Name: genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
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Ringraziamo Moustafa Saleh e Jay Tourigny per una lettura critica del manoscritto e Steven Hahn e Steven Henikoff per la tutorship e il supporto durante lo sviluppo del ChEC-seq e la sua applicazione al complesso Mediator. SG è supportato da NIH concede R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ è supportato dai fondi di avvio di Indiana University.

1. Generazione di ceppi di lievito <ol><li> Genera un ceppo di lievito che porta il fattore di interesse tagliato con MNase. <ol><li> PCR amplifica la cassetta di contrassegno MNase dal vettore desiderato ( Tabella 1 ) usando la miscela di reazione specificata ( Tabella 2 ) e le condizioni di ciclo ( Tabella 3 ). Mescolare 5 μL della reazione PCR e 1 μL di colorante carica DNA 6X. Eseguire ogni aliquota di PCR su un gel agarosio 0,8% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 2,3 kb. </li><li> Trasformare la cassetta di etichettatura amplificata nel ceppo di scelta usando la trasformazione standard di acetato di litio 22 e eseguire la selezione. </li><li> Verificare l&#39;integrazione corretta del cassetto di codifica con colonia PCR. <ol><li> Preparare la miscela di reazione specificata ( Tabella 4 ) per il numero di colonie da sottoporre a screening. Continuare a girare fino a quando non sia necessario. </li><li> Scegli una porzione di ciascuna colonia per essere provataNella parte inferiore di un tubo PCR utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta pipetta. </li><li> Microonde le colonie selezionate ad alta potenza per 1 min. </li><li> Aggiungere 50 μL di miscela PCR ( Tabella 4 ) a ciascuna colonia microelastica e pipetta su e giù per mescolare. Eseguire il PCR utilizzando le condizioni di ciclo specificate ( Tabella 5 ). </li><li> Mescolare 50 μL di reazione PCR e 10 μL di colorante di caricamento del DNA da 6X direttamente in ciascun tubo PCR. Eseguire 10 μl di ogni campione su un gel agarosico al 1% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 700 bp. NOTA: Se si desidera, verificare l&#39;espressione appropriata della proteina di fusione MNase mediante blotting occidentale. Si prevede un cambiamento di ~ 20,6 kilodalton nel peso molecolare della proteina taggata. </li></ol></li></ol></li><li> Generare un ceppo di MNase libero mediante clonazione a base omologica del promotore del gene di interesse in pGZ136 (Tabella 1) e trasformazione e selezione come nel punto 1.1.2. <ol><li> alternati, Assemblare il promotore del gene di interesse e NLS di 3xFLAG-MNase-SV40 in un vettore plasmide, trasformare e selezionare come nel punto 1.1.2 e sviluppare il ceppo nella condizione appropriata selettiva per mantenere il plasmide. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> Nel pomeriggio / sera del giorno prima dell&#39;esperimento ChEC, inoculare 3 mL di lievito-peptone-dextrose (YPD) o di un mezzo selettivo appropriato con una singola colonia del ceppo che porta il fattore tagliato a MNase. Incubare questa coltura durante la notte (180 giri / min di scuotimento, 30 ° C). </li><li> Nella mattina del giorno dell&#39;esperimento ChEC, diluire la coltura durante la notte in 50 ml di media a una densità ottica a 600 nm (OD 600 ) di 0,2-0,3. Incubare questa coltura (180 rpm agitando, 30 ° C) fino a raggiungere un OD 600 di 0,5-0,7. Poiché la cultura si avvicina all&#39;appropriato OD 600 , impostare il blocco termico o il bagno d&#39;acqua a 30 ° C e avviare il disgelo del tampone A additivi ( TaBle 6). </li><li> Preparare 5 mL di Tampone A e gli additivi ( Tabella 6 ) per coltura. Tenere il buffer A a RT durante la procedura. </li><li> Preparare i tubi microfuge contenenti 90 μL di soluzione di arresto ( tabella 7 ) e 10 μL di SDS 10% per ogni punto temporale da raccogliere. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendete campioni a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min. </li><li> Coltura la decantazione in un tubo conico da 50 mL e centrifuga a 1.500 xg e la temperatura ambiente (RT) per 1 minuto. </li><li> Riposizionare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A e trasferire le cellule risospese in un tubo microfugo. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. </li><li> Aspirare il surnatante e riposare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A pipettando verso l&#39;alto e verso il basso. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. Ripetere questa fase una sola volta. </li><li> Riposizionare completamente le cellule in 570 μl di Tampone A. Aggiungere 30 μl di 2% di digitonina(0,1% di concentrazione finale) per facilitare la permeabilizzazione delle cellule e invertire la miscela. </li><li> Permeabilizzare le cellule in blocco termico o in bagno d&#39;acqua a 30 ° C per 5 min. </li><li> Pipettare la reazione verso l&#39;alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme di celle. Rimuovere una aliquota da 100 μl di cellule permeabilizzate come un controllo negativo a un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS (fase 2.4) e vortex brevemente per mescolare. </li><li> Aggiungere 1,1 μL di 1 M CaCl2 (concentrazione finale 2 mM) alle cellule permeabilizzate per attivare MNase e invertire più volte rapidamente o vorticarsi brevemente per mescolare. Immediatamente restituire la reazione mista a 30 ° C e avviare un timer. </li><li> Ad ogni punto temporale da raccogliere, pipettare la reazione verso l&#39;alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule, quindi rimuovere una aliquota di cellule permeabilizzate da 100 μl in un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS e vorticare brevemente per mescolare. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendere 0 s (nessun CaCl2 aggiunto), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 minuti di tempo. NOTA: Esperimenti di ChEC con fattori che rapidamente fendono il DNA a 30 ° C possono essere eseguiti a temperature più basse per rallentare la cinetica di scissione di MNase. </li><li> Una volta raccolti tutti i punti di tempo, aggiungere a ciascun campione 4 μL di 20 mg / mL proteinasi K, vorticare brevemente per mescolare e incubare a 55 ° C per 30 minuti. </li><li> Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticare vigorosamente per mescolare e centrifugare a velocità massima e RT in microfuga per 5 min. </li><li> Rimuovere ogni fase acquosa (~ 150 μL) in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Vortex vigorosamente per mescolare e precipitare su ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa. </li><li> Il pellet ha precipitato il DNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min. </li><li> Diluenti supernatanti e lavare pellet con 1 ml di etanolo RT 70%. </li><li> Decantare l&#39;etanolo, rimuovendo il resto invertendo unD toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l&#39;etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all&#39;aria per RT per 5 min. </li><li> Mentre i pellets stanno asciugando, fanno un master mix per riposizionare pellet essiccati in 29 μl di Tris, pH 8.0 + 1 μL di 10 mg / mL RNasi A ciascuno. Digest RNA a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Mescolare 1 μl di colorante di carica del DNA 6X con 5 μl di ciascun campione e eseguire su un gel agarosio al 1,5% a 120 V per 40 min. </li></ol> 3. Selezione delle dimensioni NOTA: L&#39;obiettivo della selezione delle dimensioni è quello di rimuovere frammenti multi-kilobase di DNA genomico dal campione da sequenziare ed arricchire frammenti di ~ 150 bp (circa la dimensione del DNA nucleosomale) o più piccoli. Nei dati di sequenziamento, i frammenti &lt;400 bp sono arricchiti, con un picco notevole intorno alla dimensione del DNA nucleosomale (~ 150 bp) e una distribuzione di picco o ampia di frammenti subnucleosomiali. &lt;ol&gt; <li> Ad ogni campione aggiungere 75 μL di branchi di immobilizzazione reversibile a fase solida (SPRI) in una soluzione di polietilenglicole (PEG) 23 e pipettare su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare il tallone: ​​miscela DNA a RT per 5 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione del becco SPRI, preparare tubi microfuge contenenti 96 μl di 10 mM Tris, pH 8,0 e 4 μL di 5 M NaCl per ogni campione. </li><li> Posizionare i tubi in un rack magnetico per raccogliere le perline sul lato del tubo. Lasciare che le perle si raccolgano sul lato del tubo per 2 min. </li><li> Trasferire ogni supernatante ad un nuovo tubo contenente Tris e NaCl (fase 3.2). </li><li> Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticarsi per mescolare e centrifugare alla velocità massima e RT in microfuga per 5 min. </li><li> Rimuovere ogni fase acquosa in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Precipitare il DNA sul ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa. </li><li> Pellet preciDNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min. </li><li> Superannanti di decantazione e lavaggi con 1 ml di etanolo al 70%. </li><li> Decantate l&#39;etanolo, rimuovendo il resto invertendo e toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l&#39;etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all&#39;aria per RT per 5 min. </li><li> Ripopolare i pellet essiccati in 25 μl di Tris, pH 8,0. Determinare la concentrazione del campione usando un test di alta sensibilità. Per esperimenti di TF ChEC, 10-100 ng di DNA viene recuperato normalmente dopo la selezione delle dimensioni. </li><li> Preparare le librerie di sequenziamento. I protocolli di preparazione della biblioteca che non si basano sulla selezione delle dimensioni, come descritto in precedenza 24 , sono desiderabili per consentire la sequenza di una vasta gamma di frammenti di dimensioni (25-500 bp). </li><li> Librerie di sequenza in modalità terminale parallela. Per la lettura di alta qualità è necessario un minimo di 25 basi di sequenza su ciascuna estremitàMappatura. Tra 1 e 2 milioni di letture fornisce copertura sufficiente per un campione di ChEC. NOTA: L&#39;analisi dei dati di ChEC-seq è una procedura complessa e oltre l&#39;ambito di questo articolo. Informazioni dettagliate sull&#39;analisi dei dati possono essere trovate nelle pubblicazioni precedenti 1 , 21 e gli script personalizzati utilizzati per l&#39;analisi sono disponibili su GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) può anche essere utilizzato per l&#39;analisi della riga di comando dei dati ChEC-seq. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Abbiamo dimostrato che la ChEC può mappare diverse classi di proteine ​​di lievito sulla cromatina e anticipare che sarà generalmente applicabile a diverse famiglie di TF e altri fattori leganti di cromatina nel lievito. ChEC-seq è vantaggioso in quanto non richiede un collegamento reticolato, solubilizzazione di cromatina o anticorpi. Così, ChEC evita gli artefatti potenzialmente presenti in X-ChIP-seq, come gli artefatti hyper-ChIPable 3 , 4 e ChIP nat...

La mappatura dei siti di legame dei fattori di trascrizione (TFs), dei rimodellanti di cromatina e di altri fattori regolatori associati alla cromatina è fondamentale per comprendere tutti i processi basati sulla cromatina. Mentre sono stati utilizzati approcci di immunoprecipitazione cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChIP-seq) per ottenere molte importanti conoscenze sulla biologia genoma, esse presentano limitazioni notevoli. Recentemente abbiamo introdotto un metodo alternativo, definito scissione endogena cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChEC-seq) 1 , per eludere questi inconvenienti. Il ChIP-seq viene spesso eseguito con un passo iniziale di reticolazione di formaldeide (X-ChIP-seq) per preservare interazioni proteine-DNA. Tuttavia, un certo numero di recenti studi hanno indicato che X-ChIP-seq cattura interazioni transienti o non specifiche di proteine-DNA 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando origine a falsi positivi siti di legame. Inoltre, la sonicazione, comunemente usata per frammentare la cromatina in esperimenti X-ChIP-seq, preferisce scavare regioni di cromatina aperta, portando a un recupero biasimo di frammenti da queste regioni 9,10. La sonicazione produce anche una miscela eterogenea di lunghezze di frammento, limitando in ultima analisi la risoluzione del sito di legame, anche se l&#39;aggiunta di una fase di digestione di esonucleasi può notevolmente migliorare la risoluzione 11 , 12 . I metodi naturali di ChIP come le regioni occupate di genomi da cromatina (ORGANIC) 13 naturalmente isolati dall&#39;affinità (ORGANIC) non usano la reticolazione e la frammentazione di cromatin con la nuclace micrococcica (MNase), alleviando potenziali pregiudizi associati a crosslinking e sonicazione di formaldeide. Però,La solubilità di molte proteine ​​legate alla cromatina sotto le condizioni relativamente lievi richieste per l&#39;estrazione natu- rale di cromatina è scarsa, potenzialmente in grado di ridurre la dinamica e / o falsi negativi 14 . Mentre varie iterazioni di ChIP-seq sono più comunemente utilizzate per la mappatura genoma di interazioni proteine-DNA, sono state implementate anche diverse tecniche di mappatura basate sulla fusione di proteine ​​di interesse per vari enzimi che modificano il DNA. Un tale approccio è l&#39;identificazione di DNA adenina metiltransferasi (DamID) 15 , in cui una proteina di interesse di cromatina di interesse è geneticamente fusa alla diga e questa fusione è espressa in cellule o animali, con conseguente metilazione di sequenze GATC prossimali ai siti di legame della proteina. DamID è vantaggioso in quanto non si basa sull&#39;immunoprecipitazione e quindi evita il collegamento a reticolazione, gli anticorpi o la solubilizzazione di cromatina. Viene anche eseguito in vivo . però, La risoluzione di DamID è limitata alla scala di kilobase e l&#39;attività di metilazione della proteina di fusione della diga è costitutiva. Un secondo metodo basato sulla fusione enzimatica è Calling Card-seq 16 , che impiega fusione di un fattore di interesse per una transposa, orientando l&#39;integrazione specifica del sito di transposoni. Come DamID, Calling Card-seq non è basato su immunoprecipitazione e quindi ha vantaggi simili, con il vantaggio aggiunto di una maggiore risoluzione. Tuttavia, Calling Card-seq può essere limitato da biases di sequenza di transposasi ed è anche dipendente dalla presenza di siti di restrizione vicini ai siti di inserimento di transposone. Un terzo metodo di fusione enzimatica, sviluppato nel laboratorio Laemmli, è la scissione endogena cromatina (ChEC) 17 . In ChEC, una fusione tra una proteina associata alla cromatina e il MNase viene espressa in cellule, e dopo l&#39;aggiunta di calcio per attivare MNase, il DNA viene ceduto prossimale ai siti di legame per il taggedFattore ( figura 1 ). In combinazione con il blotting del sud, la ChEC è stata usata per caratterizzare la struttura della cromatina e la legatura di proteine ​​in un certo numero di singoli loci nel lievito 17 , 18 ed è stata combinata con analisi microarray a bassa risoluzione per sondare l&#39;interazione dei componenti dei pori nucleari con il lievito Genoma 19 . ChEC offre vantaggi simili a DamID e Calling Card-seq, e la sua risoluzione è quasi una coppia di base quando viene analizzata dall&#39;estensione primer 19 . ChEC è inoltre controllabile: la robusta sequenza del DNA da parte di MNase dipende dall&#39;aggiunta di calcio millimolare, assicurando che MNase sia inattivo alle basse concentrazioni di calcio libere osservate nelle cellule di lievito vivo 20 . In precedenza, abbiamo affermato che la combinazione di ChEC con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq) fornirà mappe ad alta risoluzione di siti di legame TF. Anzi, ChEC-seq ha generato mappe ad alta risoluzione dei fattori di regolazione generale del lievito (GRF) Abf1, Rap1 e Reb1 attraverso il genoma 1 . Abbiamo anche applicato con successo ChEC-seq al complesso modulare Mediator, un coattivatore globale trascrizionale 21 essenzialmente conservato, espandendo l&#39;applicabilità di ChEC-seq a complessi di dimensione megadalton che non contattano direttamente il DNA e possono essere difficili da mappare con ChIP- Basati su metodi. ChEC-seq è un metodo potente sia per la convalida indipendente dei risultati ChIP-seq che per la generazione di nuove conoscenze nella regolazione dei processi residenti in cromatina. Qui esempiamo un protocollo passo per passo per l&#39;attuazione di questo metodo nel lievito in erba.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td></tr><tr><td>MagneSphere magnetic rack</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

La mappatura genomica delle interazioni proteine-DNA è fondamentale per comprendere la regolazione del gene, il rimodellamento della cromatina e altri processi residenti in cromatina. La reticolazione di formaldeide seguita da immunoprecipitazione di cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (X-ChIP-seq) è stata utilizzata per ottenere molti approfondimenti nella biologia del genoma. Tuttavia, X-ChIP-seq ha limitazioni notevoli legate alla reticolazione e alla sonicazione. Il ChIP nativo evita questi inconvenienti evitando il collegamento incrociato, ma spesso provoca una scarsa ripresa delle proteine ​​legate alla cromatina. Inoltre, tutti i metodi basati su ChIP sono soggetti a considerazioni sulla qualità degli anticorpi. I metodi enzimatici per la mappatura delle interazioni proteine-DNA, che coinvolgono la fusione di una proteina di interesse per un enzima modificante del DNA, sono stati utilizzati anche per mappare interazioni proteine-DNA. Recentemente abbiamo combinato un metodo di questo tipo, scissione endogena cromatina (ChEC), con sequenziamento ad alto rendimento come ChEC-seq. ChEC-seq si basa sulla fusione di una cromatin-assoc(MNase) per generare frammenti di DNA mirati in presenza di calcio nelle cellule viventi. La ChEC-seq non è basata sull&#39;immunoprecipitazione e pertanto evita le potenziali preoccupazioni con il collegamento a reticolazione, la sonicazione, la solubilizzazione di cromatina e la qualità degli anticorpi, fornendo al tempo stesso una mappatura ad alta risoluzione con un minimo di segnale di fondo. Prevediamo che ChEC-seq sarà una potente controparte di ChIP, fornendo un mezzo indipendente per convalidare i risultati ChIP-seq e scoprire nuove conoscenze sulla regolazione genomica.

Nel caso di un esperimento di successo di ChEC, l&#39;analisi del DNA mediante elettroforesi con agarosio gel rivelerà un aumento calcio-dipendente della frammentazione del DNA in tempo, come indicato dalla macerazione e eventuale completa digestione del DNA genomico. In alcuni casi, una scala di bande simili a quella osservata con una digestione tradizionale di MNase viene osservata dopo una digestione estesa. Questo è il caso per l&#39;analisi ChEC di Reb1, un fattore di regolazione ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.1K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase). 

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Ricerca

Genetica

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biochimica

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologia

Isolamento della cromatina locus-specifica da cellule di lievito

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla cromatina e superamento dei limiti con un protocollo di isolamento della cromatina specifico per locus ad alto arricchimento 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Purificazione della cromatina del locus genico a copia singola in Saccharomyces cerevisiae

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina