Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Whitehall. Nos gustaría agradecer a Samuel T. Kissinger por los valiosos comentarios.

1. Configuración del sistema <ol><li> Construir la unidad de control de presión. <ol><li> Monte la unidad de control de presión de acuerdo con el mapa de circuitos ( Figura 1 ). Soldar las piezas necesarias en la placa de circuito impreso (PCB) fabricada de acuerdo con los esquemas de circuitos eléctricos ( Figura 1b ). Utilice resistencias estándar, LED, Transistores de campo-Eficiencia de semiconductores de metal-óxido (MOSFET), condensadores y conectores (consulte la Tabla de materiales ). Solde las válvulas de solenoide en la PCB. Conecte la bomba de aire y el sensor de presión de aire a la PCB con un cable eléctrico. NOTA: La construcción de la unidad de control de presión debe tomar alrededor de 2 h con todas las piezas necesarias disponibles. </li></ol></li><li> Conecte la tarjeta de adquisición de datos secundarios (DAQ). <ol><li> Conecte las salidas de datos de la placa de circuito impreso a la tarjeta DAQ, siguiendo la Tabla 1 . NOTA: La tarjeta de DAQ wilL estar funcionando en &quot;Single-ended mode&quot;. El mapa de puertos se puede encontrar en el manual del usuario (ver la Tabla de Materiales ). </li><li> Conecte &quot;AIn Pr S&quot; a uno de los canales de entrada analógica (AI) y &quot;R-Gr&quot; a uno de los motivos analógicos en la placa DAQ secundaria. </li><li> Conecte la salida primaria del amplificador a uno de los canales AI y la tierra a la tierra analógica de la tarjeta DAQ secundaria. NOTA: Se puede utilizar un cable BNC estándar para conectar la salida primaria del amplificador. </li><li> Desmonte el otro extremo y conecte la señal positiva ( es decir, el núcleo de cobre) al canal AI y la tierra ( es decir, el cable delgado alrededor del núcleo) a la tierra analógica. Repita este paso para un segundo canal si se utiliza más de un canal de parche. NOTA: La entrada analógica de la tarjeta DAQ se configurará en pasos posteriores. </li><li> Conecte la alimentación a la salida de potencia de la tarjeta DAQ secundaria. Utilice una alimentación de 12 VPara la bomba. </li></ol></li><li> Conecte el tubo. <ol><li> Conectar la bomba de aire y las dos válvulas de acuerdo con la Tabla 2 . Utilice un conector de 3 vías para conectar el tubo blando desde el puerto superior de la válvula 2, el sensor de presión y el soporte de la pipeta en el último paso. </li><li> Añada otro conector de 3 vías al tubo conectado al soporte de la pipeta si se usan dos pipetas. Cambie manualmente entre las válvulas y las pipetas que se usan al aplicar parches. </li></ol></li><li> Instalar el Autopatcher IG. NOTA: Requisitos del sistema: Autopatcher IG sólo se probó en un PC con Windows 7. No se ha validado para otros sistemas operativos. El procedimiento descrito se aplica específicamente al hardware enumerado en la Tabla de Materiales. <ol><li> Descargue Autopatcher-IG desde GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Instale Python (consulte la Tabla de materiales para la versión y la dirección de descarga). </li><li> Desinstalar el PyQt4Biblioteca &quot;, escribiendo&quot; pip uninstall PyQt4 &quot;en un terminal de línea de comandos. NOTA: El sistema utiliza una versión anterior de la biblioteca PyQt4 para lograr la compatibilidad con las bibliotecas Qwt y Opencv. </li><li> Instale las bibliotecas de Python de los archivos históricos de la rueda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encuentre los archivos siguientes: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) y Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Para instalar los archivos de rueda, vaya al directorio donde se guardan los archivos y escriba &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sustituya &quot;*** wheelfilename ***&quot; con el nombre real del archivo. NOTA: &quot;cp27&quot; en el nombre de archivo de rueda indica Python 2.7 y &quot;win32&quot; indicó Windows de 32 bits. Si &quot;win32&quot; no funciona, pruebe &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Para controlar la cámara CCD, descargue e instale el instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). A continuación, descargue MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar la cámara en Python. </li><li> Para controlar los manipuladores y la etapa del microscopio, instale el software de control proporcionado por el fabricante. NOTA: Al hacer esto, también se instala el controlador necesario para controlar los manipuladores. El paquete de instalación se suministra normalmente en un CD-ROM. </li><li> Para controlar la placa DAQ secundaria, instale la biblioteca universal desde el CD-ROM, que se suministra con la compra de la tarjeta DAQ. </li></ol></li><li> Configure el hardware para Autopatcher IG. <ol><li> Conecte la etapa del microscopio y los controladores del manipulador a la computadora a través de los puertos USB. </li><li> Asigne números de puerto COM a la unidad 0: etapa del microscopio, unidad 1: manipulador izquierdo, y unidad 2: manipulador derecho, en este orden, en el archivo de configuración &quot;ports.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. LGuardan los otros parámetros en el archivo ports.csv ( es decir, &quot;SCI&quot; ​​y &quot;1&quot;) sin cambios. NOTA: La información del número de puerto COM se puede encontrar ejecutando el software de configuración del manipulador proporcionado por el fabricante. Vaya a la pestaña &quot;Configuración&quot;, seleccione &quot;Configuración&quot; y la página &quot;Movimiento&quot;, y lea las etiquetas de cada ficha en la parte superior. Alternativamente, esta información se puede encontrar en el Administrador de dispositivos de PC. </li><li> Asigne números de canal de entrada analógica en la tarjeta DAQ para un sensor de presión y los canales de parche 1 y 2 (correspondientes a la unidad 1 y 2). Introduzca el número de canal en el archivo &quot;DAQchannels.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. NOTA: Se recomienda abrir los archivos .csv con la aplicación Bloc de notas en lugar de una hoja de cálculo, ya que puede alterar la información al guardar los cambios. </li></ol></li><li> Ejecutar Autopatcher IG. <ol><li> Encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. EnsuQue el software del amplificador está funcionando. </li><li> Ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos de la siguiente manera: primero, cambie el directorio (comando &quot;cd&quot; para la mayoría de terminales comunes) donde está instalado Autopatcher IG, escriba &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; en el terminal de línea de comandos y pulse el botón &quot;Introducir clave. NOTA: No ejecute el software de control del manipulador antes de ejecutar Autopatcher IG porque ocupará la etapa del microscopio y el manipulador, haciendo que Autopatcher IG no pueda encontrar el hardware. El software de control del manipulador se puede ejecutar después de que Autopatcher IG se inicia completamente si hay módulos adicionales que se deben controlar ( por ejemplo, el calentador en línea). </li></ol></li><li> Calibre la pipeta primaria. <ol><li> Tire de las pipetas de parche como se describe anteriormente 9 . Llenar una pipeta de vidrio con solución interna y cargarla en la cabeza. NOTA: Las pipetas de vidrio vacías tienen diferentes contrastesEl microscopio y puede conducir a una calibración incorrecta. </li><li> Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y póngala en foco. Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores y / o la etapa del microscopio, actualice las coordenadas presionando &quot;z&quot; en el teclado. NOTA: Esta acción no es necesaria si el teclado (eje del microscopio: A / D - eje x, eje W / S - y, eje R / F - z, manipuladores: H / J - eje y, O / L - eje z, 1/2 - número de unidad) se utiliza para controlar el movimiento porque las coordenadas se actualizarán en tiempo real. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Iniciar calibración&quot; en la interfaz gráfica de usuario principal (GUI) para la unidad correspondiente en la que se carga la pipeta ( Figura 2 ). NOTA: Una ventana emergente aparecerá cuando finalice la calibración. NOTA: La calibración se llevará a cabo automáticamente, lo que tomará aproximadamente 3,5 min. Haciendo clic en el mismo botón (cambiado ahora a &quot;cancelar calibración&quot;Que inicia la calibración) abortará el intento de calibración. </li><li> Guarde la calibración haciendo clic en &quot;guardar calibración&quot; en la parte inferior de la GUI principal (guarda la calibración actual para ambos manipuladores y se puede cargar en el futuro). NOTA: El campo de visión con una ampliación baja (4 o 10X) y alta (40X) debe estar alineado para que la calibración secundaria funcione correctamente. Consulte el manual de usuario del sistema óptico en uso para los procedimientos de alineación. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento automático de la abrazadera del remiendo <ol><li> Preparar rebanadas cerebrales agudas, como se describió anteriormente 10 . </li><li> Prepare pipetas de vidrio para la abrazadera de parche. </li><li> Coloque una rebanada de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada con una rebanada de sujeción, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Detectar la célula fluorescente. <ol><li> Encuentre el área de interés debajo de la lente 4X. Mueva la etapa del microscopio encendiendo cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado para mover la platina del microscopio (A / D - eje x, W / S - eje y, R / F - eje z). </li><li> Cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje z, usando R / F en el teclado. NOTA: Se recomienda ajustar el nivel del baño de agua para que el plano focal bajo las lentes de aumento alto y alto sea igual o similar en el eje z. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Detectar celda&quot; en la columna GUI principal, &quot;Unidad 0.&quot; Si el LED o la fuente de luz láser de la configuración no pueden ser controlados por la señal TTL, encienda manualmente el LED / láser; Aparecerá una ventana emergente cuando se complete la detección de celdas. <ol><li> Apague el LED / láser si es necesario; Aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI &quot;Posiciones de memoria&quot;. Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón &quot;X&quot; junto a las coordenadas. </li><li>Alternativamente, si las células objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en &quot;Modo ratón&quot; en la GUI principal. Haga clic en la celda de interés; Aparecerá un punto amarillo con un número en la celda y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI de &quot;Memory positions&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrar la pipeta secundaria. <ol><li> Llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. Cargue la pipeta en el soporte de la pipeta unido a la cabeza. </li><li> Utilice la lente de baja ampliación. Coloque la pipeta en el campo visual y ajuste el enfoque utilizando el teclado (H / K - eje x, U / J - eje y, eje O / L - z). Utilice &quot;1&quot; y &quot;2&quot; para cambiar entre la unidad 1 y la unidad 2. </li><li> Cargue la calibración primaria haciendo clic en &quot;Cargar calibración&quot;. Haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; en la GUI principal debajo de la unidad que está en uso. Por ejemplo, si la unidad 2 está en uso, haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; de laColumna Siga las instrucciones de la ventana emergente para cambiar a la lente de gran aumento. </li></ol></li><li> Parche una célula objetivo. <ol><li> Asegúrese de que el software &quot;MultiClamp&quot; ( es decir, amplificador) esté funcionando. Haga clic en el botón &quot;Patch control&quot; para abrir la GUI del &quot;Patch Control&quot;; Puede tardar hasta unos minutos en abrir esta GUI. </li><li> Utilice la lente de ampliación 40X marcando &quot;40X&quot; en la columna GUI principal &quot;Unidad 0&quot;. Haga clic en el botón &quot;ir a&quot; situado junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI &quot;Memory position&quot; (posición de memoria); El microscopio se moverá a la célula. </li><li> Haga clic en el botón CTM de la unidad en uso en la GUI principal para activar el movimiento con un clic del ratón. Haga clic en la celda de interés; La punta de la pipeta se moverá a la celda. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Parche&quot; en la GUI &quot;Control de parches&quot;. NOTA: Se iniciará el parcheo automático y se podrá controlar la presión y la resistencia enEl &quot;Control de parches&quot; GUI. <ol><li> Utilice el botón &quot;Unidad 1 seleccionada&quot; para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades. NOTA: El sistema se aproximará a la célula objetivo, aplicará presión negativa, ajustará el potencial de la membrana celular y detectará la formación de la gigasa basándose en una serie de umbrales de presión y resistencia y lógica. </li><li> Manipule el proceso automático en cualquier punto haciendo clic en los respectivos botones de la interfaz gráfica de &quot;Control de parches&quot;. Por ejemplo, haga clic en el botón &quot;Parche&quot; de nuevo para cancelar la prueba de parches y haga clic en &quot;Próxima etapa&quot; para avanzar el proceso de parcheado al siguiente paso, independientemente del umbral. NOTA: Una ventana emergente notificará al usuario cuando se haya formado un gigaseal, y se presentará la opción de aplicar zap junto con una presión negativa grande. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;Sí&quot; para romper con zap combinado y succión. Alternativamente, seleccione &quot;No&quot; para romper con succión solamente. <br/&gt; NOTA: Cuando se haya completado un patch de celda completa con éxito, una ventana emergente le recordará al usuario que guarde el registro de parches del experimento. </li><li> Guarde el registro de revisiones del experimento. NOTA: Si una prueba de parche no tiene éxito, una ventana emergente notificará al usuario y se reiniciará el proceso de revisión. </li><li> Vuelva al paso 2.4 y repita los pasos con una celda diferente. </li></ol></li><li> Refinar los umbrales de parcheo (opcional). NOTA: Umbrales para el rango inicial de resistencia de la pipeta, presión positiva y negativa, resistencia gigasca, etc. Se puede modificar desde un archivo de configuración. <ol><li> Abra el archivo &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; en la carpeta &quot;Configuración&quot; en el destino donde está instalado el sistema. Cambie los números correspondientes a cada valor de umbral. No cambie los nombres de los valores; Esto resultará en entradas irreconocibles en el sistema. </li><li> Implemente los nuevos valores de umbral presionando &quot;CtRl + L &quot;sin reiniciar el programa, al reiniciar el programa se implementará el valor de umbral más reciente del archivo. </li></ol></li></ol> 3. Realización de grabaciones NOTA: El modo en el amplificador de microelectrodo controlado por computadora se ajustará automáticamente a Clamp de corriente (&quot;IC&quot;) por el software de autopatcher una vez que se ha logrado un parche exitoso. Las grabaciones de parches de parches de células enteras se pueden hacer usando el software de grabación de elección (este sistema no incluye una función de grabación). Si se identificaron varias células diana, después de terminar una grabación, vuelva al paso 2.4 y pruebe otra célula. <ol><li> Realizar experimentos automáticos de aplicación de fármacos locales usando un picospritzer (opcional). NOTA: Aquí se usa un experimento de aplicación de fármaco local como un ejemplo para describir cómo usar la función adicional de &quot;Secuencia de Comando&quot; para controlar hardware externo a través de señales TTL. <ol><li> Puerto de conexión A chaNnel 0 y la tierra de la placa DAQ secundaria a la entrada de disparo de inicio en el digitalizador utilizando un cable BNC desnudo (como se describe en el paso 1.2.3). Conecte un canal de salida digital en el digitalizador al gatillo externo del picospritzer. </li><li> Prepare el picospritzer de acuerdo con el manual del usuario. Conecte la salida de aire del picospritzer al soporte de la pipeta del droga-soplo unido a un micromanipulator. </li><li> Cargue una pipeta llena con un medicamento de su elección. Sujételo al soporte de la pipeta. Calibre la pipeta, como se describe en el paso 1.7. </li><li> Después de remendar una celda como se describe en el paso 2.6, seleccione un lugar deseado para la entrega de fármacos haciendo clic con el ratón en la GUI de vista de cámara en &quot;modo de ratón&quot; (cambiado desde la GUI principal). Como alternativa, utilice la GUI &quot;Grid&quot; para diseñar una cuadrícula, con cada píxel en la cuadrícula como una de las ubicaciones de destino. NOTA: La cuadrícula se puede manipular en la GUI de la vista de la cámara arrastrándola con el ratón. </li><li> En el comando &quot;Sequ, Seleccione la unidad manipuladora en la que está montada la pipeta de medicamento Haga clic en &quot;cargar puntos de ratón&quot; o &quot;cargar puntos de cuadrícula&quot; para importar todas las coordenadas para la entrega de fármacos. <ol><li> Haga clic en cada entrada de coordenadas para editar la señal TTL de comando específico en la columna derecha. En la primera entrada de comando, haga clic en el dígito más a la derecha para pasar de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, enviando una señal TTL +5-V. Ajuste el tiempo (T) a la duración deseada de la señal TTL, en ms. </li><li> En la segunda entrada de comando, ajuste todos los dígitos a &quot;0&quot; y ajuste T a la duración de la duración de grabación de la prueba. Editar comandos para todas las entradas de coordenadas. Agregue entradas de comando haciendo clic en &quot;+&quot; si son necesarias varias señales TTL. NOTA: Los bits de 8 dígitos representan los canales A del canal A 0-7 en el DAQ secundario (los puertos 1 - 3 son ocupados por la bomba y dos válvulas) si es necesario. </li></ol></li><li> Crear un protocolo de grabación en el módulo de adquisición deQue el inicio de un barrido es activado por el disparador de inicio externo. Edite el protocolo para entregar el medicamento en el momento deseado. </li><li> En la GUI &quot;Command Sequence&quot;, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la izquierda para ejecutar todas las coordenadas. Alternativamente, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la derecha para ejecutar sólo la secuencia seleccionada. NOTA: La pipeta se moverá a cada coordenada y ejecutará la señal TTL como se define para iniciar el barrido de grabación. </li></ol></li></ol>

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Una solicitud de patente no provisional &quot;SISTEMAS Y MÉTODOS PARA ELECTROFISIOLOGÍA PATCH-CLAMP AUTOMATIZADA GUÍA DE IMAGEN EN VITRO&quot;, US Nº de Serie: 15 / 353,719, fue presentada el 16 de noviembre de 2016, Ref. No .: PRF 67270-02.

En este caso, se describe un método para grabar autoadhesivo guiado por imágenes autoadhesivas in vitro . Los pasos clave en este proceso se resumen de la siguiente manera. En primer lugar, la visión por ordenador se utiliza para reconocer automáticamente la punta de la pipeta utilizando una serie de imágenes adquiridas a través de un microscopio. Esta información se utiliza entonces para calcular la función de transformación de coordenadas entre el microscopio y los sistemas de coordenadas del manipul...

La técnica de la abrazadera del remiendo fue desarrollada por primera vez por Neher y Sakmann en los años 70 para estudiar los canales iónicos de las membranas excitables 1 . Desde entonces, el pinzamiento de parches ha sido aplicado al estudio de muchos sujetos diferentes a nivel celular, sináptico y de circuito tanto in vitro como in vivo en muchos tipos de células diferentes, incluyendo neuronas, cardiomiocitos, ovocitos de Xenopus y liposomas artificiales 2 . Este proceso implica la identificación correcta y el direccionamiento de una célula de interés, un control intrincado del micromanipulador para mover la pipeta de parche en proximidad cercana a la célula, la aplicación de presión positiva y negativa a la pipeta en el momento apropiado para establecer un parche estrecho gigaseal, Y una ruptura para establecer una configuración de parches de célula completa. La fijación del parche se realiza típicamente manualmente y requiere un entrenamiento extensivo para dominar. Incluso para un investigador experimentado con el parcheClamp, la tasa de éxito es relativamente baja. Más recientemente, se han hecho varios intentos para automatizar experimentos de parche-abrazadera. Dos estrategias principales han evolucionado para lograr la automatización: aumentar el equipo estándar de la abrazadera del remiendo para proporcionar el control automático del proceso de remiendo y el diseño de nuevo equipo y de técnicas de la tierra para arriba. La estrategia anterior es adaptable al hardware existente y puede utilizarse en una variedad de aplicaciones de abrazadera de parche, incluyendo abrazadera de parche ciego in vivo 3 , 4 , 5 , clamp de parche in vitro de cortes de cerebro agudo, cultivos de corte organotípico y neuronas disociadas cultivadas 6 . Permite la interrogación de circuitos locales complejos utilizando simultáneamente múltiples micromanipuladores 7 . El método de parche planar es un ejemplo de la nueva estrategia de desarrollo, que puede lograr el rendimiento simultáneo p de alto rendimientoAtch clamp de células en suspensión para fines de cribado de drogas 8 . Sin embargo, el método de parche plano no es aplicable a todos los tipos de células, particularmente neuronas con procesos largos o circuitos intactos que contienen conexiones extensas. Esto limita su aplicación a la cartografía de los intrincados circuitos del sistema nervioso, que es una ventaja clave de la tecnología de pinza de parche tradicional. Hemos desarrollado un sistema que automatiza el proceso manual de la abrazadera del remiendo in vitro aumentando el hardware estándar de la abrazadera del remiendo. Nuestro sistema, Autopatcher IG, proporciona la calibración automática de la pipeta, la identificación de la blanco de la célula fluorescente, el control automático del movimiento de la pipeta, remiendo automático de la célula entera, y registro de datos. El sistema puede adquirir automáticamente múltiples imágenes de rodajas de cerebro a diferentes profundidades; Analizarlos utilizando la visión por computadora; Y extraer información, incluyendo las coordenadas de las células marcadas fluorescentemente. Esta información puede serUsado para apuntar y automáticamente parche las células de interés. El software está escrito en Python -un lenguaje de programación libre y de código abierto- que utiliza varias bibliotecas de código abierto. Esto asegura su accesibilidad a otros investigadores y mejora la reproducibilidad y el rigor de los experimentos de electrofisiología. El sistema tiene un diseño modular, de modo que el hardware adicional puede ser fácilmente interconectado con el sistema actual demostrado aquí.

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

La abrazadera del remiendo de la célula entera es el método gold-standard para medir las características eléctricas de células individuales. Sin embargo, la abrazadera de parche in vitro sigue siendo una técnica desafiante y de bajo rendimiento debido a su complejidad y alta dependencia en el funcionamiento y control del usuario. Este manuscrito demuestra un sistema de abrazadera de parche automático guiado por imágenes para experimentos in vitro de clamp de parche de células enteras en cortes cerebrales agudos. Nuestro sistema implementa un algoritmo basado en la visión por computadora para detectar células marcadas fluorescentemente y para dirigirlas para un parche totalmente automático usando un micromanipulador y un control interno de la presión de la pipeta. Todo el proceso es altamente automatizado, con requisitos mínimos para la intervención humana. La información experimental en tiempo real, incluida la resistencia eléctrica y la presión interna de la pipeta, se documentan electrónicamente para análisis futuros y para la optimización a diferentes tipos de células. Aunque nuestro sistema se describe en el contexto de agudos braiN, también se puede aplicar a la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada de neuronas disociadas, cultivos de corte organotípico y otros tipos de células no neuronales.

<html> Nuestro sistema ha sido probado en su capacidad de parche de células en los cortes de cerebro agudo, inducida por el ratón Pluripotent Stem Cells (iPSCs) diferenciadas en neuronas, y células HEK 293 que expresan artificialmente los canales de interés. La Figura 3 muestra un experimento utilizando ratones transgénicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) dirigidos a neuronas piramidales de capa 5 marcadas fluorescentemente en la c...

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro .

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K vistas.  Purdue University.  Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro . 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Investigación

Neurociencias

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Establecimiento de una configuración de pinza de voltaje de celda completa para registros electrofisiológicos en cortes de cerebro

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

Técnica automatizada de pinza de parche guiada por imágenes para estudiar las neuronas en cortes de cerebro

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.