Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación Whitehall. Nos gustaría agradecer a Samuel T. Kissinger por los valiosos comentarios.

1. Configuración del sistema <ol><li> Construir la unidad de control de presión. <ol><li> Monte la unidad de control de presión de acuerdo con el mapa de circuitos ( Figura 1 ). Soldar las piezas necesarias en la placa de circuito impreso (PCB) fabricada de acuerdo con los esquemas de circuitos eléctricos ( Figura 1b ). Utilice resistencias estándar, LED, Transistores de campo-Eficiencia de semiconductores de metal-óxido (MOSFET), condensadores y conectores (consulte la Tabla de materiales ). Solde las válvulas de solenoide en la PCB. Conecte la bomba de aire y el sensor de presión de aire a la PCB con un cable eléctrico. NOTA: La construcción de la unidad de control de presión debe tomar alrededor de 2 h con todas las piezas necesarias disponibles. </li></ol></li><li> Conecte la tarjeta de adquisición de datos secundarios (DAQ). <ol><li> Conecte las salidas de datos de la placa de circuito impreso a la tarjeta DAQ, siguiendo la Tabla 1 . NOTA: La tarjeta de DAQ wilL estar funcionando en &quot;Single-ended mode&quot;. El mapa de puertos se puede encontrar en el manual del usuario (ver la Tabla de Materiales ). </li><li> Conecte &quot;AIn Pr S&quot; a uno de los canales de entrada analógica (AI) y &quot;R-Gr&quot; a uno de los motivos analógicos en la placa DAQ secundaria. </li><li> Conecte la salida primaria del amplificador a uno de los canales AI y la tierra a la tierra analógica de la tarjeta DAQ secundaria. NOTA: Se puede utilizar un cable BNC estándar para conectar la salida primaria del amplificador. </li><li> Desmonte el otro extremo y conecte la señal positiva ( es decir, el núcleo de cobre) al canal AI y la tierra ( es decir, el cable delgado alrededor del núcleo) a la tierra analógica. Repita este paso para un segundo canal si se utiliza más de un canal de parche. NOTA: La entrada analógica de la tarjeta DAQ se configurará en pasos posteriores. </li><li> Conecte la alimentación a la salida de potencia de la tarjeta DAQ secundaria. Utilice una alimentación de 12 VPara la bomba. </li></ol></li><li> Conecte el tubo. <ol><li> Conectar la bomba de aire y las dos válvulas de acuerdo con la Tabla 2 . Utilice un conector de 3 vías para conectar el tubo blando desde el puerto superior de la válvula 2, el sensor de presión y el soporte de la pipeta en el último paso. </li><li> Añada otro conector de 3 vías al tubo conectado al soporte de la pipeta si se usan dos pipetas. Cambie manualmente entre las válvulas y las pipetas que se usan al aplicar parches. </li></ol></li><li> Instalar el Autopatcher IG. NOTA: Requisitos del sistema: Autopatcher IG sólo se probó en un PC con Windows 7. No se ha validado para otros sistemas operativos. El procedimiento descrito se aplica específicamente al hardware enumerado en la Tabla de Materiales. <ol><li> Descargue Autopatcher-IG desde GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Instale Python (consulte la Tabla de materiales para la versión y la dirección de descarga). </li><li> Desinstalar el PyQt4Biblioteca &quot;, escribiendo&quot; pip uninstall PyQt4 &quot;en un terminal de línea de comandos. NOTA: El sistema utiliza una versión anterior de la biblioteca PyQt4 para lograr la compatibilidad con las bibliotecas Qwt y Opencv. </li><li> Instale las bibliotecas de Python de los archivos históricos de la rueda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encuentre los archivos siguientes: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) y Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Para instalar los archivos de rueda, vaya al directorio donde se guardan los archivos y escriba &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sustituya &quot;*** wheelfilename ***&quot; con el nombre real del archivo. NOTA: &quot;cp27&quot; en el nombre de archivo de rueda indica Python 2.7 y &quot;win32&quot; indicó Windows de 32 bits. Si &quot;win32&quot; no funciona, pruebe &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Para controlar la cámara CCD, descargue e instale el instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). A continuación, descargue MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar la cámara en Python. </li><li> Para controlar los manipuladores y la etapa del microscopio, instale el software de control proporcionado por el fabricante. NOTA: Al hacer esto, también se instala el controlador necesario para controlar los manipuladores. El paquete de instalación se suministra normalmente en un CD-ROM. </li><li> Para controlar la placa DAQ secundaria, instale la biblioteca universal desde el CD-ROM, que se suministra con la compra de la tarjeta DAQ. </li></ol></li><li> Configure el hardware para Autopatcher IG. <ol><li> Conecte la etapa del microscopio y los controladores del manipulador a la computadora a través de los puertos USB. </li><li> Asigne números de puerto COM a la unidad 0: etapa del microscopio, unidad 1: manipulador izquierdo, y unidad 2: manipulador derecho, en este orden, en el archivo de configuración &quot;ports.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. LGuardan los otros parámetros en el archivo ports.csv ( es decir, &quot;SCI&quot; ​​y &quot;1&quot;) sin cambios. NOTA: La información del número de puerto COM se puede encontrar ejecutando el software de configuración del manipulador proporcionado por el fabricante. Vaya a la pestaña &quot;Configuración&quot;, seleccione &quot;Configuración&quot; y la página &quot;Movimiento&quot;, y lea las etiquetas de cada ficha en la parte superior. Alternativamente, esta información se puede encontrar en el Administrador de dispositivos de PC. </li><li> Asigne números de canal de entrada analógica en la tarjeta DAQ para un sensor de presión y los canales de parche 1 y 2 (correspondientes a la unidad 1 y 2). Introduzca el número de canal en el archivo &quot;DAQchannels.csv&quot; en la carpeta &quot;configuration&quot;. NOTA: Se recomienda abrir los archivos .csv con la aplicación Bloc de notas en lugar de una hoja de cálculo, ya que puede alterar la información al guardar los cambios. </li></ol></li><li> Ejecutar Autopatcher IG. <ol><li> Encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. EnsuQue el software del amplificador está funcionando. </li><li> Ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos de la siguiente manera: primero, cambie el directorio (comando &quot;cd&quot; para la mayoría de terminales comunes) donde está instalado Autopatcher IG, escriba &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; en el terminal de línea de comandos y pulse el botón &quot;Introducir clave. NOTA: No ejecute el software de control del manipulador antes de ejecutar Autopatcher IG porque ocupará la etapa del microscopio y el manipulador, haciendo que Autopatcher IG no pueda encontrar el hardware. El software de control del manipulador se puede ejecutar después de que Autopatcher IG se inicia completamente si hay módulos adicionales que se deben controlar ( por ejemplo, el calentador en línea). </li></ol></li><li> Calibre la pipeta primaria. <ol><li> Tire de las pipetas de parche como se describe anteriormente 9 . Llenar una pipeta de vidrio con solución interna y cargarla en la cabeza. NOTA: Las pipetas de vidrio vacías tienen diferentes contrastesEl microscopio y puede conducir a una calibración incorrecta. </li><li> Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y póngala en foco. Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores y / o la etapa del microscopio, actualice las coordenadas presionando &quot;z&quot; en el teclado. NOTA: Esta acción no es necesaria si el teclado (eje del microscopio: A / D - eje x, eje W / S - y, eje R / F - z, manipuladores: H / J - eje y, O / L - eje z, 1/2 - número de unidad) se utiliza para controlar el movimiento porque las coordenadas se actualizarán en tiempo real. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Iniciar calibración&quot; en la interfaz gráfica de usuario principal (GUI) para la unidad correspondiente en la que se carga la pipeta ( Figura 2 ). NOTA: Una ventana emergente aparecerá cuando finalice la calibración. NOTA: La calibración se llevará a cabo automáticamente, lo que tomará aproximadamente 3,5 min. Haciendo clic en el mismo botón (cambiado ahora a &quot;cancelar calibración&quot;Que inicia la calibración) abortará el intento de calibración. </li><li> Guarde la calibración haciendo clic en &quot;guardar calibración&quot; en la parte inferior de la GUI principal (guarda la calibración actual para ambos manipuladores y se puede cargar en el futuro). NOTA: El campo de visión con una ampliación baja (4 o 10X) y alta (40X) debe estar alineado para que la calibración secundaria funcione correctamente. Consulte el manual de usuario del sistema óptico en uso para los procedimientos de alineación. </li></ol></li></ol> 2. Procedimiento automático de la abrazadera del remiendo <ol><li> Preparar rebanadas cerebrales agudas, como se describió anteriormente 10 . </li><li> Prepare pipetas de vidrio para la abrazadera de parche. </li><li> Coloque una rebanada de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada con una rebanada de sujeción, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Detectar la célula fluorescente. <ol><li> Encuentre el área de interés debajo de la lente 4X. Mueva la etapa del microscopio encendiendo cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) y haga clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado para mover la platina del microscopio (A / D - eje x, W / S - eje y, R / F - eje z). </li><li> Cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje z, usando R / F en el teclado. NOTA: Se recomienda ajustar el nivel del baño de agua para que el plano focal bajo las lentes de aumento alto y alto sea igual o similar en el eje z. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Detectar celda&quot; en la columna GUI principal, &quot;Unidad 0.&quot; Si el LED o la fuente de luz láser de la configuración no pueden ser controlados por la señal TTL, encienda manualmente el LED / láser; Aparecerá una ventana emergente cuando se complete la detección de celdas. <ol><li> Apague el LED / láser si es necesario; Aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI &quot;Posiciones de memoria&quot;. Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón &quot;X&quot; junto a las coordenadas. </li><li>Alternativamente, si las células objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en &quot;Modo ratón&quot; en la GUI principal. Haga clic en la celda de interés; Aparecerá un punto amarillo con un número en la celda y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI de &quot;Memory positions&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrar la pipeta secundaria. <ol><li> Llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. Cargue la pipeta en el soporte de la pipeta unido a la cabeza. </li><li> Utilice la lente de baja ampliación. Coloque la pipeta en el campo visual y ajuste el enfoque utilizando el teclado (H / K - eje x, U / J - eje y, eje O / L - z). Utilice &quot;1&quot; y &quot;2&quot; para cambiar entre la unidad 1 y la unidad 2. </li><li> Cargue la calibración primaria haciendo clic en &quot;Cargar calibración&quot;. Haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; en la GUI principal debajo de la unidad que está en uso. Por ejemplo, si la unidad 2 está en uso, haga clic en el botón &quot;Calibración secundaria&quot; de laColumna Siga las instrucciones de la ventana emergente para cambiar a la lente de gran aumento. </li></ol></li><li> Parche una célula objetivo. <ol><li> Asegúrese de que el software &quot;MultiClamp&quot; ( es decir, amplificador) esté funcionando. Haga clic en el botón &quot;Patch control&quot; para abrir la GUI del &quot;Patch Control&quot;; Puede tardar hasta unos minutos en abrir esta GUI. </li><li> Utilice la lente de ampliación 40X marcando &quot;40X&quot; en la columna GUI principal &quot;Unidad 0&quot;. Haga clic en el botón &quot;ir a&quot; situado junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI &quot;Memory position&quot; (posición de memoria); El microscopio se moverá a la célula. </li><li> Haga clic en el botón CTM de la unidad en uso en la GUI principal para activar el movimiento con un clic del ratón. Haga clic en la celda de interés; La punta de la pipeta se moverá a la celda. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Parche&quot; en la GUI &quot;Control de parches&quot;. NOTA: Se iniciará el parcheo automático y se podrá controlar la presión y la resistencia enEl &quot;Control de parches&quot; GUI. <ol><li> Utilice el botón &quot;Unidad 1 seleccionada&quot; para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades. NOTA: El sistema se aproximará a la célula objetivo, aplicará presión negativa, ajustará el potencial de la membrana celular y detectará la formación de la gigasa basándose en una serie de umbrales de presión y resistencia y lógica. </li><li> Manipule el proceso automático en cualquier punto haciendo clic en los respectivos botones de la interfaz gráfica de &quot;Control de parches&quot;. Por ejemplo, haga clic en el botón &quot;Parche&quot; de nuevo para cancelar la prueba de parches y haga clic en &quot;Próxima etapa&quot; para avanzar el proceso de parcheado al siguiente paso, independientemente del umbral. NOTA: Una ventana emergente notificará al usuario cuando se haya formado un gigaseal, y se presentará la opción de aplicar zap junto con una presión negativa grande. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;Sí&quot; para romper con zap combinado y succión. Alternativamente, seleccione &quot;No&quot; para romper con succión solamente. <br/&gt; NOTA: Cuando se haya completado un patch de celda completa con éxito, una ventana emergente le recordará al usuario que guarde el registro de parches del experimento. </li><li> Guarde el registro de revisiones del experimento. NOTA: Si una prueba de parche no tiene éxito, una ventana emergente notificará al usuario y se reiniciará el proceso de revisión. </li><li> Vuelva al paso 2.4 y repita los pasos con una celda diferente. </li></ol></li><li> Refinar los umbrales de parcheo (opcional). NOTA: Umbrales para el rango inicial de resistencia de la pipeta, presión positiva y negativa, resistencia gigasca, etc. Se puede modificar desde un archivo de configuración. <ol><li> Abra el archivo &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; en la carpeta &quot;Configuración&quot; en el destino donde está instalado el sistema. Cambie los números correspondientes a cada valor de umbral. No cambie los nombres de los valores; Esto resultará en entradas irreconocibles en el sistema. </li><li> Implemente los nuevos valores de umbral presionando &quot;CtRl + L &quot;sin reiniciar el programa, al reiniciar el programa se implementará el valor de umbral más reciente del archivo. </li></ol></li></ol> 3. Realización de grabaciones NOTA: El modo en el amplificador de microelectrodo controlado por computadora se ajustará automáticamente a Clamp de corriente (&quot;IC&quot;) por el software de autopatcher una vez que se ha logrado un parche exitoso. Las grabaciones de parches de parches de células enteras se pueden hacer usando el software de grabación de elección (este sistema no incluye una función de grabación). Si se identificaron varias células diana, después de terminar una grabación, vuelva al paso 2.4 y pruebe otra célula. <ol><li> Realizar experimentos automáticos de aplicación de fármacos locales usando un picospritzer (opcional). NOTA: Aquí se usa un experimento de aplicación de fármaco local como un ejemplo para describir cómo usar la función adicional de &quot;Secuencia de Comando&quot; para controlar hardware externo a través de señales TTL. <ol><li> Puerto de conexión A chaNnel 0 y la tierra de la placa DAQ secundaria a la entrada de disparo de inicio en el digitalizador utilizando un cable BNC desnudo (como se describe en el paso 1.2.3). Conecte un canal de salida digital en el digitalizador al gatillo externo del picospritzer. </li><li> Prepare el picospritzer de acuerdo con el manual del usuario. Conecte la salida de aire del picospritzer al soporte de la pipeta del droga-soplo unido a un micromanipulator. </li><li> Cargue una pipeta llena con un medicamento de su elección. Sujételo al soporte de la pipeta. Calibre la pipeta, como se describe en el paso 1.7. </li><li> Después de remendar una celda como se describe en el paso 2.6, seleccione un lugar deseado para la entrega de fármacos haciendo clic con el ratón en la GUI de vista de cámara en &quot;modo de ratón&quot; (cambiado desde la GUI principal). Como alternativa, utilice la GUI &quot;Grid&quot; para diseñar una cuadrícula, con cada píxel en la cuadrícula como una de las ubicaciones de destino. NOTA: La cuadrícula se puede manipular en la GUI de la vista de la cámara arrastrándola con el ratón. </li><li> En el comando &quot;Sequ, Seleccione la unidad manipuladora en la que está montada la pipeta de medicamento Haga clic en &quot;cargar puntos de ratón&quot; o &quot;cargar puntos de cuadrícula&quot; para importar todas las coordenadas para la entrega de fármacos. <ol><li> Haga clic en cada entrada de coordenadas para editar la señal TTL de comando específico en la columna derecha. En la primera entrada de comando, haga clic en el dígito más a la derecha para pasar de &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, enviando una señal TTL +5-V. Ajuste el tiempo (T) a la duración deseada de la señal TTL, en ms. </li><li> En la segunda entrada de comando, ajuste todos los dígitos a &quot;0&quot; y ajuste T a la duración de la duración de grabación de la prueba. Editar comandos para todas las entradas de coordenadas. Agregue entradas de comando haciendo clic en &quot;+&quot; si son necesarias varias señales TTL. NOTA: Los bits de 8 dígitos representan los canales A del canal A 0-7 en el DAQ secundario (los puertos 1 - 3 son ocupados por la bomba y dos válvulas) si es necesario. </li></ol></li><li> Crear un protocolo de grabación en el módulo de adquisición deQue el inicio de un barrido es activado por el disparador de inicio externo. Edite el protocolo para entregar el medicamento en el momento deseado. </li><li> En la GUI &quot;Command Sequence&quot;, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la izquierda para ejecutar todas las coordenadas. Alternativamente, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; a la derecha para ejecutar sólo la secuencia seleccionada. NOTA: La pipeta se moverá a cada coordenada y ejecutará la señal TTL como se define para iniciar el barrido de grabación. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Una solicitud de patente no provisional &quot;SISTEMAS Y MÉTODOS PARA ELECTROFISIOLOGÍA PATCH-CLAMP AUTOMATIZADA GUÍA DE IMAGEN EN VITRO&quot;, US Nº de Serie: 15 / 353,719, fue presentada el 16 de noviembre de 2016, Ref. No .: PRF 67270-02.

En este caso, se describe un método para grabar autoadhesivo guiado por imágenes autoadhesivas in vitro . Los pasos clave en este proceso se resumen de la siguiente manera. En primer lugar, la visión por ordenador se utiliza para reconocer automáticamente la punta de la pipeta utilizando una serie de imágenes adquiridas a través de un microscopio. Esta información se utiliza entonces para calcular la función de transformación de coordenadas entre el microscopio y los sistemas de coordenadas del manipul...

La técnica de la abrazadera del remiendo fue desarrollada por primera vez por Neher y Sakmann en los años 70 para estudiar los canales iónicos de las membranas excitables 1 . Desde entonces, el pinzamiento de parches ha sido aplicado al estudio de muchos sujetos diferentes a nivel celular, sináptico y de circuito tanto in vitro como in vivo en muchos tipos de células diferentes, incluyendo neuronas, cardiomiocitos, ovocitos de Xenopus y liposomas artificiales 2 . Este proceso implica la identificación correcta y el direccionamiento de una célula de interés, un control intrincado del micromanipulador para mover la pipeta de parche en proximidad cercana a la célula, la aplicación de presión positiva y negativa a la pipeta en el momento apropiado para establecer un parche estrecho gigaseal, Y una ruptura para establecer una configuración de parches de célula completa. La fijación del parche se realiza típicamente manualmente y requiere un entrenamiento extensivo para dominar. Incluso para un investigador experimentado con el parcheClamp, la tasa de éxito es relativamente baja. Más recientemente, se han hecho varios intentos para automatizar experimentos de parche-abrazadera. Dos estrategias principales han evolucionado para lograr la automatización: aumentar el equipo estándar de la abrazadera del remiendo para proporcionar el control automático del proceso de remiendo y el diseño de nuevo equipo y de técnicas de la tierra para arriba. La estrategia anterior es adaptable al hardware existente y puede utilizarse en una variedad de aplicaciones de abrazadera de parche, incluyendo abrazadera de parche ciego in vivo 3 , 4 , 5 , clamp de parche in vitro de cortes de cerebro agudo, cultivos de corte organotípico y neuronas disociadas cultivadas 6 . Permite la interrogación de circuitos locales complejos utilizando simultáneamente múltiples micromanipuladores 7 . El método de parche planar es un ejemplo de la nueva estrategia de desarrollo, que puede lograr el rendimiento simultáneo p de alto rendimientoAtch clamp de células en suspensión para fines de cribado de drogas 8 . Sin embargo, el método de parche plano no es aplicable a todos los tipos de células, particularmente neuronas con procesos largos o circuitos intactos que contienen conexiones extensas. Esto limita su aplicación a la cartografía de los intrincados circuitos del sistema nervioso, que es una ventaja clave de la tecnología de pinza de parche tradicional. Hemos desarrollado un sistema que automatiza el proceso manual de la abrazadera del remiendo in vitro aumentando el hardware estándar de la abrazadera del remiendo. Nuestro sistema, Autopatcher IG, proporciona la calibración automática de la pipeta, la identificación de la blanco de la célula fluorescente, el control automático del movimiento de la pipeta, remiendo automático de la célula entera, y registro de datos. El sistema puede adquirir automáticamente múltiples imágenes de rodajas de cerebro a diferentes profundidades; Analizarlos utilizando la visión por computadora; Y extraer información, incluyendo las coordenadas de las células marcadas fluorescentemente. Esta información puede serUsado para apuntar y automáticamente parche las células de interés. El software está escrito en Python -un lenguaje de programación libre y de código abierto- que utiliza varias bibliotecas de código abierto. Esto asegura su accesibilidad a otros investigadores y mejora la reproducibilidad y el rigor de los experimentos de electrofisiología. El sistema tiene un diseño modular, de modo que el hardware adicional puede ser fácilmente interconectado con el sistema actual demostrado aquí.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

La abrazadera del remiendo de la célula entera es el método gold-standard para medir las características eléctricas de células individuales. Sin embargo, la abrazadera de parche in vitro sigue siendo una técnica desafiante y de bajo rendimiento debido a su complejidad y alta dependencia en el funcionamiento y control del usuario. Este manuscrito demuestra un sistema de abrazadera de parche automático guiado por imágenes para experimentos in vitro de clamp de parche de células enteras en cortes cerebrales agudos. Nuestro sistema implementa un algoritmo basado en la visión por computadora para detectar células marcadas fluorescentemente y para dirigirlas para un parche totalmente automático usando un micromanipulador y un control interno de la presión de la pipeta. Todo el proceso es altamente automatizado, con requisitos mínimos para la intervención humana. La información experimental en tiempo real, incluida la resistencia eléctrica y la presión interna de la pipeta, se documentan electrónicamente para análisis futuros y para la optimización a diferentes tipos de células. Aunque nuestro sistema se describe en el contexto de agudos braiN, también se puede aplicar a la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada de neuronas disociadas, cultivos de corte organotípico y otros tipos de células no neuronales.

<html> Nuestro sistema ha sido probado en su capacidad de parche de células en los cortes de cerebro agudo, inducida por el ratón Pluripotent Stem Cells (iPSCs) diferenciadas en neuronas, y células HEK 293 que expresan artificialmente los canales de interés. La Figura 3 muestra un experimento utilizando ratones transgénicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) dirigidos a neuronas piramidales de capa 5 marcadas fluorescentemente en la c...

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro .

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K vistas.  Purdue University.  Este protocolo describe la forma de llevar a cabo automático de imágenes guiadas por pinzas de abrazadera experimentos utilizando un sistema desarrollado recientemente para estándar de equipos de electrofisiología in vitro . 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Investigación

Neurociencias

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.