Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
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Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

NOTA: Todo el uso de animales en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center. 1. Tratamiento de Animales y Tejidos <ol><li> Administración y Sacrificio <ol><li> Anestesiar los animales utilizando 3% de isoflurano durante 5 minutos y comprobar la profundidad de la anestesia mediante la observación de la ausencia del reflejo toe-pinch. Aplique un ungüento veterinaria para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Pesar el animal y pipetear una dosis de 50 mg / kg de marcado con rodamina, ya sea ELP, SynB1-ELP, o Tat-ELP en un tubo de 1,5 ml. Guardar 100 l de los compuestos marcados administrados para la formulación de las curvas de calibración en pasos posteriores. Nota: Es importante que las normas pueden realizar desde el mismo lote de proteína marcada se administra a los animales con el fin de evitar diferencias debidas a la variabilidad en la eficiencia de marcaje fluorescente. Con el fin de eliminar adecuadamente FLUORESCENTE fondocencia a partir de mediciones de fluorescencia posteriores, un animal no tratado debe sacrificarse utilizando los mismos métodos / reactivos como los animales tratados. </li><li> Administrar una inyección IV como se ha descrito anteriormente 1 utilizando la vena de la cola o la vena femoral (la que se accede a través de una incisión de 1 cm en la ingle). Para la analgesia, si hacer una incisión en la ingle, administrar por vía subcutánea carprofeno a una dosis de 5 mg / kg, y aplicar Sensorcaine al lugar de la incisión antes del cierre con un clip de la herida. Para administrar por vía intranasal (IN), coloque el animal en posición supina. </li><li> Con una pipeta de 2 l, elaborará una caída de 1 l de compuesto marcado. Brevemente deslizar la cabeza del animal desde el collar anestesia para permitir el acceso a los orificios nasales. </li><li> Coloque la punta de la pipeta para la apertura de un solo orificio nasal y lentamente presione el émbolo, lo que permite que la gota se agote el orificio nasal en la cavidad nasal. Repetir cada 1 min, alternando las fosas nasales hasta la última gota hasta que la dosis completa es administrado. Nota: El volumen máximo se administra a través de IN no debe exceder de 10 - 15 l para ratones. </li><li> Dejar a los animales en decúbito supino bajo anestesia durante 10 minutos después de la administración final antes de pasar a cada uno en una jaula individual. Nota: No deje a los animales sin vigilancia hasta que hayan recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. </li><li> 1 h después de la administración, volver a anestesiar a los animales como antes y sacrificarlos a través de la perfusión transcardial utilizando PBS (210,0 mg / l KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / l de NaCl, 726 mg / L de Na 2 HPO 4 .7H 2 O) a 10 ml / min para un total de 20 ml. Nota: la perfusión de los animales en el sacrificio para eliminar toda la sangre de los tejidos se requiere para determinar las concentraciones extravasculares de los compuestos marcados. reactivos de perfusión puede resultar en cambios en la fluorescencia de fondo y debe ser mantenido constante. El método de sacrificio debe ser coherentedentro de los grupos. Diferentes métodos de sacrificio puede resultar en niveles variables de la sangre dentro de la vasculatura, el cambio de la fluorescencia de fondo de los tejidos. </li></ol></li><li> Colección de Tejidos <ol><li> Preparar PBS como se describió anteriormente para el lavado de los tejidos extraídos. Nota: Si se utiliza otro búfer como el líquido de perfusión, enjuague tejidos en el mismo tampón. </li><li> Retire el corazón, los pulmones, el estómago, el hígado, el bazo y los riñones por simple disección. Brevemente enjuague en PBS antes de usar el laboratorio limpia para acariciar seco o absorber la humedad excesiva y la colocación de los tejidos sobre el tapiz de imágenes. </li><li> Decapitar al ratón y quitar la parte superior del cráneo usando cortadores de hueso o gubia. Con unas pinzas, retirar con cuidado el cerebro, manteniendo intactos los bulbos olfatorios. Enjuague y seco, y lo coloca en el tapete de imagen proporcionada. </li><li> Para extraer la médula espinal a través de la rápida eyección 7, llenar una jeringa de 10 ml con PBS y se conecte una aguja de calibre 18 sin filo. Nota: 18 encaja calibreel adulto conducto vertebral de muchas líneas de ratón. El diámetro requerido variará con el tamaño del animal. </li><li> Colocar el animal en decúbito prono, asegurando que la apertura del canal espinal en el sitio de la decapitación se corte limpio y libre de sangre. </li><li> Quitar la piel de alrededor de la columna vertebral. El uso de los cortadores de hueso afilado o tijeras, cortar a través de la columna vertebral en la sección lumbar rostral directamente a las caderas. </li><li> Brevemente enjuague con PBS para visualizar el canal espinal. Suavemente inserte la aguja en el canal espinal. Nota: La aguja debe sentirse cómodo y puede requerir un poco lento balanceo de ida y vuelta durante la inserción. En caso de que la aguja sentirse sueltas, un corte más rostral se puede hacer o podría ser necesaria una aguja de mayor diámetro. </li><li> Con el dedo pulgar y el índice, aplicar presión a la columna vertebral alrededor de la aguja insertada. Presione el émbolo con una presión moderada y constante. La médula espinal se expulsará a cabo intacta de la abertura rostral de la médulacolumna. Nota: La eliminación completa, enjuague y secado de todos los órganos principales pueden ser terminados razonablemente en 5-7 min. Este corto tiempo evita la necesidad de un almacenamiento prolongado en PBS, lo que podría dar lugar a una exposición excesiva a la luz y la lixiviación de proteínas marcadas desde el tejido. </li></ol></li></ol> 2. Total de órganos ex vivo la imagen de fluorescencia <ol><li> Parámetros de imagen <ol><li> Ejecutar el software de adquisición de imágenes. En la parte inferior derecha del panel de control de impresión óptica, haga clic en &quot;inicializar&quot;. </li><li> En &quot;modo de imagen&quot;, seleccione la casilla de verificación &quot;fluorescente&quot;. En &quot;tiempo de exposición&quot;, seleccione &quot;AUTO&quot;. </li><li> En &quot;hurgar en la basura,&quot; seleccionar &quot;pequeña&quot; y establecer el F / parada a 2. </li><li> Seleccione la excitación de 535 nm y filtros de emisión de 580 nm. Nota: Esto variará dependiendo de la etiqueta utilizada. </li><li> Seleccione &quot;Campo de visión B&quot; y establecer el Target altura de 0,3 cm. Nota: Esto variará dependiendo de los tejidos que se van. </li><li> Una vez que el indicador de temperatura se vuelve verde (lo que significa que la máquina está totalmente inicializado), colocar los tejidos en el fondo estera de negro siempre, lo que garantiza que los tejidos se separan completamente una de otra. Coloca la base en el generador de imágenes, asegurando que todos los tejidos están dentro de la red de área seleccionada. tejidos más grandes y no homogéneas, como todo el hígado, deben ser dispuestos de tal manera de reducir la superposición de los lóbulos. Nota: Los tejidos pueden estar dispuestos juntos en un solo grupo, lo que permite una imagen para dar cabida a un solo animal o todos los tejidos de un tipo similar. Esto hace más fácil el análisis y la organización más adelante. Si las grandes diferencias en la intensidad de la fluorescencia están presentes entre los diversos tejidos, lo mejor a la imagen de forma individual o como grupos del mismo tipo de tejido es, como un solo tiempo de exposición puede no ser ideal para todas las intensidades de tejido. </li><li> Haga clic en &quot;Adquirir&quot;. </li><li> Después de imagen, extraer los tejidos inmediatamente y almacenar o congelarlos para histología cuantitativa, como se indica en el paso 4. </li></ol></li></ol> 3. Normas y Procesamiento de Imágenes <ol><li> normas <ol><li> En PBS, crear de dos veces diluciones en serie de cada proteína usada en el tratamiento de los animales, a partir de la concentración original, con un total de 15 diluciones. Nota: El intervalo de concentración debe aspirar a incluir las concentraciones en los tejidos esperados y puede requerir diluciones adicionales de la muestra original, dependiendo de la concentración de partida. </li><li> Pipetear 100 l de cada estándar en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de color negro. Incluir un pocillo de PBS puro para obtener una medida de la fluorescencia de fondo. </li><li> La imagen de los estándares con los mismos parámetros utilizados para la formación de imágenes de tejidos. </li><li> En el software de adquisición de imágenes &quot;paleta de herramientas&quot; en &quot;Herramientas de ROI,&quot; seleccione la &quot;zona de interés (ROI) &quot;Círculo y dibujar el retorno de la inversión en torno a un pozo. Entendido ROI a todos los otros pozos llenos y haga clic en &quot;medir el rendimiento de la inversión.