Name: Video: Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees
Uploaded: 2017-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s

Nos gustaría agradecer al Dr. Thomas Kuhar por el uso del software y equipo de seguimiento visual. Damos las gracias a James Wilson y Scott O&#39;Neal por su asistencia técnica.

1. Preparar cubos de azúcar-agarosa <ol><li> Se pesan 8 g de azúcar y se colocan en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. </li><li> Llenar el matraz Erlenmeyer con 20 ml de agua desionizada. Disolver el azúcar haciendo girar el frasco. </li><li> Pesar 170 mg de agarosa y añadirlo a la solución de azúcar. </li><li> Calentar la solución de azúcar-agarosa en un microondas en la parte superior durante 25 s. Disolver la agarosa en la solución de azúcar. </li><li> Dejar enfriar el frasco y la solución de azúcar-agarosa. NOTA: El frasco debe estar frío al tacto, pero no permita que la solución se solidifique. <ol><li> Para preparar un cubo de azúcar-agarosa para el tratamiento de control, vierta la solución de azúcar-agarosa semi-enfriada en un molde para pesar el barco. NOTA: El molde del barco de pesaje tiene las dimensiones 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 . </li><li> Para preparar un cubo de compuesto azúcar-agarosa para el tratamiento repelente, añada la cantidad deseada de compuesto a la disolución semi-enfriada ( por ejemplo , 1% de DEET en sUgar-agarosa (v / v)). Remueva el matraz para mezclar en el compuesto y luego vierta la solución en un molde de barco de pesaje. NOTA: Se prepararán ocho moldes de control y ocho moldes de prueba en este punto. Los moldes de control no contienen repelente. </li></ol></li><li> Enfriar los cubos de azúcar-agarosa en los moldes en un refrigerador durante 5-10 min. Retire los cubos de azúcar-agarosa solidificados de los moldes del barco de pesada y colóquelos en un recipiente de plástico con una toalla de papel humedecida. </li><li> Coloque los recipientes en un refrigerador para el almacenamiento. Los cubos de azúcar-agarosa deben usarse dentro de los 7 días de preparación. </li></ol> 2. Programación del Software de Seguimiento de Video y Configuración Experimental <ol><li> En Configuración del experimento en la barra Explorador de experimentos (en el software de seguimiento, vea la Tabla de materiales), que se encuentra a la izquierda de la pantalla, asegúrese de que la cámara correcta está seleccionada y de que la grabación de video está centrada en las arenas de la placa de petri.<ol><li> Si la grabación de vídeo necesita estar centrada, vaya a los ajustes de la cámara y bajo los controles AOI y seleccione las opciones central X y Y central. </li></ol></li><li> En Configuración de experimentos, cambie el número de arenas a 16. En Funciones de seguimiento, seleccione Detección de punto central. </li><li> Seleccione Ajustes de Arena para configurar el área deseada para el ensayo. <ol><li> Coloque las 16 placas de Petri en un patrón de 4 x 4 encima de una caja de luz, colocada debajo de la cámara ( Figura 1 ). NOTA: Estos platos se utilizan para crear la arena de grabación y están vacíos. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig1.jpg" /> Figura 1: Disposición de la placa de Petri en la caja de luz. Las placas de Petri se disponen en un bloque de 4 x 4 en la parte superior de la caja de luz. Esta disposición facilita la identificación de los tratamientos de control y repelentes para el vProtocolo de seguimiento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> En la Configuración de la Arena, use el botón de fondo de agarre, ubicado en el panel de herramientas del lado derecho, para tomar una foto de las 16 placas de Petri. Esto se utilizará como la plantilla para configurar la arena. </li><li> Seleccione &quot;Crear elipse&quot; en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla de configuración de Arena y crear un círculo que coincida con el diámetro de una de las placas de Petri en la imagen agarrada. Coloque el marcador Arena 1 en el círculo ( Figura 2 ). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig2.jpg" /> Figura 2: Captura de pantalla de la configuración de Arena de software de seguimiento visual. La observación de rayas diagonales dentro del círculo proporciona la confirmación del área de detección en el círculo. UN<html> Se proporciona un marcador de zona 1 para cada cuadrado y define la zona objetivo para cada placa de Petri. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="6"><li> Seleccione &quot;Grupo de Zona 1&quot; ubicado bajo Arena 1 en el panel de herramientas del lado derecho. Seleccione &quot;Crear Rectángulo&quot; en la barra de herramientas en la parte superior de la pantalla. Cree un cuadrado de 30 x 30 píxeles usando esto y luego colóquelo en el centro del círculo que se creó en el paso anterior. Seleccione &quot;Agregar zona&quot; de la barra de herramientas superior y luego haga clic en el centro del cuadrado. Mueva el marcador de la Zona 1 de modo que esté en el cuadrado. NOTA: El cuadrado creado es la zona de alimentación y no es un requisito que la zona de alimentación sea exactamente del mismo tamaño que la lista, siempre y cuando sea ligeramente mayor que el cubo de azúcar-agarosa. </li></ol>Les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Captura de pantalla de Completed Arena Settings. Los ajustes de arena completados deben parecerse a este ejemplo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="7"><li> Seleccione &quot;Arena 1&quot; en el panel de herramientas del lado derecho y luego haga clic en el escenario completo duplicado. En el menú desplegable, seleccione &quot;Todas las demás arenas&quot; y haga clic en Aceptar. Mueva las configuraciones duplicadas de arena a las placas petri restantes en la imagen agarrada (Figura 3). <ol><li> Seleccione &quot;Arena 1&quot; y luego seleccione &quot;Calibrar Escala&quot; en la barra de herramientas superior. Dibuje la línea de calibración a través del diámetro de la placa de Petri Arena 1. Cambiar la medida del diámetro a 9 cm (diámetro de las placas de Petri que se utilizan). Seleccione &quot;Validate Arena Settings&quot; en el panel de herramientas de la derecha. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;Configuración de detección &quot;en la barra de control de la izquierda. </li><li> Seleccione &quot;Ajustes de detección 1&quot; y luego seleccione &quot;Escala de grises&quot; en el menú desplegable ubicado en la caja de herramientas del lado derecho. Bajo detección, establezca el rango para que sea 0 a 83 ( Figura 4A ). </li><li> Haga clic con el botón derecho en &quot;Configuración de detección&quot; y realice una nueva configuración denominada &quot;Configuración de detección 2&quot;. Asegúrese de que &quot;Gray Scaling&quot; aún esté seleccionado, pero no cambie los otros parámetros. NOTA: Habrá grandes círculos amarillos en la ventana de video sobre los arenas. Esto ayudará a disponer las placas Petri en las posiciones correctas antes de la grabación ( Figura 4B ). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig4.jpg" /> Figura 4: Captura de pantalla de los ajustes de detección 1 y 2. ( A ) Muestra cómo se verá la arena con la escala de gris corregidaMiel abeja objeto en una placa de Petri. ( B ) Muestra el área de detección de arena para que el posicionamiento de las placas de petri pueda hacerse entre ensayos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="11"><li> Seleccione &quot;Trial List&quot; en el Explorador Experimental y haga clic en &quot;Add Variable&quot; en la barra de herramientas superior. Nombre la variable definida por el usuario como &quot;Tratamiento&quot;. Seleccione la barra desplegable &quot;Valores predefinidos&quot; en la columna de tratamiento definida por el usuario y agregue C (control) y T (tratamiento) como Valores predefinidos. Seleccione el botón &quot;Agregar ensayos&quot; situado en la barra de herramientas superior. Añada dos ensayos, luego para cada arena seleccione si se trata de un campo de control (C) o arena de tratamiento (T) ( Figura 5 ). </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig5.jpg" /> FiGure 5: Captura de pantalla de la lista de ensayos. El etiquetado de los arenas correctamente es importante aquí, ya que el programa utiliza la información aquí para separar los datos para analizarlos estadísticamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="12"><li> Seleccione &quot;Perfil de datos&quot; en el panel Explorador de experimentos. En la columna de la izquierda, seleccione &quot;Tratamiento&quot; ubicado bajo el encabezado &quot;Variables independientes definidas por el usuario&quot;. Esto agregará un cuadro &quot;Filtro&quot; en el área con el diagrama de flujo. Seleccione &quot;C&quot; en el cuadro emergente y luego coloque el filtro recién creado entre el cuadro &quot;Inicio&quot; y el cuadro &quot;Resultado 1&quot;. Las flechas del diagrama de flujo deben ajustarse para que apunten desde el cuadro de inicio al filtro y finalmente al resultado 1. <ol><li> Repita el paso 2.12, sin embargo esta vez seleccione &quot;T&quot; para el filtro y luego seleccione&quot;Resultado&quot; en la sección &quot;Elementos comunes&quot;. Mueva los cuadros recién creados al área del diagrama de flujo y conecte las casillas con flechas ( Figura 6 ). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig6.jpg" /> Figura 6: Captura de pantalla del perfil de datos. Esto muestra cómo se debe configurar el diagrama de flujo para obtener la separación apropiada en el análisis estadístico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55603/55603fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="13"><li> Guarda el archivo. </li></ol> 3. Recoge a las personas que son abejas <ol><li> Póngase ropa de protección y seleccione una colmena para recolectar abejas melíferas (sobre todo forrajeras). </li><li> Retire la cubierta exterior e interior de la colmena. Utilice una herramienta de colmena para seleccionar un marco del cuerpo de colmena superior que no contenga cría.Levante suavemente el marco fuera de la caja de la colmena. </li><li> Inspeccione el marco para la reina de la abeja de la miel. Si ella no está allí, barrer a los trabajadores de la abeja de la miel desde el marco en un contenedor para el transporte. Recoja suficientes individuos para poder ejecutar dos ensayos completos para cada compuesto que se va a analizar (se utilizan 16 individuos por ensayo con controles). NOTA: Los individuos recolectados deben ser principalmente buscadores; Sin embargo, puede haber otras personas de edad como las abejas enfermeras incluidas en la colección. </li><li> Tome nota de la hora en que las abejas fueron removidas. Colóquelas en una caja de plástico de 9 cm x 7 cm x 9 cm que contenga agujeros de aire y colóquelas en una incubadora a 32 ° C y 70% de humedad relativa. </li><li> Morir de hambre las abejas por 15 h. NOTA: Esto suele funcionar mejor si las abejas se recogen la noche anterior a la prueba. </li></ol> 4. Realizar un ensayo de seguimiento visual <ol><li> Inicie el programa de seguimiento visual y abra elD archivo experimental que se creó para este ensayo. </li><li> Seleccione &quot;Ajustes de detección 