This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

Tierversuche müssen auf alle relevanten staatlichen und institutionellen Vorschriften entsprechen. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Für das Hydrogel Monomerlösung (A4P0): In 20 g Acrylamid zu 450 ml 0,1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und das Volumen auf 500 ml mit 0,1X PBS einzustellen. ACHTUNG: Acrylamidmonomere giftig sind. Führen Sie alle in einem Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel, Handschuhe und geschlossene Schuhe. <ol><li> Unmittelbar vor der 40 ml Hydrogel Monomerlösung (A4P0) in einem 50 ml konischen Röhrchen unter einer Abzugshaube 100 mg 2,2&#39;-Azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propan] dihydrochlorid zu verwenden, fügen . </li></ol></li><li> Für die elektrophoretische Gewebe Clearing (ETC) Puffer: In 40 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 12,37 g Borsäure zu 800 ml entionisiertem H 2 O (dH 2 O). Der pH-Wert mit NaOH auf 8,5 und die Lautstärke zu1 L mit zusätzlichen dH 2 O. ACHTUNG: SDS ist eine schädliche Chemikalie; daher sollte diese sorgfältig behandelt. </li><li> Für die CUBIC-Mount - Lösung: In 250 g Saccharose, 125 g Harnstoff und 125 g N, N, N &#39;, N&#39; Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin zu 150 ml dH 2 O und bringen die Lautstärke auf 500 ml mit dH 2 O. </li></ol> 2. Probenvorbereitung &amp; Fixierungen <ol><li> Euthanasie der Maus. <ol><li> Bereiten Sie die Alfaxalon (1 mg / kg) und Xylazin (0,5 mg / kg) in derselben Spritze. </li><li> Intraperitoneal injizieren, um die Mischung aus Alfaxalon und Xylazin und erlauben 3 min für die Maus bewusstlos zu werden. </li><li> Warten Sie, bis die narkotisierten Maus reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie ein Schwanz und Zuziehen, bevor Sie fortfahren. ACHTUNG: Befolgen Sie die entsprechenden institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Tieren. </li></ol></li><li> Transkardial perfundiert die Maus mit 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) -Lösungenthaltend Heparin (100 U / ml) zu exsanguinate, um 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (pH 7,4) 14 gefolgt. ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die Herstellung von PFA-Lösung und die gesamte anschließende Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie die Maus den Kopf ab, öffnen die Haut, und brechen den Schädel zwischen den Augen mit einer kleinen Schere. </li><li> Entfernen Stücke des Schädels mit kleinen, gebogenen Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das Gehirn oder gewünschten Organe aus. </li><li> Inkubiere das Gehirn und Organe in der Post-fix 4% PFA-Lösung bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Für spezifische Region Gewebe Clearing, die spezifische Region sezieren oder das Gewebe nach Gewebefixierung trimmen. ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die transkardialer Perfusion und alle nachfolgenden Maus Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. </li></ol> 3. Hydrogel Monomer Infusion und Polymerization <ol><li> Inkubieren der festen Organe in A4P0 Hydrogel-Monomer-Lösung bei 4 ° C für 12-24 h unter leichtem Schütteln. </li><li> Hydrogelmonomer-infundiert Gewebe Polymerisation. <ol><li> Übertragung der Probe in einen 10 ml Rundbodenröhrchen mit 5 ml Hydrogel Monomerlösung. Wickeln Sie das obere Ende der Rundbodenrohr mit Parafilm. </li><li> Entfernen des Sauerstoffs aus der Rundbodenrohr, das Hydrogel-infundiert gesamten Gehirn der Maus enthaltenden Probe von 1 min Stickstoff durch die Flüssigkeit sprudeln. Schnell und dicht schließen Sie die Probe enthaltenden Röhre. </li></ol></li><li> Übertragen, um das Rohr zu dem Wasserbad (37 ° C) für 2 h. </li><li> Waschen Sie die polymerisierte Probe kurz mit 0.1x PBS Überschuss Hydrogel zu entfernen. ACHTUNG: Hydrogele Monomere sind giftig. Hautkontakt mit Hydrogelmonomer, führen Sie alle Verfahren in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe zu vermeiden. HINWEIS: Polymerisierte Gewebekann für mehr als 2 Wochen bei 4 ° C in 0,1 × PBS, das Natriumazid gelagert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist hoch und akut toxisch. Führen Sie alle in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe. </li></ol> 4. Die elektrophoretische Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Übertragen Sie die polymerisierte Probe auf einen Gewebebehälter und legen Sie den Gewebebehälter in der ETC-Kammer. </li><li> Füllen Sie das ETC-Kammer mit ETC-Puffer mit peristatische Pumpe. </li><li> Stellen Sie die ETC-Bedingungen und führen Sie den ETC. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen. <ol><li> Für ETC-Einstellungen für ganze Organe, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (6,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute). </li><li> Für ETC-Einstellungen für 1- bis 2 mm dicke Maus Hirnschnitten, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Strom (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (2,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute). </li></ol></li><li> Transfer ter gelöscht Probe auf einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1X PBS. Waschen Sie die gelöscht Probe mehrmals mit 0.1x PBS, bis keine Blasen zu sehen sind, wenn das Rohr kurz geschüttelt wird (um die vollständige Entfernung von SDS bestätigen). </li></ol> 5. Immunmarkierung von ACT-verarbeitete Gewebe <ol><li> Für Maus gesamte Gehirn: Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperlösung, enthaltend 1x PBS, 6% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid (Antikörperverdünnungslösung) mit einem Verdünnungs Faktor 1/500 für Tyrosin-Hydroxylase (TH) Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. Ersetzen Sie die Antikörperlösung am Ende des Tages 2. <ol><li> Waschen Sie die Probe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1 x PBS 3 - 5 h und wechselt jede Stunde Puffer. </li><li> Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Esel-anti-Kaninchen-488 sekundärem Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. replAss der verdünnten Antikörperlösungen am Tag 2. </li></ol></li><li> Für 1- bis 2 mm dicke Scheiben geschnitten Hirngewebe: Inkubieren der Probe über Nacht oder bis zu 1 Tag in einem 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. <ol><li> Waschen Sie die Probe in einem 15-ml konischen Röhrchen mit einem 12-ml-Volumen von 0,1 × PBS für 1-2 h. Ändern Sie den Puffer jede Stunde. </li><li> Inkubieren der Probe in einer 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper über Nacht oder bis zu 1 Tag bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Probe in 0,1 × PBS 3 - 5 h; wechselt jede Stunde Puffer. </li><li> Vor der Bebilderung, die Probe in einer geeigneten Menge kubisch-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde. HINWEIS: </b&gt; 76 Typ von Antikörpern funktionierte gut in Maus ACT-verarbeitete Gewebe, darunter 31 monoklonale Antikörper 14. Pre-markiertes Gewebe kann mit der Immunmarkierung von zwei Fluorochromen in ACT-verarbeitete Gewebe kombiniert werden. </li></ol> 6. Immunmarkierung von dichten Gewebe (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO HINWEIS: c-PRESTO eignet sich für kleine Proben, wie Voll testis, gesamte Niere oder kleine Abschnitte größerer Organe. <ol><li> Übertragung der Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, 500 &amp; mgr; l Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper und zentrifugieren Sie das Rohr bei 600 × g für 2 h. </li><li> Waschen der gefärbten Probe mit 0,1X PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min. </li><li> Fügen 500 ul Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertes anti-Kaninchen-Sekundärantikörper und Zentrifuge bei 600 × g für 2 h. </li><li> Waschen Sie die gefärbte Probe mit 0.1x PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO HINWEIS: s-PRESTO ist für größere Gewebe geeignet. <ol><li> Bereiten Sie eine Spritze (30 ml Volumen) und verbinden Sie es mit einem 3-Wege - Ventil (Abbildung 1A). Kleben Sie das Ventil mit einer Klebepistole für den Hochdruckbedingungen (1B). </li><li> Transfer der Probe in die 3-Wege-Ventil angeschlossenen Spritze in der geschlossenen Ventilstellung. </li><li> Hinzufügen von 5 bis 7 ml Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper. Lösen der Antikörperlösung in die Probe durch Öffnen des Ventils. </li><li> Stellen Sie den Spritzenkolben in die 17-ml-Position ausreichend Platz zu schaffen für die Infusion / Rückzugsbewegung. Dies kann in der offenen Ventilstellung erfolgen. Schließen das 3-Wegeventil, nachdem die Spritze Einstellung beendet ist. </li><li> Legen Sie die Spritze die Probe auf eine Spritzenpumpe enthält. Set die Spritzenpumpe Bedingungen in einem Infusions- / Entnahmevolumen von 10 ml / min und einem 4-min Zeit auf Dauerzyklus Pause - Modus (Abbildung 1C). HINWEIS: Die Pumpe infundiert , bis er das Zielvolumen (10 ml) erreicht hat , und dann die Strömungsrichtung ändert sich nach einer kurzen Pause (4 min). </li><li> Führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h bei Raumtemperatur (1F). </li><li> Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS. </li><li> Waschen Sie die gefärbte Probe zweimal mit 0,1X PBS für 1 h bei jedem der Spritzenpumpe. </li><li> Ändern Sie mit Antikörperverdünnungslösung, die Cy3-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Verdünnungsfaktor von 1/500) und führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h. </li><li> Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Vor der Bildgebung, brüten die gefärbte Probe in einer geeigneten Menge CUBIC-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde. </li></ol> 7. ichmaging <ol><li> Legen Sie das markierte Gewebe in einem konfokalen Schüssel und fügen Sie CUBIC-Mount-Lösung, bis das Gewebe bedeckt ist. Legen Sie ein Deckglas auf das Gewebe. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zur Abbildung des Gewebes 14 unter dem 10X - Objektiv. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Schlechte Fixierung oder Hydrogel Eintauchen in das Gewebe kann den Verlust von Proteinen führen und die Verzerrung des Gewebes während des Gewebes Clearing-Prozess. Die ganze erwachsenen Gehirn der Maus sollte über Nacht in 4% Paraformaldehyd inkubiert werden, gefolgt von Eintauchen in einem minimalen Volumen von 20 ml Hydrogel Monomerlösung für 12 bis 18 h unter leichtem Schütteln. Für große Gewebe einschließlich menschliches Gewebe wie Gehirn und Rückenmark slices verlängerte Zeit in dem Hydrogel Monomerlösung Einweichen erforderlich. Das ACT-Protokoll ist leicht anwendbar für das Clearing von fixierten Gewebe, weil die Gewebefixierung und Polymerinfusionsschritte getrennt sind. Nach Gewebe Lichtung wurden menschliche Gewebe mit mehreren Antikörpern gut gefärbt. Beachten Sie, dass die ACT Verrechnungsverfahren mit Alkohol Fixiermitteln, wie Ethanol und Methanol nicht kompatibel ist. Das Gewebe-Hydrogel-Polymerisationsschritt ist auch wichtig, gute Qualität Gewebe nach dem Clearing-Verfahren herzustellen. weilSauerstoff inhibiert die Polymerisation von Acrylamid, sollte es durch Entgasen des Gewebe enthaltenden Lösung unter einem Stickstoffgasinfusionssystem entfernt werden. Alternativ kann De-Sauerstoffversorgung für 23 h mit einer Vakuumkammer unter Verwendung von mit einem Wärmeblock ausgeführt werden. Die Clearing - Rate hängt von zahlreichen Faktoren ab , einschließlich der Organgröße, die Inhalte von Lipiden oder ECM Faserproteine, den Zustand der Fixierung, usw. Die meisten erwachsenen Mausgeweben kann über Nacht durch ETC gelöscht werden. Es besteht jedoch die Gefahr einer unnötigen Über Clearing- und Gewebe Schwellung; Somit sind die Unterschiede in der Klärungszeit von wichtiger Gesichtspunkt. Tissue-Clearing-Bedingungen sollten empirisch ermittelt werden. Wichtig ist, dass der Inhalt der ECM kann das Aussehen des Gewebes beeinträchtigen gelöscht. Die Farbe des Gewebes bleibt weiß oder opak, selbst nach dem ACT in ETC-Puffer, da ACT nicht dichten Proteinfasern löschen. Wenn jedoch wurden diese Organe in RI passende Lösung eingetaucht, diey wurde durchsichtig. Die Rate der Gewebeschwellung erscheint auf den ECM Inhalte der Gewebe und weiche Organe, wie das Gehirn, weisen ein höheres Quellverhältnis als dichte Organe abhängig. Da erhöhte Gewebe nutzt ACT Schwellung wird das Gewebe-Clearing-Verfahren helfen, routinemäßig auf Wasserbasis Puffer in den meisten Fällen destilliert. In einigen Fällen, wenn Gewebeschwellung oder transient Deformierung nicht erwünscht ist, wie beispielsweise in Embryonen, Puffer, enthaltend 0,1X PBS für hochauflösende Bildgebung angewendet werden. Es sollte auch bemerkt werden, dass höhere Salzkonzentrationen in dem Puffer die Schrumpfung des Gewebes verursachen könnten. Die ACT - Methode können ganze Organe zu klären und auch den ganzen Körper einer Maus 14. Allerdings erfordert tiefen Gewebe-Bildgebung von transparenten Gewebe speziellen Mikroskopen und Ziele. Somit Hirngewebe 1- bis 2 mm dick ist am effektivsten für die Bildgebung mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. In unseren Händen, das Entfernen des Etikettsed Antikörper aus ACT-verarbeitete Gewebe ist die Antikörper-abhängige und Runden von verschiedenen Antikörpermarkierung sind nicht zu empfehlen. Mehrere Antikörper, wie TH und GFAP arbeitete besonders gut für die Ganzhirnimmunmarkierung 14. Auf der anderen Seite können einige Antikörper, wie TuJ1 oder Map2, oft nur die Oberfläche der Gewebe gekennzeichnet. Dies kann durch andere Verfahren verbessert werden, wie beispielsweise Schalter 15. Eine weitere potenzielle Einschränkung ist, dass es schwierig sein könnte, feine Proteinstrukturen in ACT-verarbeitete Gewebe zu erhalten, weil das Gewebe Schwellung und Schrumpfung während des Gewebe-Löschschritt. Presto-Technik ist auf eine breite Vielfalt von Gewebemarkierungstechniken. Beispielsweise in gewebe transparent Methoden vormarkiert Gewebe, wie SeeDB 4 und iDISCO 7, Immunmarkierung von dichtem Gewebe erfordert Inkubationszeiten länger als mehrere Tage bis Wochen. Allerdings PRESTO kann die Inkubationszeit bis zu mehreren Stunden zu verkürzen, enabling die Fertigstellung des gesamten Prozesses innerhalb eines Tages mit 1 mm dicken dichten Gewebe. PRESTO kann die Wirksamkeit von tief Kennzeichnung dicken, dichten Gewebe oder sogar un-geklärt dicke Gewebe verbessern. Weil PRESTO eine Tischzentrifuge oder Spritzenpumpe verwendet und erfordert keine spezielle Ausrüstung, ist es relativ einfach, diese Technik mit Routinelaborverfahren zu implementieren.

Eine der Herausforderungen in den Neurowissenschaften ist die Visualisierung der neuronalen Verdrahtung und einzelne Zellen innerhalb intakten Hirngewebe. Bis vor kurzem demonstriert die Verbindungen zwischen den Neuronen auf diese Weise erforderlich 1) Serienschnitt von Geweben; 2) molekulare Kennzeichnung spezifischer Ziele, wie Axone oder Proteine; und 3) die Visualisierung von 3D - Rekonstruktion des gesamten Gehirns über Rechen Registrierung oder Ausrichtung von 2D - Serienbilder 1. Diese Schritte sind mühsam, erfordert viel Zeit und haften Informationen zu verlieren, während des Schneidens und Kennzeichnung, so dass neuronale Netzwerk-Mapping äußerst schwierig. viele Methoden jedoch, dass für die Visualisierung von intaktem Gewebe ohne Schnitte erlauben entwickelt worden. Biologische Gewebe können durch Gewebe-Clearing - Techniken 2-10 optisch transparent gemacht werden. Eine der wichtigsten Methoden der Brechungsindexunterschiede zwischen dem intakten Gewebe und der Eintauchlösung zu reduzieren, umLichtstreuung im intakten Gewebe zu reduzieren, wodurch das Gewebe transparent zu machen und ermöglicht die Beobachtung von tiefen Strukturen. Einige Arten von Eintauchlösungen hydrophobe Eigenschaften aufweisen, die während des Entwässerungsverfahrens in schnellen Fluoreszenzlöschung führen. Daher sind diese Verfahren nicht mit Fluoreszenzabbildung über einen langen Zeitraum 11,12 kompatibel. Anstelle von hydrophoben Reagenzien verwenden , um andere Methoden hydrophile Reagenzien zur Gewebe Clearing-, wie SeeDB 4 und Sca l e 6, das die Strukturinformation und Fluoreszenz des biologischen Gewebes 4,6,8 aufrechtzuerhalten. Allerdings Makromoleküle, einschließlich Antikörper, kann nicht den Kern des intakten Gewebes durch Diffusion allein erreichen. Daher ist die vorge Markierung von Zielmolekülen in tiefen Bereichen dicht gepackte Gewebe technisch anspruchsvoll. In einem kürzlich entwickelten Gewebe-Clearing - Verfahren, CLARITY 3, ein Hydrogel eingebettet biologisches Gewebe iS mit Acrylamid gebildet und Lipiden durch Elektrophorese unter Natriumdodecylsulfat (SDS) -haltigen Lösung entfernt werden. Die Probe wird dann in einer Lösung mit einem passenden Brechungsindex Licht 3 Streuung reduzieren getaucht. Die Lipidentfernungssystem wurde später in fortgeschrittenen CLARITY 13 und PACT (passive Klarheit Technik) 10 modifiziert. Nach der Polymerisation vernetzen acrylamid Ketten mit Proteinen, hydrogel-bildenden Gewebe. Lipidkomponenten mit Acrylamid nicht vernetzen können; Somit Lipide können durch Elektrophorese unter dem SDS-enthaltenden Puffer eliminiert werden. Durch die aktive Eliminierung von Lipiden, Hirngewebe