&quot; </li><li> Restar el valor promedio de la eficiencia radiante de la pura PBS a partir de los valores de las otras normas; esto elimina la fluorescencia de fondo. Colocar los valores frente a la concentración conocida en un gráfico de dispersión. Nota: La ecuación resultante de la línea de tendencia lineal se puede usar entonces para calcular el valor de fluorescencia relativa. </li></ol></li><li> Procesamiento de imágenes <ol><li> En el software de adquisición de imágenes, seleccione la herramienta ROI de forma libre y dibujar regiones de interés alrededor de cada uno de los tejidos individuales. Haga clic en &quot;medida&quot;. </li><li> Con las mediciones de eficiencia radiante promedio resultantes, restar los valores medidos a partir del animal sin tratar para cada tipo de tejido y representar gráficamente estos valores en la curva patrón previamente creada. Nota: Los valores de fluorescencia relativa resultantes proporcionan una instantánea rápida y precisa de labiodistribución del compuesto marcado. </li></ol></li></ol> 4. Histología Tejido cuantitativa <ol><li> Preparación y congelación de los tejidos para rebanar <ol><li> Crear o comprar los envases de tamaño suficiente para congelar los tejidos elegidos y criostato para ser utilizado. Envolviendo papel de aluminio alrededor de un objeto adecuadamente dimensionado y conformado funciona bien. </li><li> Preparar una mezcla de isopropanol y hielo seco rellenando medio de un vaso de precipitados de 500 ml con hielo seco y añadiendo ~ 350 ml de isopropanol de manera que hay suficiente líquido por encima del hielo seco para sumergir parcialmente el recipiente de congelación. Nota: El nitrógeno líquido a menudo da como resultado la fractura del compuesto de temperatura óptima de corte (OCT), y los tejidos incrustados y debe ser evitado. </li><li> Llene el recipiente de congelación parcial con PTU, asegurándose de que no hay burbujas presentes. Si hay burbujas, las burbujas de trabajar fuera de la solución el uso de fórceps o un implemento similar. </li><li> Eliminar el tejidode PBS y se seca a fondo, ya sea con palmaditas suavemente con un paño de laboratorio o al tocar los bordes de los tejidos delicados a un laboratorio de limpiar y permitiendo que el líquido que absorbe y expulsa de distancia. </li><li> Coloque el tejido suavemente en la OCT en el interior del contenedor de congelación, asegurando de no introducir burbujas debajo del tejido. Una vez que el tejido está en su lugar, añadir octubre hasta que el tejido está completamente cubierta. </li><li> Sumergir el recipiente de congelación tanto como es posible sin permitir que el isopropanol entre en contacto con la OCT expuesto dentro del recipiente. Dejar 30 - 90 s (o posiblemente más para los tejidos más grandes) para los PTU y el tejido a congelar por completo antes de guardar a -80 ° C durante el tiempo que sea necesario. </li></ol></li><li> Preparación de Normas para rebanar. <ol><li> Preparar y etiquetar adecuadamente de 1 mL jeringas de un solo uso mediante la eliminación del extremo del cilindro, de manera que toda la longitud de la jeringa es un diámetro. Esto permitirá que el cilindro congelado para ser empujado hacia fuera más tarde. </li><li> Nosing octubre, crear una dilución en serie de dos veces de 15 pasos de compuestos administrados, como se hizo con PBS previamente, pero con un volumen resultante final de 1 mL. Incluir una muestra de pura PTU para su eliminación de los valores de fluorescencia de fondo. </li><li> La viscosidad de la TCO hace difícil una mezcla adecuada. Invertir los tubos y permitir que los PTU se estabilice completamente antes de invertir de nuevo. Repita esto 10 - 20 veces para asegurar una mezcla uniforme. Mantener las soluciones estándar a 4 ° C y protegido de la luz durante la mezcla. </li><li> Después de la mezcla, de nuevo preparar una mezcla de isopropanol y hielo seco, como antes. Nota: El nitrógeno líquido también se puede utilizar en lugar de la mezcla de isopropanol / hielo seco, siempre que las jeringas se eliminan rápidamente después de que se han congelado sólido. </li><li> Dibuje la norma PTU en la jeringa, teniendo cuidado de introducir el menor número posible de burbujas. Después de la elaboración de la solución PTU, sumergir inmediatamente la jeringa directamente en el isopropanol y permita que la solución se congele completamentedentro de la jeringa durante 10 - 20 s. Guarde las jeringas a -80 ° C durante el tiempo que sea necesario. </li></ol></li><li> El corte de los tejidos y las Normas <ol><li> Coloque ambos tejidos y las normas de -20 ° C y dar tiempo suficiente para que todas las muestras alcancen la temperatura. Nota: La temperatura ideal de corte cae generalmente alrededor de la gama de -10 ° C para la mayoría de los tejidos, pero en última instancia depende del tamaño de los tejidos y el contenido de grasa y debe ser refinado empíricamente. </li><li> El uso de un criostato, cortar tejidos en rodajas gruesas 20-M y montarlos en portaobjetos, tal como se describe anteriormente 8. Almacenar las diapositivas a -20 ° C y mantenerlos lejos de la luz tanto como sea posible durante el corte y hasta la exploración. Nota: Es importante aquí que las secciones que han de medirse se distribuyen apropiadamente en todo el espesor del tejido. </li><li> Para montar las normas sobre el mandril criostato, tome la jeringa del congelador y calentar el exterior durante 3 - 5 s por holding en la mano. Empuje el émbolo hasta una sección corta (~ 1 cm) del cilindro de octubre está fuera de la jeringa. <ol><li> Utilizando una hoja de afeitar, cortar a través del cilindro y colocar la sección del cilindro resultante perpendicularmente sobre el mandril, mediante OCT para mantenerlo en su lugar. Esta configuración debe resultar en círculos bien definidos que se corte. </li></ol></li><li> Cortar los cilindros a 20 m, la colocación de una rebanada de cada dilución en una sola diapositiva, de modo que una diapositiva representa toda la curva estándar. Almacenar las diapositivas a -20 ° C hasta el momento de la exploración. </li></ol></li><li> Escaneo y Cuantificación <ol><li> Iniciar el software de la matriz de exploración y haga clic en &quot;543 láser&quot; para iniciar el procedimiento de inicio de láser. Esperar durante 15 minutos para que el láser para estar listo. </li><li> Una vez que el láser está listo, retire las diapositivas de -20 ° C y moverlos en un recipiente grande, protegido de la luz que alcance la temperatura y secar durante 3 min. Esto evitará la acumulación de humedad en el SLIde escáner. </li><li> Cargar la diapositiva en el receptáculo de diapositivas en el escáner de diapositivas. Haga clic en &quot;Scan&quot; y seleccionar &quot;ejecutar fácil exploración.&quot; </li><li> Ajuste la resolución de escaneo de hasta 50 micras. </li><li> Seleccione la primera casilla de verificación &quot;Usar&quot; en &quot;fluoróforo&quot; y seleccione &quot;TRITC.&quot; Establecer la ganancia PMT al 80%. Nota: Estos ajustes pueden variar dependiendo del fluoróforo y la concentración de las moléculas marcadas. </li><li> En el lado de la izquierda, asegúrese de que el área de escaneado incluye toda la diapositiva. Haga clic en &quot;Inicio&quot;. </li><li> Después de la exploración, seleccione &quot;archivo&quot; y &quot;guardar como&quot;, a continuación, guardar la imagen como un archivo .tif. Nota: Las diapositivas de los tejidos y las normas deben ser escaneados en los mismos ajustes. </li><li> Cargar las imágenes resultantes en ImageJ y seleccionar regiones de interés alrededor de los tejidos y las normas. En la pestaña &quot;analizar&quot;, seleccione &quot;Establecer mediciones&quot; y seleccione &quot;valor medio gris.&quot; Haga clic220; medida &quot;. Nota: Al igual que con la técnica anterior, la fluorescencia de fondo debe ser restado de todos los valores medidos. </li><li> Trazar las medidas medias de valor gris de las normas contra la concentración conocida para crear una curva estándar. Nota: Las mediciones resultantes de los tejidos deben ser promediados dentro de cada tejido y se representan en la curva estándar para determinar la concentración dentro del tejido. </li></ol></li></ol>

