El objetivo general de este procedimiento de inyección subretiniana es entregar un vector a la retina de una manera mínimamente invasiva y reproducible que sea observable en tiempo real. Hola, este método se puede utilizar para responder preguntas clave en la investigación de terapia génica sobre la eficacia de la administración de vectores y la toxicidad del agente terapéutico. Algunas ventajas de esta técnica incluyen un daño mínimo a la retina y otras estructuras oculares, mapeo preciso del lugar de inyección y rigurosas mediciones cuantitativas in vivo que permiten una inferencia estadística sólida.
Para la inyección de transgenes intraoculares, coloque primero un ratón anestesiado en la etapa de visualización de un microscopio del sistema de imágenes de la retina y coloque las puntas de un iris romo estéril en las posiciones de las siete y las 10 del párpado mientras empuja los fórceps abiertos y hacia abajo para inducir suavemente proptosis. Utilice los fórceps para persuadir a los párpados debajo del globo ocular y dirija la punta de la aguja a aproximadamente uno a 1,5 milímetros por debajo del borde del limbo corneal. A continuación, aplique una gota de solución estéril de PBS en el ojo y cubra el ojo con un resbalón de cubierta estéril.
Conduzca con cuidado la aguja hacia el ojo a través de la conjuntiva hasta que se cree una depresión escleral. Utilice el micro manipulador para girar el ojo hacia arriba hasta que la depresión escleral esté enfocada, luego conduzca la aguja hacia adelante para crear un pico agudo en la retina con la punta de la aguja. Usando el soporte de la aguja, gire la aguja hasta que la punta de la aguja se aburre a través de la esclerótica y el RPE, permitiendo que la flouresceína en la punta de la aguja sea visible bajo el tejido de la retina en las inmediaciones del espacio subretinal y la monocapa de células de epitelio pigmentario de la retina.
Conduzca la punta de la aguja hacia abajo para que sea tangencial al globo, luego active la bomba de inyección con el interruptor del pedal. Después de 0,5 a una microlitros de solución transgéntica se ha entregado al espacio subretinal, retire la aguja y confirme que la sangre es estable y que el líquido no se escapa del sitio del tracto de inyección. Para confirmar el éxito de la inyección, grabe un OCT de volumen rectangular y compare las imágenes con imágenes de los diferentes tipos de posibles resultados de inyección.
Después de la confirmación de la colocación correcta de la inyección, utilice esa imagen OCT rectangular para asignar la extensión del bleb a la imagen de fondo. Para mapear la extensión del bleb subretinal, abra una imagen OCT de volumen rectangular del bleb de modo que se incluya en la imagen un punto de referencia reconocible dentro del ojo. Agregue tantas pinzas como sea necesario para identificar la posición de los bordes izquierdo y derecho de la exploración B, así como la cabeza del nervio óptico, ONH, si está presente, y el punto de inflexión donde la retina se separa del RPE y la coroides y luego guarda los datos.
A continuación, compile los archivos guardados y trace los datos, creando eficazmente un mapa del bleb de inyección en la imagen OCT en face. Superponga los datos trazados en la imagen de fondo que contiene el lugar de inyección y guarde la imagen combinada. Utilice esta imagen para localizar regiones de interés durante la toma de imágenes de OCT de seguimiento.
Para evaluar la degeneración de la retina posterior a la inyección, abra primero una imagen de volumen rectangular OCT o HRSD OCT de dominio espectral de alta resolución grabada y seleccione una exploración B que se medirá. Amplíe la imagen seleccionada hasta que llene la pantalla y haga clic con el botón derecho en la imagen. Haga clic en pinzas para seleccionar el número adecuado de pinzas y, a continuación, utilice la función configurar pinzas para asignar las pinzas como verticales en la columna de bloque angular y activar la ubicación de la pinza de visualización para facilitar la colocación uniforme de la pinza en toda la retina.
Haga clic en Aplicar y mueva cada pinza a la ubicación adecuada de 0,1 a 0,2 milímetros de separación a través de la exploración B, teniendo cuidado de colocar una pinza en el centro de la cabeza del nervio óptico cuando corresponda. Cuando se hayan colocado todas las pinzas, haga clic y arrastre cada pinza al intervalo de longitud de la región de interés, estableciendo arbitrariamente las pinzas que no se superponen a las regiones mensurables del escaneo B a la longitud máxima. Para medir el espesor de la capa nuclear externa, coloque la parte superior de cada pinza en la membrana limitante externa y la parte inferior de cada pinza en la parte inferior de la capa plexiforme externa en incrementos de 0,1 a 0,2 milímetros a través de la retina.
Después de que todas las pinzas se han colocado y ajustado al tamaño, haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Guardar datos de pinza", luego repita las medidas como se acaba de demostrar para cada décimo escaneo B, manteniendo las pinzas abiertas y en la misma ubicación en el eje X y ajuste las longitudes de las pinzas según sea necesario, sin moverlas en la dirección x. Cuando se hayan medido todos los análisis, abra los archivos de datos guardados y haga clic en la fecha modificada "para organizar los archivos según el tiempo guardado. Abra todos los archivos para cada análisis B medido y compile los datos sin procesar de cada escaneo B en un único archivo desde el número de fotograma más bajo al más alto y seleccione las columnas de datos, incluido el nombre de la pinza, la longitud y las columnas X centrales.
Asegúrese de que el centro X es el mismo para todos los escaneos B medidos para cada imagen OCT de volumen rectangular procesada y elimine los datos de las pinzas que no se utilizaron para registrar mediciones. Establezca la pinza situada en el centro de la cabeza del nervio óptico en cero y trace los datos de los conjuntos de datos X frente a varios Y para obtener una función de trazado 3D para el grosor de la capa nuclear externa o cualquier otra capa de retina medida. A continuación, compare las mediciones de la capa nuclear externa entre el control y los animales experimentales con las edades correspondientes para determinar la velocidad y uniformidad de cualquier posible degeneración de la retina.
Para el mapeo 3D de las mediciones de la retina, revise las imágenes de OCT posteriores a la inyección y observe cualquier punto de referencia identificable, luego coloque al animal para obtener una imagen de CT SDO de seguimiento de la misma región, teniendo cuidado de incluir los mismos puntos de referencia identificables, y procesar las imágenes grabadas como acaba de demostrar. Es muy importante obtener imágenes de OCT de alta calidad que incluyan puntos de referencia identificables para facilitar la reimaginación de las regiones retinantes previamente inyectadas. Con el fin de medir los cambios en la longitud del sistema operativo, se colocaron pinzas desde la membrana limitante externa a la membrana Brooks, lo que permite mediciones confiables ya que estas capas se identifican fácilmente en imágenes OCT.
Las diferencias en las mediciones entre estas capas de diferentes líneas de ratón se atribuyeron a longitudes de segmento exterior más cortas. Si la inyección subretiniana se realiza con éxito, la apertura del espacio subretinal induce la producción de un bleb que se puede visualizar claramente tanto en la vista en cara del imager HRSD OCT como en las imágenes de escaneo B. La superposición del mapa fronterizo del lugar de inyección permite la segmentación de las mediciones del tejido de la retina y los datasets de posición de la pinza para permitir pruebas estadísticas posteriores de los efectos de agentes terapéuticos específicos en la degeneración de la retina.
Una vez masterada, esta técnica se puede completar en diez minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento es importante recordar mantener el ambiente quirúrgico limpio y estéril. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia génica monitorearan todo el proceso de inyección quirúrgica subretiniana en tiempo real y crearon una manera de determinar inmediatamente el éxito quirúrgico in vivo.
Después de este procedimiento de inyección, se pueden realizar OCT y otros métodos como la electro-retinografía para responder preguntas adicionales sobre el rescate funcional transgén y / o toxicidad. Después de ver este video, usted debe tener una comprensión de cómo realizar inyecciones subretinales transesclerales y transcoroidales, cómo mapear la extensión de la inyección bleb en el OCT de esta imagen, y obtener mediciones rigurosas de las capas externas de la retina. No olvides que trabajar con vectores de terapia génica puede ser peligroso y que las precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, siempre deben usarse durante la realización de este procedimiento.
