפך שקוף. שיעור נפיחות רקמה שנראה תלוי תוכן ECM של הרקמות, ואיברים רכים, כמו המוח, להפגין יחס נפיחות גדול יותר איברים צפופים. בגלל רקמה עלתה נפיחות תעזור ההליך לסליקת רקמות, ACT שגרתי מנצל מזוקק חיץ על בסיס מים ברוב המקרים. במקרים מסוימים, כאשר נפיחות רקמות או עיוות חולפת אינן רצויות, כגון בעוברים, PBS 0.1x מאגר המכיל ניתן ליישם הדמיה ברזולוציה גבוהה. כמו כן יש לציין כי ריכוז מלח גבוה למאגר עלול לגרום ההתכווצות של רקמות. שיטת ACT יכולה להבהיר איברים שלמים ואפילו כל הגוף של עכבר 14. עם זאת, הדמית רקמות עמוקות של רקמה שקופה דורשת מיקרוסקופים ויעדים מיוחדים. לכן, מוח רקמות 1 עד 2 מ&quot;מ עבה הוא יעיל ביותר עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal קונבנציונלי. בידיים שלנו, הסרת תוויתנוגדני ed מרקמות מעובד ACT הוא נוגדן תלוי, ופגזים של תיוג נוגדן שונה אינם מומלצים. נוגדנים אחדים, כגון TH ו GFAP, עבדו טוב במיוחד עבור המוח כולו immunolabeling 14. מצד שני, כמה נוגדנים, כגון Tuj1 או MAP2, לעתים קרובות שכותרתו רק את פני השטח של הרקמות. זה עשוי להשתפר על ידי שיטות אחרות, כגון מתג 15. הגבלת פוטנציאל נוספת היא שזה עלול להיות קשה לשמר מבנים חלבוניים בסדר ברקמת ACT-מעובד בגלל רקמת נפיחות התכווצות במהלך שלב ניקוי הרקמות. טכניקת PRESTO ישימה למגוון רחב של טכניקות תיוג רקמות. לדוגמא, בשיטות רקמה שקופה בעזרת רקמות מראש שכותרתו, כגון SeeDB 4 ו iDISCO 7, immunolabeling של רקמה צפופה דורש תקופות דגירה ארוכות יותר בכמה ימים עד שבועות. עם זאת, PRESTO יכול לקצר את זמן הדגירה לכמה שעות, דוארnabling השלמת התהליך כולו תוך יום עם רקמה צפופה בעובי 1 מ&quot;מ. PRESTO יכול לשפר את היעילות של תיוג עמוק עבה, רקמות צפופות, או אפילו רקמות עבות un-פינה. בגלל PRESTO משתמשת צנטריפוגות בטבלה העליונה או משאבת מזרק ואינו דורש שום ציוד מיוחד, קל יחסית ליישום הטכניקה הזו לנהלים מעבדה שגרתיות.

