Name: use of a monocyte monolayer assay to evaluate fcγ receptor-mediated phagocytosis
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÎ³ Receptor-mediated Phagocytosis at JoVE.com

The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

Obtener la aprobación para el uso de muestras humanas por la junta junta de revisión ética de la investigación / institucional, y obtener el consentimiento firmado de todos los donantes humanos. El MMA también se puede realizar utilizando PBMCs de ratón de una manera similar como el ensayo humano, después de la aprobación de uso de animales de la ética. El MMA utiliza técnicas de cultivo de tejidos asépticas. NOTA: Consulte la Figura 1. NOTA: Aunque se recomienda el uso de una cámara de flujo laminar nivel 2 durante el ensayo para mantener una técnica aséptica, ya que el método sólo es un método de cultivo &quot;a corto plazo&quot;, no hay tiempo suficiente para que realmente las bacterias contaminen el ensayo. Por lo tanto, si una cámara de flujo laminar nivel 2 no existe, en lugar de comprar uno sólo para este ensayo, el ensayo se podría realizar fuera de una cámara de flujo laminar, en un banco abierto. El uso de una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2, sin embargo, no es una opción y debe ser utilizado pararesultados óptimos. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica 1. <ol><li> Obtener sangre humana entera de un donante sano o de un paciente a través de la punción venosa utilizando vacutainers que contienen ácido-citrato-dextrosa anticoagulante (ACD) (amarillo-tubos superiores). NOTA: La sangre entera se puede almacenar en ACD a temperatura ambiente (18-22 ° C) durante hasta 36 h antes de proceder al siguiente paso 11. Normalmente, 1-2 10 mL tubos vacutainer de sangre entera son suficientes para el ensayo. </li><li> Diluir la sangre completa 1: 1 v / v en caliente medio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, HEPES 20 mM, y 0,01 mg / ml de gentamicina). </li><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la sangre entera diluida utilizando centrifugación en gradiente de densidad, según lo recomendado por el fabricante (Ver Lista de Materiales). La capa de sangre diluida muy lentamente sobre el gradiente de densidad (calentó a temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Minimizar la cantidad de mixing en la interfaz para la separación óptima de la sangre por capas cuidadosamente la mezcla de la sangre de una forma gota a gota o mediante el uso de una pipeta. <ol><li> Dejar que la mezcla de sangre a la capa lentamente sobre la parte superior de la gradiente de densidad mediante la colocación de la punta de la pipeta cerca del gradiente de densidad y al permitir que la mezcla de sangre que corra por el lado del tubo muy lentamente. </li><li> Dependiendo de la escala del experimento, la capa de 10 ml de mezcla de sangre en la parte superior de 3 ml de gradiente de densidad (en un tubo de 15 ml) o capa de 35 ml de mezcla de sangre en la parte superior de 15 ml de gradiente de densidad (en un 50-ml tubo). Típicamente, 10 ml de sangre completa produce 10 millones de PBMCs, con alguna variación de donante a donante. NOTA: Es muy importante que no hay mezcla de la mezcla de sangre con el gradiente de densidad. La mezcla de sangre debe capa sobre el gradiente de densidad y aumentando lentamente hasta que toda la sangre es en la parte superior del gradiente de densidad. </li><li> Se centrifuga la mezcla en capas a 700 xg durante 30 min sin frenos. el centrifuged mezcla debe separarse en 5 capas (de arriba a abajo): plasma, capa leucocitaria (que contiene PBMC), material de gradiente de densidad, granulocitos y eritrocitos. </li><li> Retirar y desechar la mayoría de la plasma y recuperar cuidadosamente el contenido de la capa leucocitaria (PBMC) en un nuevo tubo de 15 ml usando una pipeta Pasteur y un bulbo de succión. NOTA: La eliminación de la capa de la capa leucocitaria se hace efectiva mediante la aplicación de succión en la pipeta Pasteur mientras se realiza un movimiento circular alrededor del exterior de la capa, con la punta de la pipeta contra el tubo. </li></ol></li><li> Lavar las PBMCs aisladas tres veces en pH 7,3 solución salina tamponada con fosfato (PBS) por centrifugación a 350 xg durante 10 min (con frenos completos) entre lavados. Reconstituir el sedimento de PBMC en medio completo RPMI. Dependiendo del tamaño de la pastilla, 3-7 ml de medio es suficiente. </li><li> Contar el CMSP usando azul tripán y un hemocitómetro. Sólo contar esas células que no están manchados por el azul de tripano. Reconstitute las PBMC a 1.750.000 células / ml en medio RPMI completo. </li><li> Seed 400 l (700.000 células) en cada pocillo de un porta-cámara de 8. Incubar el portaobjetos en un 37 ° C, incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificado (suplementado con 5% de CO 2) durante 1 h para permitir que los monocitos / macrófagos se adhieran. </li></ol> 2. Pre-tratamiento de monocitos Adheridos NOTA: Este paso sólo es necesario si buscando la manera de inhibir o potenciar la fagocitosis. <ol><li> Pre-tratamiento adherido monocitos con cualquier fármaco (s) o compuesto (s) de interés. Reconstituir el fármaco (s) u otro material de ensayo a la concentración deseada con medio completo RPMI. NOTA: Por ejemplo, 200 mg / ml de IVIG se usa típicamente para producir una inhibición del 95 a 100% de la fagocitosis utilizando monocitos humanos. </li><li> Aspirar y descartar el sobrenadante que contiene las células no adherentes de la corredera 8-cámara después de la 1 h de incubación (después del paso 1.6). Reemplazarlo con 400l de un fármaco u otro tratamiento y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. <ol><li> Al aspirar y sustitución de las soluciones en el portaobjetos de 8 cámaras, asegúrese de controlar el flujo de los fluidos de manera que las células débilmente adheridas no se despegan. Además, trabajar con sólo 2-3 pocillos vacíos a la vez y evitar el secado de los pozos. NOTA: Por lo general, cada tratamiento se realiza por triplicado técnicas. </li></ol></li></ol> 3. La opsonización de R 2 R 2 Glóbulos Rojos NOTA: El R2 R2 utiliza aquí se obtienen de la Colección Centro de Sangre (Canadian Blood Services), pero también están disponibles en el mercado. 2 RBCs opsonizado R 2 R se utilizan como un control positivo para la fagocitosis mediada por FcyR. Naïve R 2 R 2 se debe almacenar en solución de Alsever (para prolongar la vida útil) a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. solución de Alsever se hace en la casa y consta de 0,8% W / v de ácido cítrico v de citrato trisódico (dihidrato), 1.9% w / v de dextrosa, 0,42% w / v de cloruro de sodio, y 0,05% w / (monohidrato). Si R 2 R 2 células no están disponibles, otras células phenotyped-Rh, tales como R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, o R 2 r, se puede utilizar. <ol><li> Lavar R2 R2 (CDE / CDE) de glóbulos rojos en PBS con un total de tres veces usando centrifugación a 350 xg durante 5 minutos cada uno. NOTA: La cantidad de glóbulos rojos necesarios depende del tamaño experimental y puede ser calculado de nuevo. Siempre lave una cantidad en exceso de los glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se pierden durante cada lavado debido a la lisis o durante la eliminación del sobrenadante. Por ejemplo, en un experimento con 5 tratamientos y 2 controles, todos llevados a cabo por triplicado técnicos, hay un total de 21 pozos. 21 pozos con 400 mezcla de l / pocillo de 1,25% RBC indica que 105 l de empaquetado, opsonizado se necesitan RBC. 200 l de RBC se debe lavar inicialmente y 150 &amp; #181; L debe opsonizado para asegurar que hay una cantidad adecuada de glóbulos rojos para la etapa de la fagocitosis. </li><li> Opsonizar el lavado R 2 R 2 pellet con 1: 1 de anticuerpos / v policlonales v anti-D a partir de suero humano y se incuba durante 1 h a 37 ° C, con mezclado intermitente. NOTA: Si los anticuerpos policlonales anti-D no están disponibles, es posible usar anticuerpos monoclonales anti-D, que están disponibles comercialmente, o anti-D que se utiliza normalmente para Rh profilaxis inmune, que puede obtenerse de bancos de sangre o transfusión servicios. pruebas de optimización debe llevarse a cabo al principio, al establecer el ensayo, y cuando vaya a cambiar un montón de anticuerpos policlonales un-titularon o cambiar a un anticuerpo monoclonal. Esto es para identificar la concentración óptima o volumen de anti-D requerida para una prueba de antiglobulina (IAT) resultado de entre 3+ y 4+ y un resultado de la fagocitosis de entre 70 a 90 eritrocitos fagocitados por 100 monocitos contados. </li><li> Lavar el opsonized R 2 R 2 un total de tres veces en PBS mediante centrifugación a 350 xg durante 5 min cada uno. NOTA: opsonización exitosa de R 2 R 2 se puede confirmar mediante la realización de un IAT indirecta. Brevemente, se añaden secundarias anticuerpos anti-humanos policlonales para unirse a anticuerpos de opsonización primarias en superficies de glóbulos rojos, y la señal amplificada se pueden observar en la forma de la hemaglutinación. Un protocolo detallado fabricante se puede encontrar en el archivo de materiales suplementarios. </li><li> Reconstituir el lavado R 2 R 2 pellet al 1,25% v / v utilizando un medio completo RPMI. NOTA: El exceso de R opsonizado 2 R 2 se puede almacenar en solución de Alsever a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li></ol> 4. La fagocitosis mediada por el receptor Fc <ol><li> Aspirar el fármaco o sobrenadante del medio de la corredera 8-cámara y añadir 400 l de la 1,25% v / v R 2 R 2 mezcla. Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> En popaer 2 h de incubación, retirar las cámaras que utilizan los adaptadores del fabricante. Frote el exceso de R2 R2 en una toalla de papel. Asegúrese de que la corredera no se seque. </li><li> Llenar un vaso de precipitados de 100 ml con PBS. Sumergir y lavar el carro moviendo lentamente la corredera hacia atrás y hacia adelante (en torno al 30-40 trazos) para eliminar la mayor parte de la ONU-fagocitados R2 R2. </li><li> Retire el portaobjetos del PBS. Frote el exceso de PBS usando una toalla de papel o tejido y seque al aire la diapositiva. </li><li> Fijar el portaobjetos se secaron al aire en metanol al 100% durante 45 s. A continuación, seque al aire la corredera fija. NOTA: Las diapositivas se pueden solucionar con otro método que es más compatible para la tinción de aguas abajo, tales como la mancha Grünwald-Giemsa 21 o la mancha de Wright-Giemsa 22. </li><li> Montar el porta por la en-casa-hecho de montaje Elvanol medio (u otro medio de montaje disponible en el mercado) y añadir cubreobjetos. NOTA: Elvanol medio de montaje se compone de 15% w / v poresina de alcohol lyvinyl y 30% v / v de glicerina en PBS. La mezcla se calienta hasta que toda la resina se haya disuelto y la glicerina es homogéneamente mezclado. Esto puede ser sustituido por otro medio de montaje disponible en el mercado. </li><li> Deje que el montaje se seque durante la noche antes de la cuantificación. </li></ol> 5. La cuantificación de la fagocitosis <ol><li> Utilizando un microscopio de contraste de fase y una lente objetivo de 40X, cuantificar manualmente la cantidad de eventos fagocíticas contando al menos 200 monocitos y el número de fagocitados R 2 R 2 dentro de estos monocitos. Tener un contador en cada mano para cuantificar simultáneamente el número de monocitos y el número de fagocitados R 2 R 2. </li><li> Obtener el índice fagocítico promedio dividiendo el número de fagocitados R 2 R 2 por el número de monocitos y multiplicando por 100. expresar los datos como la media (promedio) de índice fagocítico ± el error estándar de la media (SEM). </li&gt; </ol>