2&quot;. </li><li> Coloque los cubos de azúcar-agarosa de control en los centros de 8 de las 16 placas de Petri. Repita este proceso con los cubos de azúcar-agarosa-compuesto (disuasivo) en los 8 platos restantes. </li><li> Use una pinza para quitar una sola abeja de la caja de plástico y colóquela en una de las placas de Petri de control. </li><li> Repita el paso 4.4 para las restantes 15 placas de Petri. </li><li> Coloque todos los platos en la caja de luz y colocarlos de modo que las áreas de detección de arena (que se muestran en la pantalla de la computadora cuando se selecciona la detección 2) encajen en cada una de las arenas de la placa de Petri. Ilumine la caja de luz desde abajo por una serie de luces LED establecidas en el espectro rojo. Rodeó toda la caja y la cámara con una hoja de plástico negro para eliminar la luz externa y reducir las sombras dentro de las arenas. </li><li> Después de haber fijado las placas de petri, asegúrese de que &quot;Ajustes de detección 1&quot; sea elSeleccionado. NOTA: En este punto, el software de rastreo visual debe recoger sólo las abejas melíferas dentro de las arenas de la placa Petri. </li><li> Seleccione &quot;Adquisición&quot; en el Explorador de experimentos. Pulse el botón verde &quot;Iniciar prueba&quot; situado en el cuadro emergente Control de adquisición de la derecha para comenzar la grabación. </li><li> Ejecute el ensayo durante 10 minutos y luego haga clic en el botón rojo &quot;Stop Trial&quot; en el cuadro popup Control de adquisición para detener la grabación. </li><li> Retire los individuos de las placas de petri y colóquelos en un recipiente separado para que no se prueben dos veces. </li><li> Repita los pasos 4.4-4.10 para la segunda prueba en el mismo compuesto. NOTA: Este método puede ser modificado para aumentar el número de abejas por tratamiento según lo necesite el usuario. </li><li> Seleccione Estadísticas en el Explorador de experimentos y, a continuación, haga clic en calcular. </li><li> Exportar los datos a un software de gestor de datos y luego analizar los datos de importancia mediante el uso de un one-wAy de la varianza con el post-test de Tukey, y una prueba t no pareada usando el programa de software estadístico preferido. </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+repellents:+An+overview.">Insect repellents: An overview.</a> J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).</li><li>Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+video-tracking+to+assess+sublethal+effects+of+pesticides+on+honey+bees+(Apis+mellifera+L.).">Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.).</a> Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).</li><li>Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+fine+structure+of+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.)+workers+and+the+pheromonal+activity+of+2-heptanone.">Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone.</a> J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).</li><li>Free, J. B., Ja Pickett, ., Ferguson, a. W., Simpkins, J. R., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repelling+foraging+honeybees+with+alarm+pheromones.">Repelling foraging honeybees with alarm pheromones.</a> J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de rastreo visual proporciona un enfoque sencillo para detectar disuasiones químicas para las abejas de la miel de una manera relativamente rápida y fácil. No existen protocolos recomendados para las pruebas de laboratorio de disuasivos químicos para las abejas melíferas. Los estudios previos semi- y de campo completo han examinado los repelentes de abejas 14 , 15 ; Sin embargo, los protocolos descritos consumen mucho tiempo, requieren mucho ...