אחד האתגרים במדעי המוח הוא להדמיה של חיווט מעגלים עצביים ועל תאים בודדים בתוך רקמת המוח ללא פגע. עד לאחרונה, הוכיח את הקשרים בין הנוירונים בדרך זו נדרש 1) חתך סדרה של רקמות; 2) תיוג מולקולרי של מטרות ספציפיות, כגון אקסונים או חלבונים; ו -3) להדמיה באמצעות שחזור 3D של המוח כולו באמצעות רישום או יישור חישובית של תמונות סדרתי 2D 1. צעדים אלה הם מייגעים, דורשים מידה רבה של זמן, והם עלולים לאבד מידע במהלך חתך וסימון, מה שהופך מיפוי רשת עצבי קשה ביותר. עם זאת, שיטות רבות המאפשרות הדמיה של רקמות שלמות בלי חתך פותחו. רקמות ביולוגיות יכולות להתבצע שקופות אופטי ידי טכניקות סליקת רקמה 2-10. אחת השיטות העיקריות הוא להפחית הבדלים מקדמים שבירים בין הרקמות השלמות פתרון הטבילה כדיכדי לצמצם פיזור אור בתוך הרקמה ללא פגע, ובכך הופך את הרקמה שקופה המאפשרת התצפית של מבנים עמוקים. סוגים מסוימים של פתרונות טבילה יש תכונות הידרופוביות, אשר תוצאה מרווה פלורסנט מהר במהלך הליך ההתייבשות. לכן, שיטות אלה אינן תואמות דימות פלואורסצנטי על פני תקופה ארוכה של זמן 11,12. במקום ריאגנטים הידרופובי, שיטות אחרות להשתמש ריאגנטים הידרופילי לניקוי רקמות, כגון SeeDB 4 ו Sca l e 6, המקיימים את המידע המבני הקרינה של 4,6,8 הרקמה הביולוגית. עם זאת, מקרומולקולות, כולל נוגדנים, לא יכול להגיע הליבה של רקמות ללא פגע על ידי דיפוזיה לבד. לפיכך, התיוג מראש של מולקולות מטרה באזורים עמוקים של רקמות בצפיפות וגדושות הוא מאתגר מהבחינה טכנית. בשיטת רקמת סליקה לאחרונה מפותחת, CLARITY 3, אני רקמה ביולוגי-מוטבע הידרוג&#39;לs נוצר עם acrylamide, ושומנים יוסרו על ידי אלקטרופורזה תחת סולפט dodecyl נתרן (SDS) פתרון המכילים. המדגם הוא שקוע אז בתמיסה עם אינדקס התאמה רעיוני להפחית אור פיזור 3. מערכת הסרת שומנים שונה מאוחר יותר בבהירות מתקדמת 13 ו PACT (טכניקת בהירות פסיבית) 10. לאחר פילמור, שרשראות acrylamide crosslink עם חלבונים, יוצרי רקמות הידרוג&#39;ל. רכיבי שומנים לא יכול crosslink עם acrylamide; ובכך, ניתן לבטל שומנים ידי אלקטרופורזה תחת חיץ SDS המכיל. באמצעות החיסול הפעיל של שומנים, רקמות המוח עולות באופן ניכר בשקיפות 9. עם זאת, שיטות אלו אינן מטפלות האפשרות של תיוג עמוק על ידי דיפוזיה חופשית. כדי להתגבר על מגבלה זו, טכניקות להובלה הפעילה של ריאגנטים לחלקים העמוקים של רקמות עבות נדרשות. למרות CLARITY מאפשר סליקת רקמות-רקמות עמוקותלהדמיה, זה לא הליך קל או מהיר. זה יכול לקחת כמה שבועות כדי לנקות 7,14 במוח העכבר כולו. התבהרות מהירה של רקמות חיונית עבור היישום של שיטות כאלה להגדרות מעבדה בסיסיות או קליניות למחקר מדעי חיים או אבחנת נפח. הפרוטוקול הנוכחי מספק תהליך פשוט לקבלת אישור רקמה ביולוגית וזיהוי חלבון לאחר מכן על ידי מכתים חיסוני משלוח בסיוע לחץ. היא מתאימה הדמיה נפח ברזולוציה גבוהה של מערכות עיבוד נתונים גדולות הגיש ו 3D באמצעות שילוב עם שיטות הדמיה.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&amp;nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&amp;nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

זיהוי והחקירה של הארגון המפורט של איברים או של כל הגוף ברמה התאית הם אתגרי יסוד בביולוגיה. שיטות מעברות דורשות כמות משמעותית של זמן ומאמץ כדי לקבל תמונת 3D וכולל חתך ברקמה ללא פגע, immunolabeling, והדמית רקמות מחולקות סדרתי, אשר מייצרת הפסד של מידע בכל שלב של התהליך. בגישות שפותחו לאחרונה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה בתוך רקמה שלמה, אפיון מולקולרי הוגבל על התיוג של חלבונים. עם זאת, פרוטוקולים הקיימים כיום לסליקת איבר דורשים זמן תהליך ארוך באופן משמעותי, מה שהופך אותו קשה ליישם טכניקות סליקת רקמות במעבדה. הקמנו לאחרונה פרוטוקול מהיר הפערים לשחזור כינה ACT-פרסטו (א r ressure p echnique- t larity ג ctive במצב רוח מרומם fficient דואר ו- s השולחן t ransferשל מקרומולקולות לתוך rgans o), המאפשר פינוי רקמות בתוך מספר שעות. יתר על כן, ACT-PRESTO מאפשר immunolabeling המהירה עם שיטות קונבנציונליות ומאיץ חדירת נוגדן לתוך השכבה העמוקה של בנוי בצפיפות, דגימות עבות על ידי יישום זרימת לחץ או הסעה. אנו מתארים כיצד להכין רקמות, כיצד לנקות ע&quot;י הסרת שומנים באמצעות אלקטרופורזה, וכיצד חיסוניים להכתים ידי משלוח לחץ בסיוע. המהירות והעקביות של פרוטוקול יזרז את ביצוע מחקר היסטולוגית 3D ואבחנות מבוססי נפח.

