Agradecemos a Moustafa Saleh y Jay Tourigny por la lectura crítica del manuscrito y Steven Hahn y Steven Henikoff por su mentoría y apoyo durante el desarrollo de ChEC-seq y su aplicación al complejo Mediator. SG es apoyado por las concesiones de NIH R01GM053451 y R01GM075114 y GEZ es apoyado por fondos de la puesta en marcha de la universidad de Indiana.

1. Generación de cepas de levadura <ol><li> Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase. <ol><li> PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 2.3 kb. </li><li> Transformar el casete de marcado amplificado en la cepa de elección utilizando la transformación estándar de acetato de litio 22 y realizar la selección. </li><li> Verificar la correcta integración del casete de etiquetado con PCR de colonias. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción especificada ( Tabla 4 ) para el número de colonias que se deben tamizar. Manténgase en el hielo hasta que lo necesite. </li><li> Escoja una porción de cada colonia para ser tesEn la parte inferior de un tubo de PCR usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta. </li><li> Cocinar las colonias escogidas a alta potencia durante 1 min. </li><li> Añadir 50 μl de mezcla de PCR ( Tabla 4 ) a cada colonia de microondas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Realice PCR usando las condiciones de ciclo especificadas ( Tabla 5 ). </li><li> Mezclar los 50 μL de reacción de PCR y 10 μL de colorante de carga de ADN 6X directamente en cada tubo de PCR. Ejecutar 10 μL de cada muestra en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 700 pb. NOTA: Si se desea, verifique la expresión apropiada de la proteína de fusión MNasa mediante Western blot. Se espera un desplazamiento de aproximadamente 20,6 kilodaltons en el peso molecular de la proteína marcada. </li></ol></li></ol></li><li> Generar una cepa de MNasa libre mediante clonación basada en la homología del promotor del gen de interés en pGZ136 (Tabla 1) y transformación y selección como en el paso 1.1.2. <ol><li> AlternatiVely, ensamblar el promotor del gen de interés y 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS en un vector de plásmido, transformar y seleccionar como en la etapa 1.1.2, y hacer crecer la cepa en la condición selectiva apropiada para el mantenimiento del plásmido. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> En la tarde / noche del día anterior al experimento de ChEC, inocular 3 ml de levadura-peptona-dextrosa (YPD) o medio selectivo apropiado con una única colonia de la cepa que lleva el factor marcado con MNasa. Incubar esta cultura durante la noche (agitación 180 RPM, 30ºC). </li><li> En la mañana del día del experimento de ChEC, diluir el cultivo durante la noche en 50 ml de medio a una densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) de 0,2 - 0,3. Incubar este cultivo (agitación 180 RPM, 30 ° C) hasta que alcance una DO 600 de 0,5-0,7. A medida que el cultivo se aproxima a la DO 600 adecuada, se pone el bloque de calor o el baño de agua a 30ºC y se comienzan a descongelar aditivos de Tampón A ( TaBle 6). </li><li> Preparar 5 mL de Tampón A más aditivos ( Tabla 6 ) por cultivo. Mantenga el tampón A a temperatura ambiente durante el procedimiento. </li><li> Prepare tubos de microcentrífuga que contengan 90 μL de solución de parada ( Tabla 7 ) y 10 μL de SDS al 10% para cada punto de tiempo que se va a recoger. Para cada nuevo factor analizado, tomar las muestras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min y 10 min. </li><li> Se decanta el cultivo en un tubo cónico de 50 ml y se centrifuga a 1.500 xg ya temperatura ambiente (RT) durante 1 min. </li><li> Resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A y transferir las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. </li><li> Aspirar sobrenadante y resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. Repita este paso una vez. </li><li> Resuspender completamente las células en 570 μL de Tampón A. Añadir 30 μl de digitonina al 2%(0,1% de concentración final) para facilitar la permeabilización de las células, e invertir la mezcla. </li><li> Permeabilizar las células en bloque de calor o baño de agua a 30 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células. Elimine una alícuota de 100 μl de células permeabilizadas como control negativo a un tubo de microcentrífuga que contenga solución de parada y SDS (paso 2.4) y agite brevemente para mezclar. </li><li> Añadir 1,1 μ l de 1 M CaCl 2 (2 mM de concentración final) a las células permeabilizadas para activar MNase e invertir varias veces rápidamente o vórtice brevemente para mezclar. Devolver inmediatamente la reacción mezclada a 30 ° C e iniciar un temporizador. </li><li> En cada punto de tiempo a recoger, pipetear la reacción arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células, luego eliminar una alícuota de 100 μL de células permeabilizadas a un tubo de microcentrífuga que contiene solución de parada y SDS y vórtice brevemente para mezclar. Para cada nuevo factor analizado, tomar 0 s (sin CaCl 2 añadido), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min, y 10 min puntos de tiempo. NOTA: Los experimentos de ChEC con factores que escinden rápidamente el ADN a 30 ° C se pueden realizar a temperaturas más bajas para disminuir la cinética de escisión de MNasa. </li><li> Una vez que todos los puntos de tiempo se han recogido, añadir 4 μ l de 20 mg / ml de proteinase K a cada muestra, vórtice brevemente para mezclar, e incubar a 55 ° C durante 30 min. </li><li> Se a~naden 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamılico 25: 24: 1 a cada muestra, se agita vigorosamente para mezclar y se centrifuga a velocidad máxima y RT en una microcentrıfuga durante 5 min. </li><li> Retirar cada fase acuosa (~ 150 μl) a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Vórtice vigorosamente para mezclar y precipitar en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa. </li><li> El gránulo precipitó ADN a velocidad máxima y 4ºC en una microcentrífuga durante 10 min. </li><li> Los sobrenadantes de decantación y los gránulos de lavado con 1 mL de etanol RT al 70%. </li><li> Decantar etanol, quitando el resto invirtiendo unD golpeando suavemente los tubos sobre una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min. </li><li> Mientras que los gránulos están secando, hacer una mezcla maestra para resuspender pellets secos en 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μl de RNasa A 10 mg / mL cada uno. Digerir el ARN a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Mezcle 1 μL de colorante de carga de ADN 6X con 5 μl de cada muestra y corríjase sobre un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 40 min. </li></ol> 3. Selección del tamaño NOTA: El objetivo de la selección de tamaños es eliminar fragmentos de ADN genómico de múltiples muestras de la muestra a secuenciar y enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente el tamaño del ADN nucleosómico) o más pequeños. En los datos de secuenciación, los fragmentos &lt;400 pb se enriquecen, con un notable pico alrededor del tamaño del ADN nucleosómico (~ 150 pb) y una distribución pico o amplia de fragmentos subnucleosómicos. &lt;Ol <li> A cada muestra, añadir 75 μL de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) en una solución de polietilenglicol (PEG) 23 y pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar la mezcla de perlas: ADN a RT durante 5 min. </li><li> Durante la incubación de perlas SPRI, se preparan tubos de microcentrífuga que contienen 96 μl de Tris 10 mM, pH 8,0 y 4 μl de NaCl 5 M para cada muestra. </li><li> Coloque los tubos en un estante magnético para recoger bolas en el lado del tubo. Deje que las perlas se acumulen en el lado del tubo durante 2 min. </li><li> Transferir cada sobrenadante a un tubo nuevo que contenga Tris y NaCl (paso 3.2). </li><li> Añadir 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 a cada muestra, agitar a vórtice y centrifugar a velocidad máxima y RT en una microcentrífuga durante 5 min. </li><li> Retirar cada fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Precipitar el ADN en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa. </li><li> Pellet preciA la velocidad máxima y 4 ° C en una microcentrífuga durante 10 min. </li><li> Los sobrenadantes de decantación y los pellets de lavado con 1 mL de etanol al 70%. </li><li> Decanta el etanol, quitando el resto invirtiendo y tocando suavemente los tubos en una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min. </li><li> Resuspender las pastillas secas en 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine la concentración de la muestra utilizando un ensayo de alta sensibilidad. Para TF ChEC experimentos, 10-100 ng de ADN es rutinariamente recuperado después de la selección de tamaño. </li><li> Preparar bibliotecas de secuenciación. Los protocolos de preparación de bibliotecas que no dependen de la selección de tamaños, como se describió anteriormente 24 , son deseables para permitir la secuenciación de una amplia gama de tamaños de fragmentos (25-500 pb). </li><li> Bibliotecas de secuencias en modo de extremo pareado. Un mínimo de 25 bases de secuencia en cada extremo es necesario para la lectura de alta calidadcartografía. Entre 1 y 2 millones de lecturas proporciona suficiente cobertura para una muestra de ChEC. NOTA: El análisis de los datos de Seq de ChEC es un procedimiento complejo y está fuera del alcance de este artículo. Puede encontrar información detallada sobre el análisis de datos en las publicaciones anteriores 1 , 21 , y las secuencias de comandos personalizadas utilizadas para el análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) también se puede utilizar para el análisis de línea de comandos de datos ChEC-seq. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable 3 , 4 , y ChIP nativo, tale...

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) 1 , para eludir estos inconvenientes. ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ 9 , 10] . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución 11 , 12 . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) 13 no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ 14] . Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) 15 , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq 16 , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón. Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ 17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura 17 , 18 , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma 19 . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador 19 . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ 20] . Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma 1 . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado 21 , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados ​​en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.

En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K vistas.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa). 

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Asignación de genoma cromatina accesible en linfocitos T humanos primarios por ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...