La abeja europea, Apis melliferaL. , Es un insecto económico y agrícola importante que proporciona servicios de polinización que se valoran en más de $ 200 mil millones en todo el mundo 1 . En los Estados Unidos y Europa, el número de colonias de abejas ha ido disminuyendo. Los Estados Unidos han perdido ca. El 60% de las colonias de abejas melíferas administradas desde 1947-2008, mientras que Europa ha perdido ca. 27% desde 1961-2007 2 , 3 . Hay una serie de factores que podrían ser responsables del aumento del número de pérdidas de colonias, incluyendo pero no limitado a, infestaciones de parásitos, infecciones de patógenos, prácticas apícolas y uso de pesticidas 2 - 4 . Las abejas pueden estar expuestas a pesticidas a través de dos vías principales. La exposición a plaguicidas fuera de la colmena puede ocurrir cuando los individuos que buscan alimento entran en contacto con cultivos queHan sido rociados con productos químicos para protegerlos de las plagas. La exposición a plaguicidas dentro de la colmena puede ocurrir cuando los apicultores utilizan productos químicos para controlar plagas y patógenos en la colmena, como ácaros, bacterias y microsporidios 4 . Se han identificado residuos de plaguicidas en muestras de cera, polen y abejas de miel de 24 colmenares de Estados Unidos y Canadá 5 , 6 . Los efectos del contacto de los plaguicidas con las abejas de miel incluyen la toxicidad aguda, así como los efectos subletales como la parálisis, la desorientación y los cambios de comportamiento y salud 1 , 7 . Dado que la agricultura moderna requiere el uso de plaguicidas para mantener un alto rendimiento de los cultivos, estos productos químicos seguirán siendo utilizados en el futuro 2 . Para proteger mejor a las abejas de la exposición a los plaguicidas, es necesario elaborar nuevos protocolos y reglamentos 5 .Un posible enfoque para la protección es el uso de repelentes para reducir la exposición de las abejas melíferas a los pesticidas mientras se busca alimentos. Los repelentes de insectos (RI) se han utilizado típicamente como medidas de protección contra las mordeduras personales contra los vectores de enfermedades de los artrópodos 8 . El IR más utilizado y exitoso, desarrollado hace más de 60 años, es DEET 8 , 9 . Se considera que es el estándar de oro para las pruebas de repelencia de insectos y es utilizado por la Organización Mundial de la Salud y la Agencia de Protección Ambiental como un control positivo para el nuevo repelente de selección [ 10] . Además, se ha encontrado que el DEET dispersa las abejas de la miel de una amenaza a su colonia 11 . Los atributos actuales asociados con los RI personales incluyen: (1) efecto duradero contra un amplio número de artrópodos; (2) no irritante para el usuario cuando se aplica a la piel o la ropa; (3) inodoro oOlor agradable; (4) ningún efecto en la ropa; (5) ninguna apariencia aceitosa cuando se aplica a la piel y para soportar sudor, lavado y limpieza por el usuario; (6) ningún efecto sobre los plásticos de uso común; Y (7) químicamente estables y asequibles para un uso generalizado 12 . Un repelente utilizado para las abejas de miel sólo necesitaría algunos de estos atributos tales como efectos duraderos, no irritante para los aplicadores, olor inodoro o agradable, químicamente estable y asequible para su uso generalizado, y no tóxico para las abejas melíferas. Sin embargo, antes de explorar estos atributos en profundidad, se necesita un método para seleccionar compuestos para la repelencia / disuasión de una manera de alto rendimiento. Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de laboratorio para detectar compuestos para la disuasión de las abejas, un paso importante para determinar la repelencia. El siguiente protocolo se modifica a partir de un estudio previo que describe un método de seguimiento visual para evaluar los efectos subletales de los plaguicidas sobre las abejas mieleras 13 . HoweEste protocolo difiere en que está diseñado para medir los efectos de los repelentes candidatos que podrían disuadir a las abejas de la miel de los cultivos tratados con pesticidas. No hay protocolos recomendados para las pruebas de laboratorio de disuasivos químicos para las abejas melíferas y, por lo tanto, este protocolo proporciona un enfoque sencillo para la detección de dichos compuestos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:71px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">26500-50</td>
			<td style="width:167px;">used for making the sugar/agarose cubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sugar</td>
			<td style="width:71px;">Kroger</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any similar product will sufffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deionized water</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>acquired in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:71px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">20-102</td>
			<td>used for making the sugar/agarose cubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mold for agarose cubes (Weigh Boat)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any mold that will provide the researcher with a 1.5 X 1.5 X 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EthoVision XT</td>
			<td style="width:71px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>visual tracking software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">633 nm LEDs</td>
			<td style="width:71px;">Cyron</td>
			<td>HTP904E</td>
			<td>These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below.&#160; The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laptop or PC</td>
			<td style="width:71px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Inspiron One 2305</td>
			<td>necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bee Keeping protective clothing</td>
			<td style="width:71px;">Dadant &#38; Sons Inc</td>
			<td style="width:119px;">V0126</td>
			<td>any protective hood and jacket will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hive tool</td>
			<td style="width:71px;">Dadant &#38; Sons Inc</td>
			<td style="width:119px;">M00757</td>
			<td>used to open honey bee hive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Container for honey bees</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any container suitable for housing and storing honey bees will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Featherweight forceps narrow tip</td>
			<td style="width:71px;">Bioquip</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4748</td>
			<td>used to select individual honey bees</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">9 cm (diameter) petri dish</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S01778</td>
			<td>arena used to contain individual honey bees during video tracking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recording Device (Camera)</td>
			<td style="width:71px;">Basler</td>
			<td style="width:119px;">acA-1300-60gm</td>
			<td>any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any statistical software package will suffice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