סליקת ACT-רקמה אחד שיקולים חשובים המשפיעים סליקת רקמות הם קיבעון רקמות. קיבעון עירוי acrylamide PFA הם שלבים נפרדים בפרוטוקול זה. לאחר שלב פילמור הידרוג&#39;ל-רקמה, פתרון A4P0 חינם אינו polymerized, למרות הידרוג חדורים רקמות הם צולבים עם מקרומולקולות אנדוגני. לפיכך, לא ג&#39;ל צריך טופס מחוץ הרקמות (איור 2 א). תוצאות ההליך ACT בפחות cross-linking בין חלבונים acrylamide לעומת פרוטוקול CLARITY. בהתאם לכך, מדגם הידרוג&#39;ל הרקמות הוא נקבובי יותר. תכונה זו מאפשרת מיצוי מהיר של ליפידים ואת דיפוזיה של מולקולות. קטעי עכבר המוח 1- עד 2 מ&quot;מ עבה פונו מספקת בתוך 1 - 2 h (תרשים 2B), ו 5 - 6 שעות של ETC הספיקה גlearance של מוח עכבר השלם (איור 2 ג). סליקת רקמות בתיווך הידרוג&#39;ל מושרה הרחבת הרקמות לאחר שלב ETC, אך הרקמה חזרה לגודלו המקורי בתמיסת מדד בהתאמה רעיונית. מדגם הידרוג&#39;ל הרקמות נוצר בהליך ACT הוא נקבובי ביותר, וכך, תרכובות קטנות מקרומולקולות יכולים לחדור ביעילות לנטרל בקלות (איור 3). לאחר דגירה 2-h של פרוסות המוח 1 מ&quot;מ עם hydroxylase טירוזין (TH) נוגדנים מסוג IV קולגן, דגירה 2-h לאחר מכן עם נוגדנים משני הספיק לתייג נוירונים דופאמינרגיים בעומק 500 מיקרומטר (איור 3) . Presto-רקמות immunolabeling יש איברים צפופים בדרך כלל בריכוזים גבוהים של סיבי ECM, אשר משפיע על החדירה של נוגדנים לתוך הרקמות. לפיכך, נוגדנים penetמדורג עד לעומק של רק 20-30 מיקרומטר ברקמות צפופות, כגון רקמת כליה, לאחר 12 שעות של דגירה. כדי להתגבר על מגבלה זו, עצבנו שיטות חדירות מקרומולקולה פעילות המאפשרות המשלוח של חומרים כימיים לתוך רקמות עמוקות, כלומר PRESTO (לחץ קשור העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לתוך האיברים) (איור 4). לעומת הדגירה סטטי של רקמת כליה-מעובד ACT עם פתרונות נוגדנים, היישום של כוחות צנטריפוגליים (600 XG) עם צנטריפוגות בטבלה עליונה (פרסטו, ג-PRESTO צנטריפוגלי) משלוח הנוגדן השתפר מאוד לתוך רקמות עמוקות (איור 5). כאשר אנו להחיל את הליך ג-PRESTO לרקמות צפופות, 3 שעות של אינקובציה היו מספיק לתייג 250 עד 300 מיקרומטר מבנים עמוקים. כדי לשפר את עיוות רקמות ללא נזק לרקמות משמעותי, גם עיצבנו מכונת המספק תזרים הסעה עם משאבת מזרק (מזרק PRESTO, s-פרסטו). תהליך זה PE נוגדן השתפר באופן דומה<html> netration לעומת דיפוזיה פסיבית (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> הכנה איור 1. של מנגנון s-פרסטו. א מזרק (30 מ&quot;ל) ו שסתום משולשת. .ב שסתום המשולש מחובר ומודבק המזרק. ג מזרק המכיל את הפתרון מדגם נוגדנים, ואת מזרק דגש על משאבת מזרק. ד משאבת מזרק התקנת תנאי עבודה. .ה משאבת ממלאה תמיסה המכילה חומרים כימיים התיוג לתוך הדגימה. כאשר הנפח המיועד הוא הגיע, שינוי כיוון שאיבה ייסוג הפתרון לאחר פרק זמן מוגדר של זמן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> EP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig2.jpg" /> איור 2. סליקת רקמות ACT של מוח עכבר. א לאחר פילמור, פתרונות A4P0 חינמיים לא polymerized; הידרוג חדורים רקמות gelated ידי cross-linking עם מקרומולקולות אנדוגני. ב 1- פרוסות מוח עבות מ&quot;מ 2 פוניו 1 - 2 שעות, ואת היקף ההרחבה והתאוששות גודל באינדקס רעיוני (RI) פתרון -matching נרשם. העובי ג במוח העכבר כולו הוא כ -0.8 ס&quot;מ, ו 5 - 6 שעות של ETC היה מספיק כדי לנקות לחלוטין את המוח. אחרי 3 שעות של ETC, הייתה כמות משמעותית של רקמה שאינן נמחק. על ידי 6 שעות של ETC, לעומת זאת, סליקה של המוח כולו התרחשה. הצבע של רקמות לאחר ACT למאגר ETC הוא לבן או אטום. על ידי התאמת RI, הרקמות להיות שקופות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ אותה</a>דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> איור 3. immunolabeling עם רקמת מוח עכבר פינת ACT. תמונות של פרוסות מוח עכבר ACT-מעובד 1 מ&quot;מ מראות קליפת עכבר מוח מוכתמת נוגדן מסוג IV קולגן חלק של המוח התיכון מוכתם נוגדן כדי טירוזין hydroxylase (TH). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> איור 4. PRESTO שיטות immunolabeling. נוגדנים אינם יכולים לחדור לרקמות צפופות על ידי דיפוזיה. שיטות immunolabeling PRESTO נועדו להחדיר מקרומולקולות לספק ריאגנטים אקטיבייםרקמות צפופות. היישום של כוחות צנטריפוגליים באמצעות צנטריפוגות בטבלה העליונה סטנדרטי (צנטריפוגלי PRESTO, ג-פרסטו) ניכרת הקל על משלוח של נוגדנים. Appling זרימת הסעה עם משאבת מזרק (מזרק PRESTO, s-פרסטו) השתפרה חדירת נוגדן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> איור 5. PRESTO immunolabeling של רקמה צפופה פינת ACT. עבור C-פרסטו, רקמות היו centrifuged ב 600 XG למשך 3 שעות באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה סטנדרטית כדי להאיץ את החדירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים. עבור s-פרסטו, משאבת מזרק היה בשימוש בכדי לשלוח את הנוגדנים. איברי עכבר, כגון כליות והכבדות, תויגו עם IV סוג קולגן. בהשוואה לשיטות קונבנציונליות, 3 שעות שלC- או s-PRESTO משפר את עומק התיוג ניכר. בכליות ובכבד, עומק הציר-Z מגיע 300 - 350 מיקרומטר או עמוקים בדגימות PRESTO (מימין), בעוד דגימות בקרה מסומנות בעומק של רק 40 - 50 מיקרומטר (משמאל). תמונה משוחזרת 3D הושגה עם מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging at JoVE.com