deutlich erhöht Transparenz 9. Allerdings sind diese Methoden nicht die Unmöglichkeit, tief Kennzeichnung durch freie Diffusion adressieren. Um diese Einschränkung zu, Techniken für den aktiven Transport von Reagenzien in die tiefsten Teile der dicken Gewebe zu überwinden sind erforderlich. Obwohl ermöglicht CLARITY Gewebe Clearing- und TiefengewebsmassageVisualisierung, es ist keine einfache oder schnelle Prozedur. Es kann mehrere Wochen dauern , eine ganze Mäusegehirn 7,14 zu löschen. Schnelle Abwicklung von Gewebe ist wesentlich für die Anwendung solcher Methoden auf der Grundlagen- oder klinischen Labor-Einstellungen für Life-Science-Forschung oder Volumen Diagnose. Das aktuelle Protokoll sieht ein vereinfachtes Verfahren zur biologischen Gewebe Freigabe und nachfolgende Proteinnachweis durch druckunterstützten Lieferung Immunfärbung. Es ist geeignet für hochauflösende Abbildungsvolumen großer abgelegt und 3D-Datenverarbeitungssysteme durch Kombination mit bildgebenden Verfahren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Lugen SCI&#160;</td>
			<td style="width:201px;">LGB-1175-4B</td>
			<td style="width:191px;">sample fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">75820</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,2&#8217;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Wako Pure Chemical Industries&#160;&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VA-044</td>
			<td style="width:191px;">Hydrogel monomer solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Boric acid</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">76324</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">18220</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">1310-73-2</td>
			<td>ETC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:201px;">sc-2323A</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">T8787</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">S2002</td>
			<td>Immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Collagen type &#8547;</td>
			<td style="width:175px;">Abcam</td>
			<td style="width:201px;">AB6586</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tyrosine hydroxylase (TH)</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td style="width:201px;">AB152</td>
			<td>Antibody/immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:201px;">711-165-152</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies - Molecular Probes</td>
			<td>A21206</td>
			<td style="width:191px;">Secondary antibody/ immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Confocal dish</td>
			<td style="width:175px;">SPL lifesciences</td>
			<td style="width:201px;">101350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:201px;">SP8</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sucrose</td>
			<td style="width:175px;">Junsei chemical</td>
			<td style="width:201px;">31365-0301</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Urea</td>
			<td style="width:175px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:201px;">23036</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:201px;">122262</td>
			<td>CUBIC-mount solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:247px;">ECT chamber</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">ECT chamber controller</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10201</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12101</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Peristatic pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">YZ1515X</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Buffer reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C10401</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue container&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12001</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Container holder for 1 tissue container</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12002</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse brain slice holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12004</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Whole rat brain holder</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12007</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Peristaltic pump tubing</td>
			<td style="width:175px;">Logos Biosystems, Inc.</td>
			<td style="width:201px;">C12104</td>
			<td>ETC system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Tabletop-centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Hanil science industrial Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">MICRO 12</td>
			<td>c-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:175px;">Baoding longer precision pump Co., Ltd</td>
			<td style="width:201px;">LSP02-1B</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:175px;">Korea vaccine Co., Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">KV-S20</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">3-way stopcock</td>
			<td style="width:175px;">Hyupsung medical Co.,Ltd.</td>
			<td style="width:201px;">HS-T-01N</td>
			<td>s-PRESTO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

Die Identifizierung und Erforschung der detaillierten Organisation von Organen oder des ganzen Körpers auf zellulärer Ebene sind grundlegende Herausforderungen in der Biologie. Übergangsverfahren erfordern eine erhebliche Menge an Zeit und Mühe, ein 3D-Bild zu erhalten, und das intakte Gewebe, einschließlich Schneiden, Immunmarkierung, und Abbildungs ​​seriell geschnittene Gewebe, die bei jedem Schritt des Prozesses einen Informationsverlust erzeugt. In jüngster Zeit entwickelten Ansätze für hochauflösende Bildgebung in intaktem Gewebe, molekulare Charakterisierung wurde auf die Markierung von Proteinen beschränkt. Doch derzeit verfügbaren Protokolle für Orgel Clearing erfordern eine beträchtlich lange Prozesszeit, wodurch es schwierig Gewebe Clearing-Techniken im Labor zu implementieren. Wir stellten kürzlich eine schnelle und hoch reproduzierbare Protokoll bezeichnet ACT-PRESTO (a ctive c nungsmäßigkeit t echnique- p ruck r beschwingt e ffizient und s Tabelle t ransfervon Makromolekülen in o rgans), die für die Gewebezwischenraum innerhalb mehrerer Stunden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ACT-PRESTO schnelle Immunmarkierung mit konventionellen Methoden und beschleunigt Antikörper das Eindringen in die tiefe Schicht aus dicht gebildeten, dicken Proben durch Druck oder Konvektionsströmung Anwendung. Wir beschreiben, wie Gewebe herzustellen, wie durch Lipidentfernung zu löschen Elektrophorese und wie-Fleck Immuno durch einen druckunterstützten Lieferung. Die Schnelligkeit und Konsistenz des Protokolls wird die Leistung von 3D-histologischen Forschung und volumenbasierte Diagnosen beschleunigen.

ACT-Gewebe Clearing Ein wichtiger Faktor Gewebe Clearing beeinflusst, ist Gewebefixierung. PFA Fixierung und Acrylamid Infusion sind separate Schritte in diesem Protokoll. Nach dem gewebe Hydrogel Polymerisationsschritt wird die freie A4P0 Lösung nicht polymerisiert, obwohl gewebe infundiert Hydrogele vernetzte mit endogenen Makromoleküle sind. Kein Gel sollte außerhalb des Gewebes (2A) bilden daher. Die ACT-Verfahren führt zu einer geringeren Vernetzung zwischen Proteinen und Acrylamid zu der CLARITY-Protokoll verglichen. Dementsprechend ist das gewebe Hydrogelprobe poröser. Diese Funktion ermöglicht die schnelle Extraktion von Lipiden und die Diffusion von Makromolekülen. Abschnitte des Mausgehirn 1- bis 2-mm Dicke wurden innerhalb von 1 ausreichend gelöscht - 2 h (2B), und 5 - 6 h der ETC war ausreichend für clearance ganzer Mäusehirnen (Abbildung 2C). Hydrogel-vermittelte induzierte Gewebe Clearing die Expansion des Gewebes nach dem ETC-Schritt, aber das Gewebe wieder auf seine ursprüngliche Größe in Brechungsindex angepassten Lösung. Das Gewebe-Hydrogelprobe in dem ACT Verfahren gebildet ist hochporös und somit kleinen Verbindungen und Makromoleküle konnten eindringen effizient und leicht diffundieren (Abbildung 3). Nach einer 2-stündigen Inkubation von 1-mm Hirnschnitten mit Tyrosin - Hydroxylase (TH) und Typ IV - Antikörper Collagen, ein anschließender 2-stündiger Inkubation mit einem sekundären Antikörper ausreichend war , dopaminergen Neuronen in einem 500 &amp; mgr; m Tiefe (Figur 3) zu etikettieren . PRESTO-Gewebe Immunmarkierung Dense Organe haben im allgemeinen hohe Konzentrationen an ECM-Fasern, die das Eindringen von Antikörpern in das Gewebe wirkt. So Antikörper PENETbis zu einer Tiefe von nur 20-30 &amp; mgr; m in dichtem Gewebe, wie Nierengewebe, nach 12 Stunden Inkubation bewertet. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwarfen wir aktive Makromolekül Penetration Methoden, die die Lieferung von Reagenzien in tiefe Gewebe zu ermöglichen, nämlich PRESTO (druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in die Organe) (Abbildung 4). Im Vergleich zur statischen Inkubation von ACT-processed Nierengewebe mit Antikörperlösungen, die Anwendung von Zentrifugalkräften (600 · g) mit einer Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) stark verbessert Antikörper Lieferung in tiefe Gewebe (Abbildung 5). Wenn wir die c-PRESTO Verfahren zu dichten Gewebe aufgetragen, 3 h Inkubation ausreichend war, 250- bis 300 &amp; mgr; m tiefen Strukturen zu beschriften. Um die Gewebeverzerrung ohne signifikante Gewebeschäden zu verbessern, die wir entworfen auch eine Maschine, die Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) zur Verfügung stellt. Dieser Prozess ähnlich Antikörper pe verbessertnetration Vergleich zu passiven Diffusion (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figure 1. Herstellung des s-PRESTO Vorrichtung. A. Eine Spritze (30 ml) und Dreiwegehahn. B. Der Dreiwegehahn verbunden und mit der Spritze aufgeklebt. C. Die Spritze , die die Probe und Antikörperlösung enthält, und die Spritze auf der Spritzenpumpe gegeben. D. Die Spritzenpumpe und Arbeitsbedingung - Setup. E. Die Pumpe flößt eine Lösung , die die Markierungsreagenzien in die Probe enthält. Wenn das bezeichnete Volumen erreicht ist, zieht sich die Pumprichtung ändert und die Lösung nach einer bestimmten Zeitspanne. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2. ACT Gewebe Clearing von Gehirn der Maus. A. Nach der Polymerisation werden freie A4P0 Lösungen nicht polymerisiert werden ; Gewebe infundiert Hydrogele werden durch Vernetzung mit endogenen Makromoleküle geliert. B. 1- bis 2 mm dicke Gehirnschnitte wurden für 1 gelöscht - 2 h, und das Ausmaß der Expansion und Größe Erholung Reflexionsindex (RI) Zusammenpassender Lösung wurden aufgezeichnet. C. Die Dicke der gesamten Gehirn der Maus beträgt etwa 0,8 cm und 5 - 6 h der ETC ausreichend wurde zum Gehirn vollständig klar. Nach 3 h von ETC gab es eine erhebliche Menge an nicht geräumten Gewebe. Mit 6 h von ETC hatte jedoch das Löschen des gesamten Gehirns auftrat. Die Farbe des Gewebes nach ACT in dem ETC-Puffer ist weiß oder undurchsichtig. Durch RI Einstellung, werden Gewebe transparent. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken sie</a>e eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Abbildung 3. Immunmarkierung mit ACT-gelöscht Maus Gehirngewebe. Bilder von ACT-processed 1-mm Maushirnschnitten der Maus Hirnrinde mit einem Antikörper gegen Kollagen Typ IV und ein Teil des Mittelhirns mit einem Antikörper gefärbt gefärbten zeigt, auf Tyrosinhydroxylase (TH). Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Abbildung 4. PRESTO Immunmarkierungsmethoden. Antikörper können nicht in dichtem Gewebe durch Diffusion eindringen. PRESTO Immunomarkierung Methoden wurden entwickelt, um aktiv Makromoleküle ziehen lassen und Reagenzien zu liefern indichte Gewebe. Die Anwendung von Zentrifugalkräften eine Standard-Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) unter Verwendung erleichtert deutlich die Lieferung von Antikörpern. Appling Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) verbesserte Antikörper Penetration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Abbildung 5. PRESTO Immunmarkierung von ACT-gelöscht dichtem Gewebe. Für c-PRESTO wurden die Gewebe bei 600 × g für 3 Stunden zentrifugiert, um eine Standard-Tischzentrifuge, um das Eindringen von primären und sekundären Antikörpern zu beschleunigen. Für s-PRESTO wurde eine Spritzenpumpe verwendet, um die Antikörper zu liefern. Maus-Organen, wie Niere und Leber wurden mit Kollagen Typ IV bezeichnet. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, 3 hc- oder s-PRESTO verbessert deutlich die Kennzeichnung Tiefe. In der Niere und Leber, erreicht die Tiefe der Z-Achse von 300 bis 350 um oder tiefer in PRESTO Proben (rechts), während die Kontrollproben in einer Tiefe von nur 40 - gekennzeichnet sind, 50 &amp; mgr; m (links). Ein 3D-rekonstruierte Bild wurde mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Aufrufe.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet. 

Serie: ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Forschung

Biologie

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging with high molecular specificity 1. The sensitivity of these techniques, however, is many orders of magnitude weaker than fluorescence, requiring milli-molar molecular concentrations 1,2. Here, we describe a technique that can enable the detection of weak or low concentrations of Raman-active molecules by amplifying their signal with that obtained from strong or abundant Raman scatterers. The interaction of short pulsed lasers in a biological sample generates a variety of coherent Raman scattering signals, each of which carry unique chemical information about the sample. Typically, only one of these signals, e.g. Coherent Anti-stokes Raman scattering (CARS), is used to generate an image while the others are discarded. However, when these other signals, including 3-color CARS and four-wave mixing (FWM), are collected and compared to the CARS signal, otherwise difficult to detect information can be extracted 3. For example, doubly-resonant CARS (DR-CARS) is the result of the constructive interference between two resonant signals 4. We demonstrate how tuning of the three lasers required to produce DR-CARS signals to the 2845 cm-1 CH stretch vibration in lipids and the 2120 cm-1 CD stretching vibration of a deuterated molecule (e.g. deuterated sugars, fatty acids, etc.) can be utilized to probe both Raman resonances simultaneously. Under these conditions, in addition to CARS signals from each resonance, a combined DR-CARS signal probing both is also generated. We demonstrate how detecting the difference between the DR-CARS signal and the amplifying signal from an abundant molecule's vibration can be used to enhance the sensitivity for the weaker signal. We further demonstrate that this approach even extends to applications where both signals are generated from different molecules, such that e.g. using the strong Raman signal of a solvent can enhance the weak Raman signal of a dilute solute.

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combination of three single wavelength short-pulsed lasers is used to generate coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and doubly-resonant CARS (DR-CARS). The difference between these signals provides enhanced sensitivity for otherwise difficult to detect coherent Raman signals, enabling imaging of weak Raman scatterers.

Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of interest. When considering the analysis of complex biological systems, the segmentation of three-dimensional image data is a time consuming and labor intensive step. With the increased availability of many imaging modalities and with automated data collection schemes, this poses an increased challenge for the modern experimental biologist to move from data to knowledge. This publication describes the use of SuRVoS Workbench, a program designed to address these issues by providing methods to semi-automatically segment complex biological volumetric data. Three datasets of differing magnification and imaging modalities are presented here, each highlighting different strategies of segmenting with SuRVoS. Phase contrast X-ray tomography (microCT) of the fruiting body of a plant is used to demonstrate segmentation using model training, cryo electron tomography (cryoET) of human platelets is used to demonstrate segmentation using super- and megavoxels, and cryo soft X-ray tomography (cryoSXT) of a mammalian cell line is used to demonstrate the label splitting tools. Strategies and parameters for each datatype are also presented. By blending a selection of semi-automatic processes into a single interactive tool, SuRVoS provides several benefits. Overall time to segment volumetric data is reduced by a factor of five when compared to manual segmentation, a mainstay in many image processing fields. This is a significant savings when full manual segmentation can take weeks of effort. Additionally, subjectivity is addressed through the use of computationally identified boundaries, and splitting complex collections of objects by their calculated properties rather than on a case-by-case basis.

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Segmentation of three-dimensional data from many imaging techniques is a major bottleneck in analysis of complex biological systems. Here, we describe the use of SuRVoS Workbench to semi-automatically segment volumetric data at various length-scales using example datasets from cryo-electron tomography, cryo soft X-ray tomography, and phase contrast X-ray tomography techniques.

Volumen-Segmentierung und Analyse von biologischen Materialien mit SuRVoS (Super-Region Volumen Segmentierung)-Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.