Damos las gracias al Sr. P. Yeung por haber preparado el MCF-7 para nosotros. Este trabajo fue parcialmente apoyado por las subvenciones del Consejo de Subvenciones de Investigación de la Región Administrativa Especial de Hong Kong (China) (Proyecto nº 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 y HKU 720112E), el Programa de Apoyo a la Innovación y la Tecnología (ITS / 090/14 ), Y el Fondo de Desarrollo Universitario de HKU.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Preparación de la muestra (células adherentes, células MCF-7) <ol><li> Saque el plato de cultivo celular de la incubadora y drene el medio de cultivo. </li><li> Enjuague las células en un plato con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio de cultivo excesivo. </li><li> Añadir 3 ml de una solución de 0,25% de tripsina al plato de cultivo (diámetro de 100 mm) y ponerlo en una incubadora a 37ºC, 5% de CO 2 durante 4 min. NOTA: La tripsina disuelve la proteína adhesiva de las células para que se separen del plato de cultivo. </li><li> Compruebe si todas las células se han separado del plato de cultivo utilizando un microscopio óptico (objetivo 10X). Si no, agitar suavemente el plato de cultivo celular. </li><li> Añadir 4 ml del medio de cultivo estándar (formulado con 89% de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS)) para detener la acción de la tripsina. </li><li> TRansferir la mezcla completa (células en solución de tripsina y medio de cultivo) a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 5 min a 200 x g. </li><li> Retirar todo el líquido y volver a suspender las células en 1 mL de 1x PBS (valor de pH: 7,4, precalentado a 37 ° C). </li></ol></li><li> Preparación de muestras (microalgas cultivadas) <ol><li> Transferir las microalgas cultivadas y el medio de cultivo ( por ejemplo, agua de mar, agar o agua dulce) a tubos nuevos de cultivo de vidrio (~ 15 mL) en una relación volumétrica (microalgas al medio de cultivo) de 1: 5 para establecer Un nuevo medio de subcultura. </li><li> Coloque los tubos de cultivo de vidrio en una cámara a prueba de polvo bajo iluminación constante mediante iluminación artificial de las bombillas fluorescentes de acuerdo con un ciclo claro / oscuro (LD 16: 8) durante 72 - 120 horas antes del experimento. </li><li> Transferir las muestras subcultivadas a un tubo de centrifugación y mezclar bien. </li></ol></li></ol> 2. Configuración del sistema ATOM Figura 1: Esquema de un sistema ATOM. Se emplea un láser pulsado de banda ancha para suministrar impulsos ultrarrápidos a ( a ) un módulo de estiramiento de tiempo y ( b ) un módulo amplificador óptico en línea. El módulo de tiempo-estiramiento genera un tren de formas de onda temporales, cada una de las cuales es la réplica del espectro de longitud de onda de la fuente de láser ( es decir, mapeado de longitud de onda a tiempo). El módulo amplificador se utiliza para la compensación de pérdidas por dispersión de impulsos (dispersiva). El pulso estirado es entonces ( c ) espacialmente dispersado por una rejilla de difracción, formando una iluminación de ducha espectral 1D en la que componentes de longitud de onda individuales son retransmitidos por un par de lentes de relé y enfocados por la lente de objetivo en diferentes posiciones sobre la celda que fluye dentro del ) Chip microfluídico. Este es el proceso de codificación espectral. losLa luz espectralmente codificada pasará de nuevo la célula a través de otra lente objetiva y un espejo, volviendo a la rejilla de difracción y recombinándose como un haz pulsado espacialmente no dispersado. Este haz pulsado codificado por imagen es entonces ( E ) se dividen en dos trayectorias, de manera que ambos haces están parcialmente bloqueados con ( f ) el borde de la cuchilla, pero desde direcciones opuestas, antes de ser acoplados a las fibras. Estos dos haces representan los dos contrastes de gradiente de fase codificados (opuestos) de la imagen final. Para la detección simultánea de ambos contrastes de señal, una de las señales sufre ( g ) una línea de retardo de tiempo, de manera que las dos señales son multiplexadas (entrelazadas) en el tiempo. Para la adquisición de datos se utiliza un fotodetector de alta velocidad y un osciloscopio en tiempo real. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55840/55840fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Hora<html> Módulo de vórtice <ol><li> Emplear una fuente láser pulsada femtoseconda (fs) o picosegundo (ps) de banda ancha con una longitud de onda central recomendada en el rango del infrarrojo cercano (NIR), 800-1.500 nm. NOTA: El ancho de impulso requerido típico puede variar desde sub-100 fs a unos ps. Los requisitos detallados de las fuentes láser pulsadas se pueden ver en las Referencias 4 y 5. Las métricas importantes se destacan en la Tabla 1 . <ol><li> Asegúrese de que la fuente láser tiene una alta tasa de repetición, que debe estar en el régimen de megahertz ( por ejemplo, decenas de MHz) para asegurar la imagen ultra rápida en ATOM. Además, establezca la potencia láser de salida máxima por debajo del umbral de potencia de daño de la cavidad de la fibra, aproximadamente 1 kW. </li><li> Garantizar una buena estabilidad temporal y espectral disparo-disparo de la fuente láser pulsada. NOTA: La tolerancia típica en la fluctuación de la amplitud espectral debe mantenerse dentro del 1,2% 19 , 20 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 21, tal y como lo consigue el láser con bloqueo de modo de fibra en esta configuración. NOTA: Se espera que el ancho de banda óptico de la fuente láser sea de 10-100 nm, lo cual es esencial para garantizar un campo de visión de imagen (FOV) suficiente en la formación de imágenes monocelulares 21 . </li></ol></li><li> A través de un colimador de fibra, se acopla el haz de rayos láser a una fibra óptica dispersiva monomodo, en la que los impulsos se estiran a través de la dispersión de velocidad de grupo (GVD) ( Figura 1a ). NOTA: Este es el proceso después del cual el espectro de cada pulso es mapeado en tiempo como una forma de onda barrida en longitud de onda ( es decir, mapeado de longitud de onda a tiempo). NOTA: El GVD total requerido debe ser suficiente para asegurar que la resolución global de la imagen ATOM no se vea afectada por el proceso de mapeado de longitud de onda a tiempo (Ver la discusión). Típicamente, en el rango NIR, el GVD debe estar muy por encima de 0,1 ns / nm. Por ejemplo, se emplea una fibra monomodoS actual configuración proporciona un GVD total de 0,38 ns / nm alrededor de la longitud de onda de 1,060 nm (una longitud total de fibra de 10 km). </li></ol></li><li> Módulo de codificación espectral <ol><li> Construir un sistema de microscopio óptico para realizar la imagen espectralmente codificada de las células que fluyen a lo largo del canal microfluídico, como se ilustra en la Figura 1 . NOTA: Los componentes clave de este microscopio óptico incluyen: (1) una rejilla de difracción, un módulo telescópico de relé-lente (RL1 y RL2 en la Figura 1 ) y dos lentes objetivas (Obj1 y Obj2 en la Figura 1 ). <ol><li> En primer lugar, ilumine el haz estirado en tiempo y colimado sobre una rejilla de difracción (se emplea rejilla de tipo de transmisión en esta configuración) para generar una ducha espectral ( Figura 1c ). NOTA: La potencia del haz difractado ( es decir, eficiencia de difracción) se puede maximizar ajustando tLa orientación de la rejilla se cerró a la configuración de Littrow. </li><li> Configure las dos lentes de relé (RL1 y RL2) en un sistema de imágenes de 4 f ( es decir, coloque la rejilla de difracción en el plano focal de RL1 y separe RL1 y RL2 por una distancia igual a la suma de sus longitudes focales. Se formará una imagen en el plano focal trasero de la lente objetivo Obj1). </li><li> Alinee cuidadosamente la ducha espectral para llenar la abertura trasera del Obj1, de modo que la ducha espectral se pueda proyectar y enfocar en el plano de la imagen del microscopio. NOTA: Aquí, el NA de la lente objetivo (Obj1 en la Figura 1 ) es 0.75. </li><li> Coloque otra lente objetiva (Obj2 en la Figura 1 ) con un NA similar y un espejo plano en la abertura trasera de esta lente objetiva (Obj2), de modo que el haz de ducha espectral pueda alinearse para pasar el plano de la imagen y volver a la imagen rejilla de difracción. </li><li> AjustarEl par de lentes objetivas (Obj1 y Obj2) de manera que sus planos focales se superponen entre sí. Compruebe si la ducha espectral duplica el plano de la imagen en el mismo lugar y regresa a la rejilla siguiendo el mismo camino. Si no, realice una mayor alineación y ajuste del sistema óptico. NOTA: La luz devuelta debe pasar a través de un divisor de haz adicional, de modo que la luz pueda ser transmitida a un módulo de detección asimétrica. </li><li> Ajuste la ganancia del amplificador óptico a un nivel adecuado, de modo que la señal resultante pueda ser detectada por el fotodetector con una buena SNR, que es típicamente&gt; 10 dB. </li><li> Colocar y ajustar la posición del chip microfluídico en la plataforma de muestra y asegurarse de que la ducha espectral, y por lo tanto el área de imagen, se coloca a través del canal microfluídico ( Figura 1d ). NOTA: La ducha espectral se ilumina ortogonalmente a la dirección del flujo de fluidos dentro del mChip icrofluídico, de manera que el movimiento de flujo realiza automáticamente exploraciones bidimensionales (2D). </li></ol></li></ol></li><li> Módulo de detección asimétrica <ol><li> Coloque un divisor de haz adicional para separar el haz codificado por imágenes en dos ( Figura 1e ). NOTA: Cada réplica de viga está parcialmente bloqueada por un borde de cuchilla. </li><li> Mida y registre la potencia óptica del haz antes del bloque del haz. Luego, coloque manualmente los bordes de las cuchillas (montados en una etapa de traslación lineal) de manera que bloqueen aproximadamente la mitad de la viga (mediante inspección visual). Después, utilice el medidor de potencia óptica para controlar la potencia del haz mientras se ajusta con precisión la posición de los bordes de la cuchilla al trasladarlos a través de la viga. NOTA: Se sugiere que la posición óptima es donde la potencia se reduce en ~ 50% del valor original ( es decir, el caso no bloqueado). Esta es la condición que proporciona la mejor combinación de señal de imagenLa fuerza y ​​la mejora del contraste de la imagen. </li><li> Repita el paso 2.3.2 para otra réplica de haz. Obsérvese que la orientación del bloque de haz parcial para un haz debe ser opuesta con respecto al otro haz ( Figura 1f ). </li><li> Acople los dos haces parcialmente bloqueados en dos brazos separados de fibra monomodo a través de colimadores de dos fibras. NOTA: Uno de los brazos tiene una longitud extra de fibra, sirviendo como línea de retardo a base de fibra, para introducir un retardo de tiempo con respecto a la otra réplica (sin la línea de retardo) ( Figura 1g ). Ambos se dirigen a una única fibra por un acoplador de fibra antes de fotodetección. El tiempo de retardo debe ser lo suficientemente largo para separar temporalmente las dos réplicas y lo suficientemente corto para evitar la superposición temporal con la siguiente forma de onda ( es decir, las dos réplicas son siempre entrelazadas en el tiempo y multiplexado en el tiempo en una sola fibra antes de la detección ( Figura 2a )). </li><li> GorraY digitalizar las señales ópticas detectadas con el osciloscopio en tiempo real. Obsérvese que el ancho de banda y por lo tanto la frecuencia de muestreo del osciloscopio deben ser suficientemente altos para asegurar que no influyen en la resolución final de la imagen (Ver la discusión). NOTA: En este caso, con el GVD de 0,38 ns / nm, se requiere un ancho de banda de adquisición del backend y una frecuencia de muestreo&gt; 20 GHz y&gt; 40 GSa / s, respectivamente. </li></ol></li></ol> 3. Procedimientos experimentales <ol><li> Carga de muestras <ol><li> Realizar el recuento celular bajo un microscopio de contraste de fase convencional en un hemocitómetro estándar. </li><li> Ajustar la densidad celular diluyendo con 1x PBS (con agua de manantial para microalgas) y mezclar bien con una pipeta. NOTA: La concentración sugerida es de 10 5 a 10 6 células / mL. </li><li> Monte el chip microfluídico en la plataforma de muestra del sistema de imágenes ópticas. NOTA: El microfluídicoChip está hecho principalmente de polidimetilsiloxano (PDMS) y se fabrica usando el método de moldeo de réplica estándar. El canal microfluídico está diseñado con un canal curvo asimétrico para generar el efecto de enfoque de flujo inercial, de tal manera que las células pueden fluir en un solo archivo en la sección de formación de imágenes (con una dimensión de 80 μm x 80 μm (altura x anchura)) a alta velocidad . </li><li> Transferir la solución de células ajustada a la densidad a una jeringa de 10 ml. </li><li> Conecte la jeringa a la entrada del chip microfluídico y un tubo centrífugo a la salida del chip microfluídico para la recogida de la eliminación. </li><li> Montar la jeringa en una bomba de jeringa y establecer un caudal adecuado para dar un rendimiento deseable y evitar imponer una fuerza de corte excesiva entre las células y el canal. NOTA: La velocidad lineal de las muestras debe estar dentro de 0,5 y 10 m / s. Tenga en cuenta que antes de la grabación de la imagen real, a menudo es necesario afinar más el sistema, en términos de maximizar laLa intensidad de la señal de imagen y optimizar el enfoque de la imagen repitiendo los pasos 2.2.1.4-2.2.1.6. </li></ol></li></ol> 4. Adquisición de datos <ol><li> Establezca un número adecuado de puntos de datos que se guardarán para cada experimento. El número de puntos de datos a guardar depende del tamaño y el caudal de las muestras. NOTA: Normalmente, se establece en 8-16 millones de puntos de muestra bajo una frecuencia de muestreo de 80 GSa / s. </li><li> Adquirir y guardar los datos en un modo por lotes utilizando el osciloscopio. </li></ol> 5. Procesamiento de backend <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55840/55840fig2.jpg" /> Figura 2: Reconstrucción de imágenes ATOM a partir del trazado de tiempo de barrido de línea. Para reconstruir las imágenes ATOM con el contraste de absorción y el contraste diferencial diferencial (mejorado), se extraen dos series de pulsos de tiempo estirado (ver los pulsos púrpura y verde)(A) la traza temporal de la forma de onda temporal multiplexada y luego se segmentan digitalmente y se apilan para formar ( b ) dos imágenes 2D que muestran los dos contrastes opuestos de gradiente de fase. Obsérvese que se necesita una operación de cizallamiento para formar ( c ) las imágenes libres de distorsión compensando el desplazamiento del subíndice debido al error de redondeo en la estimación de la velocidad de repetición del láser. Al restar la ( d ) línea de exploración en bruto de la envolvente de intensidad espectral de la fuente láser, el fondo de las imágenes puede ser eliminado. ( G ) Se puede obtener una imagen de contraste de absorción mediante una suma de intensidad de píxel a píxel de las imágenes ( e ) y ( f ), mientras que ( h ) se puede obtener una imagen diferencial de contraste de gradiente de fase a partir de la sustracción de imágenes ) Y (f). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55840/55840fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande</a>De esta cifra. <ol><li> Transfiera los datos del osciloscopio a los ordenadores para la reconstrucción de imágenes sin conexión. NOTA: Aquí, los datos se almacenan en un disco duro portátil y se transfieren manualmente entre el osciloscopio y los ordenadores de procesamiento. La capacidad del disco duro debe ser superior a 500 GB para cada experimento. <ol><li> Utilice la rutina de reconstrucción de imagen clave para apilar digitalmente las exploraciones de línea para formar una imagen 2D ( Figura 2 ). NOTA: El programa personalizado (en MATLAB) produce dos imágenes de detección asimétrica separando los dos conjuntos de datos multiplexados en el tiempo (formas de onda púrpura y verde en la figura 2 ). <ol><li> Obtener una imagen de contraste diferencial de gradiente de fase restando las intensidades de las dos imágenes de detección asimétricas; Se puede obtener una imagen de contraste de absorción mediante la adición de las dos imágenes de detección asimétrica. Vea imágenes seleccionadas de MCF-7 y microalgas enFigura 3 . Obsérvese que los perfiles de fondo de las imágenes individuales deben eliminarse primero, y sus intensidades deben normalizarse, antes de las operaciones de suma y resta de la imagen. </li></ol></li><li> Generar una biblioteca de parámetros derivados de las imágenes, como el volumen celular, la circularidad y la densidad de absorción, etc. para un análisis posterior. </li></ol></li><li> Introduzca la biblioteca de datos en la plataforma de visualización de datos ( Figura 4 ). <ol><li> Cargue la biblioteca de parámetros y las imágenes reconstruidas correspondientes a la plataforma de interfaz de visualización. </li><li> Defina los ejes como los parámetros de interés. NOTA: Los parámetros son específicos del problema y son definidos por el usuario. Se derivan de las imágenes ATOM por el programa MATLAB. Aquí, la densidad de absorción óptica de la célula, área celular, volumen celular y circularidad celular están disponibles para la selección. </lI&gt; <li> Seleccione el conjunto de datos que se mostrará, de manera que cada imagen de celda pueda visualizarse como un punto de datos diferente en el diagrama de dispersión. </li><li> Mueva el cursor del ratón a cada punto, de modo que la imagen correspondiente y otros parámetros se muestren en una subventana flotante. NOTA: Los ejes se pueden cambiar entre las escalas lineal y logarítmica de una manera interactiva. </li><li> Realice un análisis más detallado de cualquier subconjunto del conjunto de datos activando manualmente el diagrama de dispersión. NOTA: El histograma en cada parámetro del subconjunto bloqueado se puede trazar contra los de toda la biblioteca. Los histogramas separados se muestran en otra sub-ventana flotante. </li></ol></li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer.">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li><li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells.">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259 (2013).</li><li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples.">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li><li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers.">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Laser-Scanning+Time-Stretch+Imaging+at+Visible+Wavelengths.">Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths.</a> Light Sci Appl. , (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios detalles técnicos que requieren atención especial durante la configuración del sistema ATOM. En primer lugar, es esencial observar que la iluminación codificada espectralmente asimétrica / oblicua podría introducir componentes de gradiente de fase residual ( es decir, el efecto de sombreado) en el contraste de absorción e influir en el aumento del contraste de gradiente de fase en ATOM. Por lo tanto, este efecto de la iluminación oblicua debe ser minimizado. En segundo lugar, se debe enfatiza...

La imagen óptica presenta una poderosa herramienta y un ensayo basado en células para visualizar (casi) de forma no invasiva la distribución espacial detallada de muchos componentes celulares / subcelulares, descubriendo así una multitud de firmas morfológicas, biofísicas y biomoléculas de células. Sin embargo, esta capacidad para extraer información de alto contenido de células individuales ha sido generalmente comprometida cuando una enorme y heterogénea población de células tuvo que ser investigado. Esto marca una compensación común en los ensayos basados ​​en células entre el rendimiento de medición y el contenido. Un ejemplo notable es que la adición de capacidad de formación de imágenes a la citometría de flujo ha dado lugar a una disminución de la escala de rendimiento en al menos 1-2 órdenes de magnitud en comparación con la de la clásica no citometría de flujo de imágenes. A pesar de que podría ofrecer un análisis morfológico de células complejas que no es posible con citómetros de flujo estándar 1 , la citometría de flujo de imagen generalmente carece de suficiente rendimiento para idEnriqueciendo la heterogeneidad celular con alta confianza estadística. Esto es necesario para los nuevos descubrimientos en biología y para obtener una comprensión de la patogénesis de las enfermedades. El desafío técnico clave radica en el límite de velocidad inherente impuesto por las estrategias de imagen óptica comunes: exploración por haz láser ( por ejemplo, por espejos galvanométricos) y / o sensores de imagen ( por ejemplo, dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) Óxido semiconductor (CMOS)). La velocidad de escaneado láser está intrínsecamente limitada por la inercia mecánica de los espejos de exploración, mientras que la velocidad de fotogramas de CCD o CMOS está limitada por el equilibrio fundamental entre velocidad de imagen y sensibilidad ( es decir, , y viceversa). Basado en un mecanismo de codificación de imágenes ultrarrápido y óptico, se ha demostrado que la imagen óptica de tiempo-estiramiento es una plataforma atractiva para el flujo de imágenes de alto rendimiento cytOmeters, sin necesidad de los sensores convencionales de imagen o escaneo láser mecánico 2 , 3 . En las referencias 4 , 5 , 6 , 7 se pueden encontrar descripciones detalladas del principio de funcionamiento de la proyección de imagen de tiempo-estiramiento. En resumen, consta de dos etapas de mapeo intercambiables: (i) codificación espectral (mapeado de espacio de longitud de onda), en el que las coordenadas espaciales de la muestra de imagen son mapeadas a diferentes longitudes de onda a través del espectro del haz de luz pulsada 8 , Y (ii) una transformación de Fourier dispersiva 9 , en la que las componentes de longitud de onda de los pulsos individuales de un láser son transformadas (estiradas) a través de la dispersión de velocidad de grupo (GVD) en formas de onda temporales (longitud de onda). Un importanteCaracterística de la formación de imágenes de tiempo-estiramiento es la amplificación óptica, que juega un papel crítico en la lucha contra la pérdida de sensibilidad debido a la fotodetección ultrarrápida y la pérdida de GVD, aumentando así la relación señal-ruido de imagen sin ser contaminado por el ruido fotodetector 9 . Puesto que cada pulso de láser codifica un barrido de línea de la muestra de imagen, que es ortogonal al flujo unidireccional de las células, se determina una velocidad de barrido de línea efectiva por la velocidad de repetición del láser, que está típicamente por encima de 10 MHz. Esta operación ultrarrápida permite una captura de imagen de una sola célula sin fluctuaciones a un rendimiento de 10.000 a 100.000 células / es ( es decir, 10-100 veces mayor que la citometría de flujo de imagen convencional). Como resultado, la proyección de imágenes de tiempo-estiramiento podría encontrar aplicaciones únicas en cribado basado en imágenes de una sola célula, especialmente cuando hay una necesidad de identificar heterogeneidad desconocida o células raras / aberrantes dentro de una población considerable (miles a millones de imágenes) Cel<html> Ls), como el rastreo de células cancerosas raras 10 o la clasificación de microalgas [ 11] . La proyección de imagen de tiempo-estiramiento confía predominante en la captura de la imagen del campo brillante (BF), de la cual el contraste de la imagen se genera a través de la dispersión de la luz y de la absorción de las células 2 , 3 , 9 , 10 , Dichas capacidades de formación de imágenes de una sola célula libres de etiquetas podrían evitar los efectos perjudiciales asociados con las etiquetas fluorescentes, tales como la citotoxicidad y el fotoblanqueo, y proporcionar información valiosa para el análisis de una célula basada en la textura y morfología celular y subcelular. Estos parámetros libres de etiquetas se han demostrado eficaces para la clasificación profunda de las células, especialmente cuando existe una enorme población de células 11 ,&quot;Xref&quot;&gt; 12. Sin embargo, en muchas ocasiones, la formación de imágenes BF no proporciona un contraste suficiente para revelar la morfología detallada de las células transparentes sin etiqueta. Se han desarrollado diferentes modalidades de formación de imágenes de tiempo de estiramiento temporal sin contraste de etiquetas para mejorar el contraste de imagen a velocidades de fotogramas ultrarrápidos 13 , 14 , 15 . Entre estas técnicas, se desarrolló microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica (ATOM) para revelar el contraste gradiente de fase (contraste diferencial de interferencia-contraste (DIC)) basado en un concepto similar a la fotografía de Schlieren, Libre de alto contraste de células individuales a una velocidad microfluídica ultra alta (hasta 10 m / s) 16 . Este efecto puede generarse fácilmente mediante detección o iluminación oblicua bloqueando parcialmente la trayectoria del haz codificado por imagen o inclinando el haz antes de la fotodetección. Otra ventaja de ATOM es suPara adquirir simultáneamente dos contrastes de gradiente de fase a lo largo de orientaciones opuestas. La substracción de intensidad y la suma de dos imágenes de contraste opuesto proporcionan el contraste diferencial de gradiente de fase y el contraste de absorción, respectivamente, de la misma exploración de línea. Este trabajo presenta un protocolo detallado que describe la implementación de ATOM, incluyendo el establecimiento de la configuración óptica, la preparación de la muestra, y la adquisición y visualización de datos. Específicamente, este trabajo demuestra la operación ATOM con imágenes de células únicas de células sanguíneas humanas, células cancerosas y fitoplancton (microalgas). Esto pone de manifiesto la aplicabilidad de ATOM a la citometría de flujo de imagen, no sólo en el ámbito biomédico, sino también en la investigación marina y de biocombustibles 17 , 18 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">MRF07420</td>
			<td style="width:393px;">Objective lens (Obj2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td>RMS40X-PF</td>
			<td>Objective lens (Obj1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">N-BK7 Plano-Convex Lenses</td>
			<td style="width:71px;">Thorlabs</td>
			<td>LA1145-C</td>
			<td>For relaying spectral shower</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">FC/APC Fiber Collimation Package</td>
			<td style="width:71px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">F220APC-1064</td>
			<td>For outputing and collecting laser pulses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Pellicle beamsplitter</td>
			<td style="width:71px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BP145B3</td>
			<td>For making beam replica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Protected silver mirror</td>
			<td style="width:71px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">PF10-03-P01</td>
			<td>For reflecting light</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver</td>
			<td style="width:71px;">Newport</td>
			<td style="width:119px;">1544-B</td>
			<td>For converting light into electrical signal</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Infiniium High-Performance Oscilloscope</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSOX91604A</td>
			<td>To save the light-converted electrical signals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">HI1060 optical fiber</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">HI1060</td>
			<td>Optical fiber for time-stretch</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER</td>
			<td style="width:71px;">Keopsys</td>
			<td style="width:119px;">KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td>
			<td>Optical in-line amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:207px;">Holographic grating</td>
			<td style="width:71px;">Wasatch Photonics</td>
			<td style="width:119px;">020305-6</td>
			<td>Grating</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">Infuse/Withdraw Syringe Pumps</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">PHD 2000</td>
			<td>Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic imaging flow cytometry by asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (atom)

Escalar el número de parámetros medibles, lo que permite el análisis de datos multidimensionales y, por tanto, resultados estadísticos de mayor confianza, ha sido la principal tendencia en el desarrollo avanzado de la citometría de flujo. En particular, la adición de capacidades de imagen de alta resolución permite el análisis morfológico complejo de estructuras celulares / sub-celulares. Esto no es posible con citómetros de flujo estándar. Sin embargo, es valiosa para avanzar en nuestro conocimiento de las funciones celulares y puede beneficiar la investigación de las ciencias de la vida, el diagnóstico clínico y el monitoreo ambiental. La incorporación de capacidades de imagen en citometría de flujo compromete el rendimiento del análisis, principalmente debido a las limitaciones en la velocidad y sensibilidad en las tecnologías de cámara. Para superar este reto de velocidad o rendimiento enfrentado a la citometría de flujo de imágenes mientras se preserva la calidad de imagen, se ha demostrado que la microscopía óptica de estiramiento de tiempo de detección asimétrica (ATOM) permiteCon una resolución sub-celular, con una capacidad de procesamiento de imágenes de hasta 100.000 células / s. Basado en el concepto de imagen de imágenes de estiramiento de tiempo convencional, que se basa en la codificación y recuperación de toda la imagen óptica mediante el uso de pulsos de láser de banda ancha ultrarrápidos, ATOM avanza adicionalmente el rendimiento de imagen aumentando el contraste de imagen de células no etiquetadas / no teñidas. Esto se logra accediendo a la información de gradiente de fase de las células, que se codifica espectralmente en impulsos de banda ancha de un solo disparo. Por lo tanto, el ATOM es particularmente ventajoso en mediciones de alto rendimiento de la morfología de una sola célula y de la textura - información indicativa de tipos de células, estados e incluso funciones. En última instancia, esto podría convertirse en una potente plataforma de citometría de flujo de imágenes para el fenotipado biofísico de las células, que complementa el estado actual de la técnica bioquímica basada en marcador de ensayo celular. Este trabajo describe un protocolo para establecer los módulos clave de un sistema ATOM (desde el frontend óptico a los datos pRocessing y visualización backend), así como el flujo de trabajo de citometría de flujo de imagen basado en ATOM, utilizando células humanas y microalgas como ejemplos.

<html> Este trabajo ilustra dos demostraciones de una sola célula de imágenes por ATOM: una con células de mamíferos (células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y células de cáncer de mama (MCF-7)) y otra con fitoplancton s (Scenedesmus y Chlamydomonas). El primer experimento fue motivado por el creciente interés en la biopsia líquida para la detección, enumeración y caracterización de células tumorales circulantes (CTC) en la sangre <sup class...

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Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes.

Microfluidic Imaging Cytometría de flujo por Asimétrica de detección de tiempo de estiramiento Microscopía óptica (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

microfluidic-imaging-flow-cytometry-asymmetric-detection-time-stretch

Research

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Electrical Engineering

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Unit 1

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Operational Amplifiers

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K vistas.  The University of Hong Kong.  Este protocolo describe la implementación de un sistema de microscopía óptica de estiramiento-tiempo de detección asimétrica para la obtención de imágenes de una sola célula en el flujo microfluídico ultrarrápido y sus aplicaciones en citometría de flujo por imágenes. 

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Fabricating Metamaterials Using the Fiber Drawing Method

Metamaterials are man-made composite materials, fabricated by assembling components much smaller than the wavelength at which they operate 1. They owe their electromagnetic properties to the structure of their constituents, instead of the atoms that compose them. For example, sub-wavelength metal wires can be arranged to possess an effective electric permittivity that is either positive or negative at a given frequency, in contrast to the metals themselves 2. This unprecedented control over the behaviour of light can potentially lead to a number of novel devices, such as invisibility cloaks 3, negative refractive index materials 4, and lenses that resolve objects below the diffraction limit 5. However, metamaterials operating at optical, mid-infrared and terahertz frequencies are conventionally made using nano- and micro-fabrication techniques that are expensive and produce samples that are at most a few centimetres in size 6-7. Here we present a fabrication method to produce hundreds of meters of metal wire metamaterials in fiber form, which exhibit a terahertz plasmonic response 8. We combine the stack-and-draw technique used to produce microstructured polymer optical fiber 9 with the Taylor-wire process 10, using indium wires inside polymethylmethacrylate (PMMA) tubes. PMMA is chosen because it is an easy to handle, drawable dielectric with suitable optical properties in the terahertz region; indium because it has a melting temperature of 156.6 &deg;C which is appropriate for codrawing with PMMA. We include an indium wire of 1 mm diameter and 99.99% purity in a PMMA tube with 1 mm inner diameter (ID) and 12 mm outside diameter (OD) which is sealed at one end. The tube is evacuated and drawn down to an outer diameter of 1.2 mm. The resulting fiber is then cut into smaller pieces, and stacked into a larger PMMA tube. This stack is sealed at one end and fed into a furnace while being rapidly drawn, reducing the diameter of the structure by a factor of 10, and increasing the length by a factor of 100. Such fibers possess features on the micro- and nano- scale, are inherently flexible, mass-producible, and can be woven to exhibit electromagnetic properties that are not found in nature. They represent a promising platform for a number of novel devices from terahertz to optical frequencies, such as invisible fibers, woven negative refractive index cloths, and super-resolving lenses.

Metamaterials at terahertz frequencies offer unique opportunities, but are challenging to fabricate in bulk. We adapt the fabrication procedure for microstructured polymer optical fibers to inexpensively fabricate metamaterials potentially on an industrial scale. We produce polymethylmethacrylate fibers containing ~10 &mu;m diameter indium wires separated by ~100 &mu;m, which exhibit a terahertz plasmonic response.

Los metamateriales Fabricacion mediante el método de dibujo de fibra

Metamaterials are man-made composite materials, fabricated by assembling components much smaller than the wavelength at which they operate 1. They owe ...

Investigación

Ingeniería

Determining 3D Flow Fields via Multi-camera Light Field Imaging

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and observed phenomena in fluid flows. Thus, a need exists for an accessible method capable of resolving three-dimensional (3D) data sets for a range of problems. We present a novel technique for performing quantitative 3D imaging of many types of flow fields. The 3D technique enables investigation of complicated velocity fields and bubbly flows. Measurements of these types present a variety of challenges to the instrument. For instance, optically dense bubbly multiphase flows cannot be readily imaged by traditional, non-invasive flow measurement techniques due to the bubbles occluding optical access to the interior regions of the volume of interest. By using Light Field Imaging we are able to reparameterize images captured by an array of cameras to reconstruct a 3D volumetric map for every time instance, despite partial occlusions in the volume. The technique makes use of an algorithm known as synthetic aperture (SA) refocusing, whereby a 3D focal stack is generated by combining images from several cameras post-capture 1. Light Field Imaging allows for the capture of angular as well as spatial information about the light rays, and hence enables 3D scene reconstruction. Quantitative information can then be extracted from the 3D reconstructions using a variety of processing algorithms. In particular, we have developed measurement methods based on Light Field Imaging for performing 3D particle image velocimetry (PIV), extracting bubbles in a 3D field and tracking the boundary of a flickering flame. We present the fundamentals of the Light Field Imaging methodology in the context of our setup for performing 3DPIV of the airflow passing over a set of synthetic vocal folds, and show representative results from application of the technique to a bubble-entraining plunging jet.

A technique for performing quantitative three-dimensional (3D) imaging for a range of fluid flows is presented. Using concepts from the area of Light Field Imaging, we reconstruct 3D volumes from arrays of images. Our 3D results span a broad range including velocity fields and multi-phase bubble size distributions.

La determinación de los campos de flujo a través de imágenes en 3D multi-cámara de campo de luz

In the field of fluid mechanics, the resolution of computational schemes has outpaced experimental methods and widened the gap between predicted and ...

Optical Trapping of Nanoparticles

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping and manipulating small biological particles. Ashkin and co-workers first demonstrated optical tweezers using a single focused beam1. The single beam trap can be described accurately using the perturbative gradient force formulation in the case of small Rayleigh regime particles1. In the perturbative regime, the optical power required for trapping a particle scales as the inverse fourth power of the particle size. High optical powers can damage dielectric particles and cause heating. For instance, trapped latex spheres of 109 nm in diameter were destroyed by a 15 mW beam in 25 sec1, which has serious implications for biological matter2,3.
A self-induced back-action (SIBA) optical trapping was proposed to trap 50 nm polystyrene spheres in the non-perturbative regime4. In a non-perturbative regime, even a small particle with little permittivity contrast to the background can influence significantly the ambient electromagnetic field and induce a large optical force. As a particle enters an illuminated aperture, light transmission increases dramatically because of dielectric loading. If the particle attempts to leave the aperture, decreased transmission causes a change in momentum outwards from the hole and, by Newton's Third Law, results in a force on the particle inwards into the hole, trapping the particle. The light transmission can be monitored; hence, the trap can become a sensor. The SIBA trapping technique can be further improved by using a double-nanohole structure.
The double-nanohole structure has been shown to give a strong local field enhancement5,6. Between the two sharp tips of the double-nanohole, a small particle can cause a large change in optical transmission, thereby inducing a large optical force. As a result, smaller nanoparticles can be trapped, such as 12 nm silicate spheres7 and 3.4 nm hydrodynamic radius bovine serum albumin proteins8. In this work, the experimental configuration used for nanoparticle trapping is outlined. First, we detail the assembly of the trapping setup which is based on a Thorlabs Optical Tweezer Kit. Next, we explain the nanofabrication procedure of the double-nanohole in a metal film, the fabrication of the microfluidic chamber and the sample preparation. Finally, we detail the data acquisition procedure and provide typical results for trapping 20 nm polystyrene nanospheres.

The following setup approach details low power optical trapping of dielectric nanoparticles using a double-nanohole in metal film.

Trampas ópticas de las nanopartículas

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Atom Probe Tomography Studies on the Cu(In,Ga)Se2 Grain Boundaries

Compared with the existent techniques, atom probe tomography is a unique technique able to chemically characterize the internal interfaces at the nanoscale and in three dimensions. Indeed, APT possesses high sensitivity (in the order of ppm) and high spatial resolution (sub nm).
Considerable efforts were done here to prepare an APT tip which contains the desired grain boundary with a known structure. Indeed, site-specific sample preparation using combined focused-ion-beam, electron backscatter diffraction, and transmission electron microscopy is presented in this work. This method allows selected grain boundaries with a known structure and location in Cu(In,Ga)Se2 thin-films to be studied by atom probe tomography.
Finally, we discuss the advantages and drawbacks of using the atom probe tomography technique to study the grain boundaries in Cu(In,Ga)Se2 thin-film solar cells.

Atom Probe Tomography Studies on the CuIn,GaSe2 Grain Boundaries

In this work, we describe the use of the atom-probe tomography technique for studying the grain boundaries of the absorber layer in a CIGS solar cell. A novel approach to prepare the atom probe tips containing the desired grain boundary with a known structure is also presented here.

Estudios de tomografía sonda atómica en el Cu (In, Ga) de Se<sub&gt; 2</sub&gt; Los límites de grano

Compared with the existent techniques, atom probe tomography is a unique technique able to chemically characterize the internal interfaces at the ...

Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles

We demonstrate how optical tweezers may provide a sensitive tool to analyze the fluidic vibrations generated by the movement of small aquatic organisms. A single gold nanoparticle held by an optical tweezer is used as a sensor to quantify the rhythmic motion of a Nauplius larva (Artemia salina) in a water sample. This is achieved by monitoring the time dependent displacement of the trapped nanoparticle as a consequence of the Nauplius activity. A Fourier analysis of the nanoparticle&#39;s position then yields a frequency spectrum that is characteristic to the motion of the observed species. This experiment demonstrates the capability of this method to measure and characterize the activity of small aquatic larvae without the requirement to observe them directly and to gain information about the position of the larvae with respect to the trapped particle. Overall, this approach could give an insight on the vitality of certain species found in an aquatic ecosystem and could expand the range of conventional methods for analyzing water samples.

Analyzing the Movement of the Nauplius 'Artemia salina' by Optical Tracking of Plasmonic Nanoparticles

We use optical tracking of plasmonic nanoparticles to probe and characterize the frequency movements of aquatic organisms.

Analizando el movimiento de la Nauplio &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Por Optical Tracking de plasmónicas nanopartículas

We demonstrate how optical tweezers may provide a sensitive tool to analyze the fluidic vibrations generated by the movement of small aquatic organisms. A ...

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This method provides little direct information about what is happening on the surface of the dissolving tablet. As the tablet surface composition and structure can change during dissolution, it is essential to monitor it during dissolution testing. In this work coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy is used to image the surface of tablets during dissolution while UV absorption spectroscopy is simultaneously providing inline analysis of dissolved drug concentration for tablets containing a 50% mixture of theophylline anhydrate and ethyl cellulose. The measurements showed that in situ CARS microscopy is capable of imaging selectively theophylline in the presence of ethyl cellulose. Additionally, the theophylline anhydrate converted to theophylline monohydrate during dissolution, with needle-shaped crystals growing on the tablet surface during dissolution. The conversion of theophylline anhydrate to monohydrate, combined with reduced exposure of the drug to the flowing dissolution medium resulted in decreased dissolution rates. Our results show that in situ CARS microscopy combined with inline UV absorption spectroscopy is capable of monitoring pharmaceutical tablet dissolution and correlating surface changes with changes in dissolution rate.

Coherent anti-Stokes Raman Scattering CARS Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy is combined with an intrinsic flow-through dissolution setup to allow in situ and real-time visualization of the surface of pharmaceutical tablets undergoing dissolution. Using this custom-built setup, it is possible to correlate CARS videos with drug dissolution profiles recorded using inline UV absorption spectroscopy.

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopía visualiza Tablets Farmacéuticos durante la disolución

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong suppression at a single wavelength requires that all cores have matching transmission profiles. These gratings cannot be inscribed using the same method as for single-core fibers because the curved surface of the cladding acts as a lens, focusing the incoming UV laser beam and causing variations in exposure between cores. Therefore we use an additional optical element to ensure that the beam shape does not change while passing through the cross-section of the multicore fiber. This consists of a glass capillary tube which has been polished flat on one side, which is then placed over the section of the fiber to be inscribed. The laser beam enters the fiber through the flat surface of the capillary tube and hence maintains its original dimensions. This paper demonstrates the improvements in core-to-core uniformity for a 7-core fiber using this method. The technique can be generalized to larger multicore fibers.

We describe a technique for inscribing identical fiber Bragg gratings into each core of a multicore fiber. This is achieved by introducing an additional surface into the optical path to mitigate lensing by the curved surface of the fiber cladding.

La escritura de Bragg en fibras Multicore

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

Dinámica de los poros a escala embalse condición de imagen de la Reacción en carbonatos Uso de Sincrotrón Tomografía rápida

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into sound waves and is currently under intensive investigation. However, most reported work to date is focused on the imaging of the posterior segment of the eyes of small animals, such as rats and mice, which poses challenges for clinical human translation due to small eyeball sizes. This manuscript describes a novel photoacoustic microscopy (PAM) and optical coherence tomography (OCT) dual-modality system for posterior segment imaging of the eyes of larger animals, such as rabbits. The system configuration, system alignment, animal preparation, and dual-modality experimental protocols for in vivo, noninvasive, label-free chorioretinal imaging in rabbits are detailed. The effectiveness of the method is demonstrated through representative experimental results, including retinal and choroidal vasculature obtained by the PAM and OCT. This manuscript provides a practical guide to reproducing the imaging results in rabbits and advancing photoacoustic ocular imaging in larger animals.

This manuscript describes the novel setup and operating procedure of a photoacoustic microscopy and optical coherence tomography dual-modality system for noninvasive, label-free chorioretinal imaging of larger animals, such as rabbits.

Novela de fotoacústica de microscopía y tomografía de coherencia óptica Dual-modalidad coriorretinal la proyección de imagen en ojos de conejo vivo

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

Generation of Size-controlled Poly (ethylene Glycol) Diacrylate Droplets via Semi-3-Dimensional Flow Focusing Microfluidic Devices

Uniform and size-controllable poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) droplets could be produced via the flow focusing process in a microfluidic device. This paper proposes a semi-three-dimensional (semi-3D) flow-focusing microfluidic chip for droplet formation. The polydimethylsiloxane (PDMS) chip was fabricated using the multi-layer soft lithography method. Hexadecane containing surfactant was used as the continuous phase, and PEGDA with the ultraviolet (UV) photo-initiator was the dispersed phase. Surfactants allowed the local surface tension to drop and formed a more cusped tip which promoted breaking into tiny micro-droplets. As the pressure of dispersed phase was constant, the size of droplets became smaller with increasing continuous phase pressure before dispersed phase flow was broken off. As a result, droplets with size variation from 1 &#181;m to 80 &#181;m in diameter could be selectively achieved by changing the pressure ratio in two inlet channels, and the average coefficient of variation was estimated to be below 7%. Furthermore, droplets could turn into micro-beads by UV exposure for photo-polymerization. Conjugating biomolecules on such micro-beads surface have many potential applications in the fields of biology and chemistry.

Generation of Size-controlled Poly ethylene Glycol Diacrylate Droplets via Semi-3-Dimensional Flow Focusing Microfluidic Devices

Here, we present a protocol to illustrate the fabrication processes and verifying experiments of a semi-three-dimensional (semi-3D) flow-focusing microfluidic chip for droplet formation.

Generación de tamaño controlado poli (etilenglicol) Diacrylate gotas vía Semi 3-Dimensional del flujo centrándose dispositivos microfluídicos

Uniform and size-controllable poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) droplets could be produced via the flow focusing process in a microfluidic device. ...