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GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

Si bien ex vivo de imágenes de todo el órgano es generalmente inmediata, la adhesión a algunos conceptos y técnicas básicas puede mejorar la precisión de las mediciones de la biodistribución. longitudes de onda corta de experiencia luz un alto grado de dispersión y absorción en la mayoría de los tejidos, lo que impacta significativamente la utilidad de los fluoróforos de longitud de onda corta. Estos fluoróforos tienen aplicación en estudios de tejidos profundos limitado, pero se han utilizado con ...

etiquetado fluorescente es un método fácilmente utilizado y efectivo para determinar la biodistribución de los compuestos, utilizando una gama de equipos que es común a muchos laboratorios. Los fluoróforos están ampliamente disponibles, relativamente barato, y vienen en una variedad de longitudes de onda, de manera que múltiples moléculas de etiquetado se pueden utilizar simultáneamente sin interferencias. La mayoría de los fluoróforos tienen una gama de químicas para la conjugación con diferentes grupos reactivos en los compuestos de interés, y el proceso de conjugación es generalmente sencillo para la mayoría de tipos de sitios reactivos. Además, el equipo necesario para las mediciones de compuestos marcados con fluorescencia son comunes en muchos laboratorios. microscopios fluorescentes, cámaras y escáneres de diapositivas se pueden usar en diferentes circunstancias, por lo que el uso del etiquetado fluorescente muy accesible. Los marcadores fluorescentes se utilizan con frecuencia para determinar la biodistribución y la cinética de compuestos tanto in vivo como ex vivo con dispositivos de imágenes en vivo, tales como el espectro IVIS Imager, y por la histología del tejido cuantitativa 2,3. El uso de formación de imágenes ex vivo de todo el órgano utilizando dispositivos de formación de imágenes en vivo se ha incrementado con el tiempo debido a su facilidad de uso y la capacidad para crear rápidamente una comparación precisa de las concentraciones relativas de los compuestos marcados sin requerir el procesamiento posterior de tissues4. Sin embargo, mientras ex vivo de formación de imágenes de todo el órgano puede permitir el análisis y la comparación fácil, que no genera una medida cuantitativa de concentraciones de compuesto absolutos dentro de un tejido. Esto es debido a los efectos de dispersión de luz dentro de los órganos intactos. Desde dispersión de la luz (y, en menor medida, absorbancia) varía según el tamaño y la densidad del tejido, formación de imágenes de todo el órgano puede subestimar los niveles de tejido en órganos grandes o densos. La formulación de estándares apropiados para las mediciones de concentración absoluta también es difícil porque hay que imitar el espesory la densidad de cada órgano individual. Por otro lado, las imágenes de todo el órgano es un método rápido para la obtención de los niveles tisulares relativas de un agente, y es ideal para la comparación de la relación bio-distribución de moléculas relacionadas con múltiples (por ejemplo, en los estudios de la orientación de la droga). Una estrategia alternativa es utilizar la histología de fluorescencia cuantitativa, una técnica derivada de la forma de autorradiografía cuantitativa, para obtener los niveles de tejido absolutos de un agente de prueba 5,6. En lugar de colocar un animal u órgano por completo en un dispositivo de imaginación, la histología del tejido cuantitativa requiere que ser cortado cada tejido, se montaron sobre portaobjetos, exploradas y analizadas individualmente. Normas de agente de ensayo se preparan y en rodajas en el mismo espesor que las muestras de órganos. Al cortar todos los órganos y las normas para el mismo espesor, la variabilidad debido a la dispersión de la luz o la absorbancia se elimina, y la intensidad de fluorescencia de tejidos puede estar en forma a la curva estándar para determinar concent absolutaracionar. Si bien este método, cuando se hace correctamente, es cuantitativa, sino que también es un trabajo intensivo y fácilmente manejado mal. Dada la naturaleza más compleja de la histología cuantitativa y la significativamente mayor costo de mano de obra en comparación con los de formación de imágenes de todo el órgano, se convierte en la pena examinar donde cada proceso es más práctico utilizar cuando se examina la bio-distribución de los compuestos marcados con fluorescencia. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo estos métodos se pueden utilizar juntos para comparar de manera eficiente la bio-distribución de marcado con rodamina elastina-como polipéptido (ELP), con o sin la adición de los péptidos que penetran en células SynB1 o Tat, a través de la intranasal (IN) y (iv) las vías de administración intravenosa.

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;Reagents&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimide derivitized fluorophors (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Buffer for rinsing</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Used for freezing and mounting</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Equipment&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For &lt;em&gt;ex vivo&lt;/em&gt; whole organ imaging</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>For cryosectioning</td></tr><tr><td>Fluorescence slide scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For slide scanning</td></tr></tbody></table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Etiquetado fluorescente es un proceso bien establecido para examinar el destino de moléculas marcadas bajo una variedad de condiciones experimentales tanto in vitro como in vivo. Las sondas fluorescentes son particularmente útiles en la determinación de la bio-distribución de las moléculas grandes administrados, donde es probable que afecten a la cinética o bio-distribución del compuesto de la adición de un marcador fluorescente de molécula pequeña. Existe una variedad de métodos para examinar bio-distribución que varían de manera significativa en la cantidad de esfuerzo necesario y si las mediciones resultantes son totalmente cuantitativa, pero el uso de múltiples métodos en combinación puede proporcionar un sistema rápido y eficaz para el análisis de los bio-distribuciones. Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método que se puede utilizar para comparar rápidamente las concentraciones relativas de las moléculas fluorescentes dentro de los tejidos y entre múltiples tipos de tejidos o grupos de tratamiento. El uso de un plat de imágenesformulario diseñado para animales vivos o de imágenes de todo el órgano, fluorescencia dentro de los tejidos intactos se puede determinar sin más trámite, ahorrando tiempo y mano de obra al tiempo que proporciona una imagen precisa de la bio-distribución general. Este proceso es ideal en los experimentos que tratan de determinar la especificidad de tejido de un compuesto o para la comparación de múltiples compuestos diferentes. la histología del tejido cuantitativa por otro lado requiere una amplia procesamiento adicional de los tejidos con el fin de crear una medida cuantitativa de los compuestos marcados. Para evaluar con precisión la biodistribución, todos los tejidos de interés deben ser cortadas, escanean y se analizaron en relación con las curvas de calibración con el fin de hacer comparaciones entre los tejidos o grupos. histología del tejido cuantitativa es el estándar de oro para determinar las concentraciones de compuestos absolutos dentro de los tejidos. A continuación, describimos cómo ambos métodos se pueden utilizar juntos de manera eficaz para evaluar la capacidad de los diferentes métodos de administración de unand modificaciones compuestos de objetivo y administrar moléculas marcadas con fluorescencia para el sistema nervioso central 1.

Los datos siguientes describen la entrega de tres compuestos: un vector de suministro de fármacos conocidos como ELP y dos versiones de ELP modificado con péptidos que penetran en la célula (SynB1-ELP y Tat-ELP) 9. Los tres compuestos se marcaron con tetrametilrodamina-5-maleimida y se entregan a través de dos vías de administración (IN y IV). El objetivo de estos experimentos era determinar qué compuesto y vía de administración resultaría en la mejor penetración en el sistema nervioso central (CNS...

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método rápido para determinar las concentraciones relativas de los compuestos marcados con fluorescencia dentro de y entre los tejidos o los grupos de tratamiento. Por el contrario, la histología de fluorescencia cuantitativa, mientras que más mano de obra, permite la cuantificación de los niveles tisulares absolutos de moléculas marcadas.

El uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K vistas.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método rápido para determinar las concentraciones relativas de los compuestos marcados con fluorescencia dentro de y entre los tejidos o los grupos de tratamiento. Por el contrario, la histología de fluorescencia cuantitativa, mientras que más mano de obra, permite la cuantificación de los niveles tisulares absolutos de moléculas marcadas. 

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In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Imágenes in vivo de la angiogénesis tumoral usando fluorescencia confocal videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Investigación

Medicina

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Bioingeniería

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Investigación sobre el cáncer

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Seguimiento de patógenos de todo el órgano mediante cuantificación de reporteros fluorescentes

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor destacado: Desentrañando las respuestas bacterianas a los antibióticos y el sistema inmunitario en los tejidos

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

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Imágenes in vivo de la angiogénesis tumoral usando fluorescencia confocal videomicroscopia

Una novela de alta resolución

Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

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Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas