この皮下注射手順の全体的な目標は、リアルタイムで観察可能な最小限の侵襲的で再現可能な方法で、ベクターをレチナに送達することです。こんにちは、この方法は、ベクター送達効果および治療剤毒性に関する遺伝子治療研究における主要な質問に答えるために使用することができる。この技術のいくつかの利点は、レティナおよび他の眼構造への損傷の最小限、正確な注射部位のマッピング、および固体統計的推論を可能にする厳密な定量的インビボ測定を含む。
眼内トランスジーン注射の場合、まず麻酔マウスを眼球イメージングシステム顕微鏡の観察段階に置き、鉗子を開いたり下に押しながら、無菌鈍い虹彩鉗子の先端を眼瞼の7時位置と10時位置に置いて優しくプロトシスを誘導する。鉗子を使用して眼球の下のまぶたを同化し、針の先端を角膜の縁の下に約1〜1.5ミリメートルに向けます。次に、無菌PBS溶液を目に塗布し、滅菌カバースリップで目を覆います。
強膜うつ病が生み出されるまで、結膜を通して針を慎重に眼に打ち込みます。マイクロマニピュレータを使用して、強膜のうつ病が焦点になるまで目を上に回転させ、針を前方に動かして針の先端でレナに鋭いピークを作り出します。針ホルダーを使用して、針の先端が白膜とRPEを通して穴が開くまで針を回し、針の先端の小麦粉を網膜下腔および網膜色素上皮細胞単層のすぐ近傍の網膜組織の下に見えるようにする。
針の先端を下方に駆動して地球に接するようにし、フットペダルスイッチで注入ポンプを作動させます。0.5~1マイクロリットルのトランスジーン溶液が皮下腔に送達された後、針を抜いて血液が安定しており、液体が注射路部位から漏れないことを確認します。注入の成功を確認するには、長方形のボリュームOCTを記録し、画像をさまざまな種類の潜在的な射出結果の画像と比較します。
適切な射出配置を確認した後、その長方形のOCT画像を使用して、ブレブの範囲を眼科画像にマッピングします。副レチンブの範囲をマッピングするには、眼内の認識可能なランドマークが画像に含まれるように、ブレブの矩形体積OCT画像を開きます。必要に応じて、Bスキャンの左右のエッジの位置、視神経ヘッド(存在する場合はONH)、網膜がRPEと脈絡膜から切り離され、データを保存する変曲点を特定するために、必要に応じて多くのキャリパーを追加します。
次に、保存されたファイルをコンパイルしてデータをプロットし、効果的にEN面OCT画像に注入ブレブのマップを作成します。射出部位を含む眼の画像にプロットされたデータをオーバーレイし、マージされた画像を保存します。このイメージを使用して、OCT のフォローアップイメージング中に対象領域を特定します。
射出後の逆変性を評価するには、記録された高解像度スペクトルドメインOCTまたはHRSD OCT矩形ボリューム画像を開き、測定するBスキャンを選択します。選択した画像が画面いっぱいになるまで拡大し、画像を右クリックします。キャリパーをクリックして適切な数のキャリパーを選択し、設定キャリパー機能を使用して角度ブロック列の垂直としてキャリパーを割り当て、表示キャリパーの位置をオンにして、レティナ全体で均一なキャリパーの配置を容易にします。
適用をクリックして、各キャリパーをBスキャン全体で0.1〜0.2ミリメートル離れた適切な場所に移動し、必要に応じて1つのキャリパーを視神経ヘッドの中央に配置するように注意してください。すべてのキャリパーが配置されたら、各キャリパーをクリックして対象領域の長さスパンまでドラッグし、Bスキャンの測定可能な領域を最大長にオーバーレイしないキャリパーを任意に設定します。核外層の厚さを測定するには、各キャリパーの上部を外部限定膜に、各キャリパーの底部を外側のプレキシフォーム層の底部に0.1~0.2ミリメートルずつ置きます。
すべてのキャリパーを配置してサイズに調整した後、画像を右クリックして[キャリパーデータを保存]をクリックし、10回目のBスキャンごとに示したように測定値を繰り返し、キャリパーをX軸上の同じ位置に保ち、必要に応じてキャリパーの長さをX方向に移動せずに調整します。すべてのスキャンが測定されたら、保存されたデータファイルを開き、変更された日付をクリックして、保存された時間に応じてファイルを配置します。各Bスキャンの測定対象ファイルをすべて開き、各Bスキャンの生データを1つのファイルにまとめて、キャリパー名、長さ、中央X列を含むデータの列を選択します。
各矩形ボリューム OCT イメージで測定された B スキャンの全てで、中央 X が同じであることを確認し、測定値の記録に使用されなかったキャリパーからデータを削除します。視神経ヘッドの中心にあるキャリパーをゼロに設定し、X 対複数の Y データ セットのデータをプロットして、外側の核層または他の測定されたレチナル層の厚さについて 3D プロット関数を得ます。次に、コントロールと実験動物の間の外側核層測定値を対応する年齢と比較して、潜在的な再発変性の速度と均一性を決定します。
3Dマッピングの場合、注入後のOCT画像を確認し、識別可能なランドマークをメモし、動物を同じ地域からフォローアップSDO CT画像を取得し、同じ識別可能なランドマークを含むように注意し、記録された画像を処理します。以前に注入されたレチン領域の再イメージングを容易にするために、識別可能なランドマークを含む高品質のOCT画像を取得することは非常に重要です。OSの長さの変化を測定するために、キャリパーは外部限定膜からブルックス膜に配置され、これらの層はOCT画像で容易に同定されるため、信頼性の高い測定が可能であった。
異なるマウスラインからのこれらの層間の測定値の違いは、より短い外側のセグメントの長さに起因していた。副レチンの注入が正常に行われた場合、副レチン空間の開口部は、HRSD OCTイメージャーのen面図とBスキャン画像の両方で明確に視覚化することができるブレブの産生を誘導する。注射部位の境界マップを重ね合わせることにより、レチナル組織測定とキャリパー位置データセットのセグメンテーションが可能になり、特定の治療薬が残性変性に及ぼす影響をその後の統計的検査が可能となる。
一度習得すると、この技術は、適切に実行すれば10分で完了することができます。この手順を試みている間、それは清潔で無菌の外科環境を維持するために覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、遺伝子治療の分野の研究者がリアルタイムで全ての副腎外科的注射プロセスを監視する道を開き、すぐに生体内での外科的成功を決定する方法を作成しました。
この注入手順に従って、OCTおよび電気レティノグラフィーのような他の方法は、トランスジーン機能救助および/または毒性に関する追加の質問に答えるために行うことができる。このビデオを見た後、トランスクレラルおよび経胸下皮注射を行う方法、この画像からOCTに射出ブレブの範囲をマッピングする方法、および外側の側胸層の厳密な測定を得る方法を理解する必要があります。遺伝子治療ベクターを使用することは危険であり、適切な個人用保護具を着用するなど、この手順を実行する際に常に使用する必要があることを忘れないでください。
