Nuestro protocolo describe un método de micromolienda de alta resolución para fabricar un dispositivo microfluídico acrílico para la inmunodetección cuantitativa de concentraciones de analitos comparable a la técnica ELISA estándar de oro. Lo más destacado es la fabricación de un dispositivo microfluídico termoplástico simple y de bajo costo sin sala limpia, que permite tiempos de ensayo más cortos y buenos límites de detección de manera cuantitativa. Comience por la molienda de la superficie.
Corte rectángulos de 9 x 25 milímetros de PMMA de 1,3 milímetros de espesor con la broca final de 800 micrómetros. Fije uno de estos rectángulos cuidadosamente con cinta adhesiva de doble cara a la plataforma piezoeléctrica. Conecte y coloque el sensor Z en la superficie del rectángulo de PMMA.
Seleccione el pin de detección y muévalo sobre la superficie del sensor. Baje el pin manualmente sin entrar en contacto con el sensor. Active el modo de detección Z-zero.
Gire la broca de 200 micrómetros a 14, 500 rpm. Baje lentamente hasta la coordenada de origen en el eje z. Luego reinicie el eje z 30 micrómetros por debajo del origen.
Establezca esta coordenada como el nuevo origen Z. Haga clic en el botón Cortar en el software de la microfresadora para activar el panel de corte. Haga clic en el botón Agregar y seleccione el archivo TXT con un código creado previamente para el rectificado de la superficie acrílica.
Haga clic en el botón Salida para iniciar el proceso. Para el fresado de la restricción de cinco micrómetros, primero, establezca la velocidad de rotación de la broca final en 11, 000 rpm. Luego, eleve la plataforma en 6.5 micrómetros con la interfaz de la plataforma piezoeléctrica.
Mueva la broca final a lo largo del eje y en 500 micrómetros. Devuelva la plataforma piezoeléctrica a su valor inicial en el eje z con la interfaz de control. A continuación, realice el fresado de microcanales abriendo el archivo de diseño creado previamente desde el software de diseño.
Haga clic en el botón Imprimir, acceda al menú de propiedades y haga clic en la ventana de color correspondiente a la capa que contiene el diseño a mecanizar. Defina los parámetros de fabricación en el panel de herramientas. Para el fresado de orificios, cambie a la broca final de 800 micrómetros.
Active la capa de diseño de los orificios de 1,2 milímetros de diámetro haciendo clic en la ventana de color correspondiente y seleccionando los parámetros de fabricación correspondientes. Mecanizar dos orificios adicionales en las esquinas contralaterales del rectángulo para la alineación del acrílico de manera invertida en una nueva plataforma. Voltea el acrílico y pégalo con cinta adhesiva de doble cara sobre el adaptador con los pilares mecanizados.
Abra el archivo con el diseño de los orificios para la cara opuesta del software de diseño. Moler la mitad restante de los orificios de entrada y salida del reactivo con un diámetro de 1,5 milímetros y una profundidad de 0,7 milímetros. Limpie ambas láminas rectangulares de acrílico con alcohol isopropílico y enjuague con agua destilada.
Sumerja el acrílico en un baño ultrasónico durante 10 minutos. Seque ambas láminas de acrílico y péguelas con cinta adhesiva al interior de una tapa de placa de Petri de vidrio con cinta adhesiva de doble cara. Luego coloque la base de la placa de Petri de vidrio dentro de una placa de Petri de vidrio más grande.
Vierta un mililitro de cloroformo en la base de la placa de Petri y coloque rápidamente la tapa con las láminas de acrílico. Agregue inmediatamente agua destilada a la base de la placa de Petri más grande hasta el nivel de la tapa de la placa de Petri. Permita la exposición del acrílico al gas cloroformo durante un minuto.
Luego incline la placa de Petri para romper el sello de agua e inmediatamente descubra la placa de Petri. Para la unión, alinee ambos acrílicos con los lados expuestos al cloroformo cara a cara y forme un sándwich. Coloque los acrílicos en la prensa durante dos intervalos de dos minutos, cambiando la alineación del acrílico.
Luego, conecte de dos a tres centímetros de manguera a cada uno de los orificios del dispositivo con adhesivo líquido de secado instantáneo. Llene los canales con agua destilada usando una jeringa. Sumerja el dispositivo en un baño ultrasónico durante 10 minutos.
Luego vacíe el agua dentro de los canales del dispositivo y use una jeringa para introducir una solución BSA al 5%. Preparar una suspensión de micropartículas de hierro de diámetro a 7,5 micrómetros en 5% BSA. Incubar el chip y la suspensión de micropartículas con la solución de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente.
A continuación, inserte las micropartículas en el chip con una aguja de jeringa a través de la manguera de salida del canal lateral. Coloque el chip verticalmente, luego gire el chip en dos pasos de 90 grados de modo que las micropartículas se dirijan y compacten en la restricción de cinco micrómetros. Selle todas las mangueras del dispositivo acrílico con calor.
Corte la manguera de entrada hasta que solo queden unos pocos milímetros. Llene la aguja dispensadora con un tampón de lavado e insértela en la manguera de corte. Deje que la solución gotee y luego conecte la aguja al dispositivo.
Corte la manguera de salida del canal lateral y, a continuación, conéctela a la bomba de la jeringa. A continuación, repita el mismo procedimiento para la manguera de salida del canal principal. Luego conecte el chip al imán.
Para la inmunodetección, mantenga el tampón de lavado fluyendo durante 10 minutos a 50 microlitros por hora. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta y agregue 50 microlitros de la suspensión de nanopartículas. Fluya la suspensión de nanopartículas durante siete minutos a un caudal de 100 microlitros por hora.
Luego cambie el caudal a 50 microlitros por hora y continúe el flujo durante otros 15 minutos. Cambie la aguja dispensadora y haga fluir el tampón de lavado durante 10 minutos a la misma velocidad. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta y agregue 100 microlitros del sustrato fluorogénico.
Ajuste los parámetros de caudal y tiempo para la entrada de sustrato, la medición de fluorescencia y el paso de lavado. Activar el flujo de entrada del sustrato fluorogénico durante seis minutos a 50 microlitros por hora. 15 segundos antes de que se detenga el flujo del sustrato, encienda la fluorescencia del microscopio.
Inicie la captura de imágenes con el software de la cámara del microscopio 10 segundos antes de que el sustrato se detenga con un tiempo de exposición de 1.000 milisegundos. Haga clic en el botón Inicio del parámetro de caudal deseado inmediatamente después de que se detenga el lavado del sustrato. Realice imágenes durante seis minutos a un fotograma por segundo.
Haga clic en el botón Inicio del flujo de lavado inmediatamente después de que se detenga el flujo de medición seleccionado. Para el inmunoensayo se utilizaron nanopartículas conjugadas con lisozima y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. Se observó un aumento en la intensidad de fluorescencia para diferentes concentraciones de anticuerpos primarios comparando regiones antes y después de la trampa, mostrando que el cambio en la fluorescencia del sustrato es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos primarios.
Para una concentración dada de anticuerpo primario, la intensidad de fluorescencia se trazó en función del tiempo a diferentes velocidades de flujo del sustrato fluorogénico. La capacidad de conversión del sustrato por la enzima HRP fue inversamente proporcional al caudal, se obtuvo una intensidad máxima para un caudal de un microlitro por hora. Para las diferentes tasas de flujo para varias concentraciones de anticuerpos primarios, las curvas de las diferencias de fluorescencia después y antes de la inmunorreacción mostraron que para una concentración de 1, 000 nanogramos por mililitro, la fluorescencia se satura para todas las tasas de flujo evaluadas.
Se preparó una curva de calibración utilizando el valor máximo de las diferencias en la intensidad de fluorescencia obtenidas con respecto a la concentración de anticuerpos primarios para cada caudal. La alta variabilidad y los altos niveles de fluorescencia a un microlitro por hora sugieren que la velocidad no favorece el flujo del sustrato que reacciona y tiende a acumularse justo después de la trampa. Se debe prestar especial atención a los pasos de sellado de los microcanales, ya que la exposición al cloroformo es muy sensible a la temperatura.
Para obtener resultados reproducibles, la temperatura debe ser siempre la misma. Nuestro sistema ayuda a comprender dónde la compacidad y el tamaño de las micropartículas, el tamaño de las nanopartículas, los antígenos, el anticuerpo de detección y el sustrato son factores determinantes para el límite de detección en el inmunoensayo microfluídico basado en nanopartículas.