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-פרסטו (הקשורים בלחץ טכניקת בהירות פעיל העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לאיברים) מאפשרת סליקת רקמות מהירה, יעילה, אבל לא יקרה וחדירת נוגדן מהירה לרקמות מסומנות על ידי דיפוזיה פסיבית או מסירה סייע בלחץ. באמצעות שיטה זו, מגוון רחב של רקמות יכול להיות מסומן, immunolabeled ידי נוגדנים מרובים, ו-צלם נפח.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  Korea University College of Medicine.  ACT-פרסטו (הקשורים בלחץ טכניקת בהירות פעיל העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לאיברים) מאפשרת סליקת רקמות מהירה, יעילה, אבל לא יקרה וחדירת נוגדן מהירה לרקמות מסומנות על ידי דיפוזיה פסיבית או מסירה סייע בלחץ. באמצעות שיטה זו, מגוון רחב של רקמו...

Video: ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Developmental Biology

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Cancer Research

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neuroscience

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density and the location of immune cells in the TME have important diagnostic and prognostic values. Multiomic profiling of the TME has exponentially increased our understanding of the numerous cellular and molecular networks regulating tumor initiation and progression. However, these techniques do not provide information about the spatial organization of cells or cell-cell interactions. Affordable, accessible, and easy to execute multiplexing techniques that allow spatial resolution of immune cells in tissue sections are needed to complement single cell-based high-throughput technologies. Here, we describe a strategy that integrates serial imaging, sequential labeling, and image alignment to generate virtual multiparameter slides of whole tissue sections. Virtual slides are subsequently analyzed in an automated fashion using user-defined protocols that enable identification, quantification, and mapping of cell populations of interest. The image analysis is done, in this case using the analysis modules Tissuealign, Author, and HISTOmap. We present an example where we applied this strategy successfully to one clinical specimen, maximizing the information that can be obtained from limited tissue samples and providing an unbiased view of the TME in the entire tissue section.

Here, we describe a simple and accessible strategy for visualizing, quantifying, and mapping immune cells in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue sections. This methodology combines existing imaging and digital analysis techniques with the purpose of expanding the multiplexing capability and multiparameter analysis of imaging assays.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Immunology and Infection

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medicine

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של המוח האנושי עם SHORT ו-LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

מחבר זרקור: קידום ניתוח ציטוארכיטקטורה תלת מימדית - שחזור נפחי מהיר של המוח האנושי 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

השימוש של

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול