Dado que el flujo microvascular varía entre capilares y cambios a lo largo de un tiempo de segundos, se necesita un método para la cuantificación continua del flujo en campos enteros. El personal permite una medición casi continua de las velocidades de flujo en campos de microscopio completos, en cuestión de horas, que de otro modo tardarían meses en obtenerse manualmente. Aunque estos procedimientos son sencillos, la demostración visual ayudará significativamente a los nuevos usuarios a navegar por el personal por primera vez.
Para utilizar TrakEM2 para definir la red vascular, seleccione primero Archivo, Nuevo y TrakEM2 en blanco para configurar un nuevo proyecto TrakEM2 en blanco y seleccione la nueva carpeta que contiene la imagen única de la película como carpeta del proyecto. Se abrirán las ventanas TrakEM2. Haga clic con el botón derecho en el área de trabajo principal y seleccione Importar e importar imagen.
Navegue hasta la única imagen guardada y seleccione la imagen. Haga clic con el botón derecho en el área de trabajo principal de nuevo y seleccione Mostrar y Cambiar el tamaño automático de Canvas/LayerSet. A continuación, haga clic con el botón izquierdo en la ventana de trabajo principal.
La imagen rellenará el área de trabajo. Para seleccionar las áreas de la imagen que contienen la red vascular, en la ventana TrakEM2 más pequeña, haga clic con el botón derecho en la plantilla Cualquier cosa y seleccione Agregar nueva lista secundaria y de área. En la ventana TrakEM2 más pequeña, arrastre la plantilla Anything a Project Objects, proyecto sin título.
A continuación, arrastre la plantilla Cualquier cosa, lista de áreas, a Objetos de proyecto, proyectos sin título, Cualquier cosa. En Objetos de proyecto, proyecto sin título, ahora estará presente la lista de áreas Cualquier cosa. En la ventana principal de TrakEM2, en la pestaña Espacio Z, se habrá creado una barra con la etiqueta Lista de áreas.
Haga clic para seleccionar la lista. En la ventana principal de TrakEM2, seleccione la herramienta de pincel y haga clic en Mayús mientras rueda la rueda del ratón para seleccionar un tamaño de pincel menor que el diámetro de la vasculatura de interés. Presione Control S para guardar el proyecto.
Con la herramienta de pincel, pinte la red vascular, excluyendo las regiones fuera de foco. Cuando finalice el etiquetado, haga clic con el botón derecho en la ventana principal de TrakEM2 y seleccione Exportar y listas de áreas como etiquetas. En la ventana emergente, seleccione Escala, 100% y exporte toda la lista de áreas.
Cierre las ventanas TrakEM2 y seleccione Sí para guardar el proyecto. La imagen de la lista de áreas se abrirá y puede aparecer como una imagen en blanco y negra. En el menú principal de Fiji, seleccione Imagen, Ajustar y Brillo/Contraste.
En la ventana Brillo y contraste, haga clic en Automático y la lista de áreas se hará visible. En el menú principal de Fiji, seleccione Imagen, Tablas de búsqueda e Invertir tabla de búsqueda. Guarde esta imagen de etiquetas negras sobre fondo blanco como un archivo t-i-f y cierre la imagen.
Abra el archivo Etiquetas en Fiji y seleccione Plugins, Skeleton y Skeleton Eyes. A continuación, guarde la imagen De Skeleton Eyes como un archivo t-i-f. Para crear un nuevo proyecto de personal, seleccione Plugins, Macros y Abrir/Crear proyecto y siga las indicaciones para crear o actualizar un archivo de configuración.
En el menú Abrir/Crear proyecto, desplácese hasta la carpeta Archivo de entrada del directorio del proyecto y los archivos Entrada película y Esqueleto. Introduzca los valores de la velocidad máxima medida, la velocidad máxima asignada, la longitud mínima del segmento, el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas. Marque la casilla corrección de parpadeo si las imágenes tienen parpadeo periódico de intensidad de fondo y haga clic en Aceptar. Ajuste los parámetros para la mejor visualización de los datos.
Establezca la velocidad máxima asignada para incluir aproximadamente el 95 por ciento de los datos, de modo que los datos se asignen en todo el rango de la escala de colores. Para analizar el esqueleto, seleccione Plugins, Macros y Analizar esqueleto. El archivo esqueleto se abrirá y el administrador de la región de interés se abrirá y ejecutará.
En el Administrador de regiones de interés, haga clic en Mostrar todo y etiquetar y haga clic en Aceptar. Para seleccionar los intervalos de tiempo, seleccione Plugins, Macros y Editar intervalos de tiempo y espere a que la macro genere un cifógrafo a partir de un único segmento durante el tiempo total de la película. Utilice las teclas Control más y menos para aumentar el tamaño del cifógrafo según sea necesario y utilice la herramienta de selección Rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de cada intervalo de tiempo. Pulse la tecla T o haga clic en el botón Agregar para grabar una selección de intervalo de tiempo y repetir la selección durante tantos intervalos de tiempo como desee.
Para evaluar las opciones de parámetros, seleccione de tres a cuatro intervalos de tiempo y complete el análisis solo para esos intervalos. Haga clic en Aceptar cuando se haya completado la selección del intervalo de tiempo. Aparecerá una ventana emergente cuando se hayan guardado los intervalos seleccionados en la carpeta del proyecto.
Haga clic en Aceptar. Para analizar el flujo, seleccione Plugins, Macros y Analizar flujo. El cuadro de diálogo Analizar parámetros de flujo se abrirá y mostrará los valores introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto. Edite estos valores si es necesario y haga clic en Aceptar. El cuadro de diálogo Nombres de archivo de salida se abrirá y mostrará los nombres introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto.
Edite estos nombres según sea necesario y haga clic en Aceptar para iniciar el análisis de flujo. Cuando aparezca un cuadro de diálogo que indica que se ha analizado el flujo, haga clic en Aceptar para almacenar los resultados del análisis en archivos de hoja de cálculo CSV. Para generar mapas espaciales, seleccione Plugins, Macros y Produce Spatial Map.
Se abrirá la ventana Parámetros de mapa espacial que muestra los valores introducidos en el paso Abrir/Crear proyecto. Edite estos valores según sea necesario y haga clic en Aceptar. Se generará una secuencia temporal de mapas espaciales de velocidades de flujo con cada color que indica una velocidad de flujo. Desplácese por la pila generada de una imagen por intervalo para visualizar las variaciones espaciales y temporales en el flujo y guarde la pila como un archivo a-v-i para compartir el archivo como una película.
El análisis del personal genera el censo completo de las velocidades microvasculares en campos enteros del microscopio, durante períodos de tiempo que se extienden de segundos a minutos. Por ejemplo, utilizando una sola imagen en esta serie temporal de la red microvascular en el hígado de un ratón, la imagen esqueletizada generada se utilizó para definir el eje del flujo microvascular, permitiendo identificar el mapa generado por el pentagrama de segmentos vasculares individuales para la cuantificación posterior del flujo. A partir de los segmentos vasculares individuales generados a partir de la imagen esqueletizada, se pueden generar cifógrafos que representan la intensidad a lo largo de cada segmento de línea a lo largo del tiempo.
Los intervalos de tiempo Esqueleto y Suministro de usuario se pueden utilizar para dividir el cifógrafo de cada segmento en intervalos de tiempo de segmento individuales. A continuación, el pentagrama identifica el ángulo predominante en el cifógrafo de cada intervalo de tiempo de segmento y proporciona las mediciones de velocidad calculadas como archivos de datos CSV. La salida CSV del pentagrama se puede utilizar para analizar la distribución de velocidad general para permitir el trazado de la velocidad en los segmentos vasculares individuales a lo largo del tiempo.
Y se puede visualizar como pilas de imágenes de mapa de velocidad codificadas por colores. Tenga en cuenta que los resultados que provienen del personal dependen de la calidad de la serie de imágenes, con respecto a la estabilidad de la muestra, la velocidad de fotogramas, la resolución y la relación señal-ruido. Las salidas del mapa de velocidad del pentagrama permiten una exploración intuitiva de los patrones de flujo espacial, mientras que las salidas CSV del pentagrama permiten el análisis estadístico de las velocidades de flujo, tanto dentro como entre los grupos de tratamiento.