video tracking protocol to screen deterrent chemistries for honey bees

La abeja melífera europea, Apis mellifera L. , es un polinizador económico y agrícola importante que genera miles de millones de dólares anualmente. El número de colonias de abejas ha ido disminuyendo en los Estados Unidos y en muchos países europeos desde 1947. Varios factores juegan un papel en esta disminución, incluida la exposición no intencional de las abejas melíferas a los plaguicidas. El desarrollo de nuevos métodos y regulaciones se justifica para reducir la exposición de los pesticidas a estos polinizadores. Un enfoque es el uso de químicos repelentes que disuaden a las abejas melíferas de un cultivo recientemente tratado con pesticidas. Aquí, describimos un protocolo para discernir la disuasión de las abejas de miel expuestas a ciertas sustancias químicas repelentes. Los recogedores de abejas se recolectan y pasan hambre durante la noche en una incubadora 15 h antes de la prueba. Las abejas individuales se colocan en placas de Petri que tienen un cubo de azúcar-agarosa (tratamiento de control) o un cubo de azúcar-compuesto de agarosa (tratamiento repelente) colocado enA la mitad del plato. La placa de Petri sirve como la arena que se coloca debajo de una cámara en una caja ligera para registrar las actividades de la locomotora de la abeja de la miel usando software que sigue del vídeo. Se analizaron un total de 8 tratamientos de control y 8 repelentes durante un periodo de 10 min con cada tratamiento se duplicó con nuevas abejas melíferas. Aquí, demostramos que las abejas melíferas se disuaden de los cubos de azúcar-agarosa con un tratamiento compuesto, mientras que las abejas se atraen a los cubos de azúcar-agarosa sin un compuesto añadido.

Se desarrolló un protocolo de seguimiento visual para registrar la cantidad de tiempo que las abejas de miel pasaron en una zona objetivo con azúcar-agarosa (tratamiento de control) o cubo de azúcar-compuesto de agarosa (tratamiento disuasorio). El tiempo registrado se analizó utilizando un programa de software estadístico y el tiempo medio invertido ± error estándar en la zona objetivo se indica como un gráfico de barras. En este protocolo se utilizó el DEET, el patrón oro par...

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Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

La pérdida de colonias de abejas representa un desafío para los servicios de polinización de cultivos. Las prácticas actuales de protección de los polinizadores justifican un enfoque alternativo para minimizar el contacto de las abejas melíferas con los plaguicidas dañinos usando químicos repelentes. Aquí, proporcionamos métodos detallados para un protocolo de rastreo visual para detectar impedimentos para las abejas.

Protocolo de seguimiento de vídeo a la pantalla Químicos de disuasión para las abejas de miel

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

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Research

JoVE Journal

Environment

6.6K vistas.  Virginia Tech.  La pérdida de colonias de abejas representa un desafío para los servicios de polinización de cultivos. Las prácticas actuales de protección de los polinizadores justifican un enfoque alternativo para minimizar el contacto de las abejas melíferas con los plaguicidas dañinos usando químicos repelentes. Aquí, proporcionamos métodos detallados para un protocolo de rastreo visual para detectar impedimentos para las abejas. 

Video: Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The disease is initiated by feeding activities of the invasive beech scale insect, Cryptococcus fagisuga, which creates entry points for infection by one of the Neonectria species of fungus.&#160;Without scale infestation, there is little opportunity for fungal infection. Using scale eggs to artificially infest healthy trees in heavily BBD impacted stands demonstrated that these trees were resistant to the scale insect portion of the disease complex1.&#160;Here we present a protocol that we have developed, based on the artificial infestation technique by Houston2, which can be used to screen for scale-resistant trees in the field and in smaller potted seedlings and grafts.&#160;The identification of scale-resistant trees is an important component of management of BBD through tree improvement programs and silvicultural manipulation.

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

Beech bark disease is initiated by feeding activities of the beech scale insect that create fungal entry points in the bark.&#160;Trees that are resistant to the scale insect are also disease resistant.&#160;Here we present the protocol we have developed to screen individual beech trees for beech scale resistance.