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The authors have nothing to disclose.

La MMA es una técnica laboriosa que requiere experiencia tanto en el cultivo de tejidos y la microscopía. Hay varios pasos críticos para asegurar el éxito: 1) generación de la monocapa de monocitos; 2) la opsonización de los glóbulos rojos, y 3) la cuantificación manual. La monocapa de monocitos no se adhiere muy fuertemente a la diapositiva cámara, por lo que el pH fisiológico debe mantenerse durante todo el ensayo de 11 y un número adecuado de PBMCs se debe sembrar. pipeteo vigoroso, lo que podría molestar a las células adheridas, deben ser evitados. Un enfoque es eliminar siempre y añadir soluciones de la misma esquina de la cámara y para asegurar que el movimiento es lento y constante. Del mismo modo, durante la última etapa de lavado para eliminar el exceso de glóbulos rojos, el movimiento debe ser lenta y constante. Esto asegura una mínima perturbación a la monocapa mientras que todavía la eliminación de la mayoría de los glóbulos rojos de la ONU-fagocitados. lavado inadecuado dará lugar a un alto fondo de los glóbulos rojos contaminantes, lo que hace qua Manualntification difícil. En segundo lugar, los R 2 R 2 RBCs deben ser suficientemente opsonizadas para obtener un índice de fagocitosis promedio de 80 a 120 para el control de la fagocitosis. Esta gama fagocítica deseada establece un equilibrio entre la facilidad de recuento (por ejemplo, los monocitos con más de 5 fagocitados RBCs son difíciles de cuantificar con precisión) y el mantenimiento de una cantidad adecuada de la fagocitosis para el análisis estadístico. El grado de opsonización puede ser confirmada por un IAT, y se necesita una lectura entre 3+ a 4+. El R 2 R 2 RBCs deben desecharse cuando hay exceso de lisis durante el lavado, cuando el sobrenadante se vuelve rojo oscuro, o cuando una disminución significativa en la fagocitosis se observa en los experimentos debido al envejecimiento de las células en almacenamiento. Por último, la cuantificación manual mediante el microscopio puede ser difícil, especialmente cuando se comparan los recuentos entre el personal del laboratorio y entre los experimentos. Examinando el mismo campo en cada pocillo, o simplemente contando más células, Un recuento más consistente se puede obtener. Se recomienda la formación de lado a lado con un técnico con experiencia y el uso de un conjunto designado de diapositivas de formación. Una crítica importante de la MMA es la subjetividad de la etapa de cuantificación manual. Sin embargo, con una formación adecuada, la consistencia se puede obtener a través de diferentes contadores. Otra limitación es la intrínsecas diferencias donante-donante en monocitos y capacidades fagocíticas en R 2 R 2 de superficie los niveles de expresión del antígeno, que es una fuente de variación de los datos cuando se trata de muestras humanas. Otras técnicas alternativas están disponibles para el examen de la fagocitosis mediada por FcyR. La mayoría de los kits comerciales utilizan salida fluorescente para controlar la fagocitosis (por ejemplo, biopartículas, la proteína de fluorescencia sensible al pH, o perlas de látex fluorescentes marcadas con IgG). El uso de la salida fluorescente sí ofrece una cuantificación más objetiva, pero también se necesita para conSider la disponibilidad, el coste, y la formación asociada con el uso de un microscopio de fluorescencia o un citómetro de flujo, así como la dependencia subsiguiente a kits disponibles en el mercado. Por último, este ensayo puede ser modificado dependiendo de la pregunta de investigación. Por ejemplo, cuando se prueba la inhibición de la fagocitosis de drogas, ya sea monocitos pueden ser tratados previamente o co-incubaron tanto con las drogas y los glóbulos rojos opsonizadas (es decir, un ensayo de competición). La señalización aguas abajo de anticuerpos de diferentes subtipos, anticuerpos quiméricos, o construcciones recombinantes también se puede probar. Con los recientes avances en el desarrollo de un análisis de sangre de antígeno nula universal de 24, el MMA se podría utilizar en las pantallas iniciales de estos glóbulos rojos antígeno nula con diversos anticuerpos para evaluar si efectivamente existe una eficacia baja en el desencadenamiento de la fagocitosis.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table><tbody><tr><td>Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Multicell&amp;nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (cDE/cDE) red blood cells</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-D from human serum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol resin</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Can be substituted with commercially available mount</td></tr><tr><td>UltraPure glycerine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Siguiendo los pasos cruciales en la figura 1 y el procedimiento descrito anteriormente, el MMA se puede realizar de forma reproducible. IVIG fue usado como un ejemplo para la inhibición de la fagocitosis en la Figura 2. IVIG se sabe que se unen y bloquear los receptores Fc, inhibiendo así el resultado corriente abajo de la fagocitosis. Por titulación de la cantidad de IVIG utilizada, se observa una inhibición dependiente de la dosis, en la que las concentraciones por encima de 200 mg / ml dio lugar a cerca de 100% de inhibición y concentraciones por debajo de 0,5 g / ml no inhibió en absoluto (Figura 2A). Cuando los índices fagocíticas se transforman y se normalizaron con el control positivo R 2 R 2 como 0% de inhibición, una curva de inhibición con una CI 50 de 3 mg / ml se puede determinar (Figura 2B). Además de realizar el ensayo de manera consistente, quantificación del ensayo a veces puede ser difícil. La Figura 3 es una colección de imágenes de microscopía de contraste de fase de varios toboganes de MMA. Con la experiencia microscopía, se puede distinguir un monocito de un RBC contaminante (Figura 3D), o una vacuola de un RBC fagocitado (Figura 3B). Densos racimos de células y / o escombros deben evitarse durante la cuantificación (Figuras 3E y F). También, uno debe evitar el exceso de opsonizantes el R 2 R 2 RBC, lo que llevaría a la fagocitosis mayor que overcrowds el interior de monocitos e interfiere con la cuantificación exacta (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de la MMA. Una pintura paso a paso de los pasos cruciales en la MMA: el aislamiento de PBMC de sangre completa, la alimentación de la monocyt adheridoí con opsonizado R2 R2, y el lavado de los portaobjetos de cámara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. intravenosa IgG (IVIG) inhibe la fagocitosis in vitro utilizando el MMA. IVIG es conocida para inhibir la fagocitosis y se utiliza como un control de inhibición en el MMA humano. (A) La titulación de IVIG resultó en una inhibición dependiente de la dosis de la fagocitosis en comparación con los no tratados R 2 R 2 de control. Los resultados muestran la media ± el error estándar de la media (SEM) de n = 3 experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante la t de Student-test: ** *** p≤0.01 y p≤0.001. (B) La inhibición de la curva de IVIG con una CI 50 of 3 mg / ml (línea de puntos). Los resultados muestran los datos normalizados a no tratada R 2 R (0% de inhibición) 2; media ± SEM de n = 3 experimentos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes de microscopía de contraste de fase de diapositivas de muestra con una lupa de 40X. (A) El tobogán perfecto en el que los monocitos fagocitados 1-2 R2 R2 en promedio (flechas negras con un brillo distintivo de halo), con muy pocos contaminantes, no-fagocitado R2 R2 en el fondo (flechas blancas). Vacuolas (B) Como se muestra en esta diapositiva, monocitos veces han agrandado (flechas blancas), que puede ser confundido con fagocitado R2 R2. (C &lt;/ strong&gt;) Cuando R2 R2 han sido sobre-opsonizado, más de 4-5 fagocitado R 2 R 2 por monocitos (flechas negras) rinde precisa contar difícil, ya que el R2 R2 se llena dentro de los monocitos y células distinta límites no se pueden distinguir. (D) el lavado inadecuado de la corredera conduce a la abundante R2 R2 contaminación (flechas blancas), que podría confundirse con los glóbulos rojos adheridos. (E) A veces, los monocitos y los glóbulos rojos contaminantes pueden formar racimos. Clusters también indican la contaminación bacteriana, que debe ser evitado. (F) Los monocitos pueden formar agregados más grandes, que deben ser evitados durante la cuantificación. El uso de la selección al azar de los campos para ver, el panel A es lo que se observa por lo general si el MMA se ha realizado correctamente. La barra de escala es de 20 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí</a>para ver una versión más grande de esta figura.

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Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K vistas.  University of Toronto. The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Video: Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

La determinación de la actividad fagocítica de los anticuerpos de muestras clínicas

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Investigación

Inmunología e Infección

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto inmunomodulador de los monocitos en la proliferación de leucocitos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

In Vitro and In Vivo Models

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

Source: Meaney, M. P. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54264">Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

Un ensayo para evaluar la fagocitosis y la actividad de estallido oxidativo en granulocitos y monocitos

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

Source: Quintana, M. d. P. et al., <a href="https://app.jove.com/v/61538">Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Parasite culture
NOTE: Follow the ...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

Un ensayo in vitro para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por fagocitos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

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