Una técnica a la pantalla haya americana para la resistencia al insecto Haya Scale (<em&gt; Fagisuga Cryptococcus</em&gt; Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Investigación

Medio ambiente

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

Protocolo Experimental para la inducida por la planta Manipulación de la heterogeneidad del suelo

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The objective of this study was to characterize the effects of antecedent soil moisture content on the fate and transport of surface applied commercial urea, a common form of nitrogen (N) fertilizer, following a rainfall event that occurs within 24&#160;hr&#160;after fertilizer application. Although urea is assumed to be readily hydrolyzed to ammonium and therefore not often available for transport, recent studies suggest that urea can be transported from agricultural soils to coastal waters where it is implicated in harmful algal blooms. A rainfall simulator was used to apply a consistent rate of uniform rainfall across packed soil boxes that had been prewetted to different soil moisture contents. By controlling rainfall and soil physical characteristics, the effects of antecedent soil moisture on urea loss were isolated. Wetter soils exhibited shorter time from rainfall initiation to runoff initiation, greater total volume of runoff, higher urea concentrations in runoff, and greater mass loadings of urea in runoff. These results also demonstrate the importance of controlling for antecedent soil moisture content in studies designed to isolate other variables, such as soil physical or chemical characteristics, slope, soil cover, management, or rainfall characteristics. Because rainfall simulators are designed to deliver raindrops of similar size and velocity as natural rainfall, studies conducted under a standardized protocol can yield valuable data that, in turn, can be used to develop models for predicting the fate and transport of pollutants in runoff.

A rainfall simulator was used to apply a consistent rate of uniform rainfall to packed soil boxes in a study of the fate and transport of urea, a nonpoint source environmental contaminant. Under uniform soil and rainfall conditions, antecedent soil moisture content exerted strong control over urea loss in surface runoff.

Un protocolo para la realización de precipitaciones simulación para estudiar la escorrentía del suelo

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. These bees select cavities that are suitable nest sites for birds, resulting in competition. The difficulty of removing bees and their defensive behavior makes a prevention protocol necessary. Here, we describe a push-pull integrated pest management protocol to deter bees from inhabiting bird boxes by applying a bird safe insecticide, permethrin, to repel bees from nest boxes, while simultaneously attracting them to pheromone-baited swarm traps. Shown here is an example experiment using Barn Owl nest boxes. This protocol successfully reduced colonization of Barn Owl nest boxes by Africanized honey bees. This protocol is flexible, allowing adjustments to accommodate a wide range of bird species and habitats. This protocol could benefit conservation efforts where AHB are located.

Preventing colonization of bird nest boxes by invasive Africanized honey bees is important for conservation efforts of nest-site limited birds. We provide an integrated pest management approach to &#34;push&#34; bees away from nest boxes with a repellant insecticide, permethrin, and &#34;pull&#34; them toward pheromone baited swarm traps.

Un protocolo push-pull para reducir la colonización de Bird Cajas Nido de abejas de la miel

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

Un protocolo de recogida y la construcción de Lisímetros testigo del suelo

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protocolo para microplásticos muestreo en la superficie del mar y Análisis de las muestras

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Evaluar el efecto de sustancias químicas ambientales en la miel de abeja Desarrollo de la colonia individual a nivel

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Desarrollo de nuevos métodos para cuantificar la densidad de peces utilizando herramientas de estéreo y vídeo subacuáticos

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by environmental organochlorine pesticides (OCPs) in hepatocytes. HepG2 cells were exposed to &#946;-hexachlorocyclohexane (&#946;-HCH) for 24 h at an equivalent dose of internal exposure in general population. Ultrastructure in hepatocytes was examined by transmission electron microscopy (TEM) to show the damage of mitochondria. Mitochondrial function was further evaluated by mitochondrial fluorescence intensity, adenosine 5'-triphosphate (ATP) levels, oxygen consumption rate (OCR) and mitochondrial membrane potential (MMP) in HepG2 cells incubated with &#946;-HCH. The mitochondria fluorescence intensity after stained by mitochondrial green fluorescent probe was observed with a fluorescence microscopy. The luciferin-luciferase reaction was used to determine ATP levels. The MMP was detected by the cationic dye JC-1 and analyzed under flow cytometry. OCR was measured with an extracellular flux analyzer. In summary, these protocols were used in detecting mitochondrial function in hepatocytes with to investigate mitochondria damages.

Understanding the influence of environmental organochlorine pesticides (OCPs) on mitochondrial function in hepatocytes is important in exploring the mechanism of OCPs causing metabolic disorders. This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function.

Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

In Vitro Cría de las abejas solitarias: una herramienta para evaluar factores de riesgo larvas

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...