Nos gustaría agradecer a Changhui Pak y Alysia Vrailas Mortimer inicialmente enseñanza SMK la técnica de disección del cerebro. También agradecemos a los miembros del grupo de lab de Ken Moberg, especialmente Chris rondas, para leer críticamente el manuscrito. Anticuerpos reconociendo Fas2 (1 4) y chaoptin (24B10) se obtuvieron del Banco de hibridoma de estudios del desarrollo. Anticuerpos 24B10 se depositó a la DSHB por Seymour Benzer y Nansi Colley24,60,61, anticuerpo 1 4 se depositó a la DSHB por Corey Goodman 22,23,56. Las poblaciones de mosca se obtuvieron desde el centro de Stock de Bloomington. También queremos agradecer al Ohio Agricultural Research y desarrollo centro (OARDC) MCIC Imaging Center, para el uso del microscopio confocal para obtener imágenes del cerebro en la Figura 4A y B. SMK es apoyado por una beca de la NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El método de disección y visualización descrito anteriormente puede utilizarse en una amplia variedad de inmunotinción y aplicaciones en vivo. Han descrito un protocolo general de inmunotinción y han puesto de relieve una forma en la que MARCM permite visualizar la morfología axonal de neuronas del cuerpo individual de la seta. Además, estos procedimientos generales pueden utilizarse también para otras regiones del cerebro fija la proyección de imagen o adulto recién disecado cerebros48,65. En proyección de imagen puede proporcionar un enfoque más eficiente al analizar patrones de expresión de enhancer trampas, genes del reportero o imitador líneas66, por ejemplo. Para evitar capturar artefactos de muerte celular durante proyección de imagen viva de la GFP en el tejido no fijado, cerebros disecados en 1 x fosfato tampón salino (PBS) o HL3 media48, montados en portaobjetos de puente de 1 x PBS (o HL3) y reflejados en menos de 15-20 min cuidado deben adoptarse para eliminar tanto tráquea como sea posible del cerebro disecados antes de la proyección de imagen, ya que puede interferir con la visualización de la fluorescencia de GFP.
Mientras que condiciones de tinción para la evaluación de la morfología de las neuronas cuerpo y fotorreceptor setas están relativamente bien establecidas24,61,67, la localización de una proteína específica de interés en estas células tipos pueden requerir optimización y solución de problemas extensa. En particular, varios pasos críticos, incluyendo la dilución del anticuerpo, tampón componente concentración bloqueo y fijación, deben ser optimizados para generar los resultados más reproducibles y fiables. En primer lugar, debe determinarse la concentración óptima del anticuerpo primario. Aunque anticuerpos disponibles en el mercado suelen tienen una dilución sugerida (y a menudo inicialmente empezamos por esa concentración), estos valores rara vez determinados empíricamente en los tejidos de la Drosophila . Por lo tanto, probando una serie de diluciones del anticuerpo primario que gama por encima y por debajo de la propuesta inicial del fabricante a menudo resulta en manchas más específica. Mientras que la dilución del anticuerpo primario puede tener un efecto significativo en la coloración de precisión y debe determinarse precisamente, se incuban los cerebros de la época en que contiene el anticuerpo primario soluciones pueden variar considerablemente con poco efecto sobre el resultado global. Por ejemplo, hemos observado resultados similares cuando incubando diseccionado cerebros con el anticuerpo primario Fas2 anticuerpo para dos, tres o incluso cuatro días a 4 ° C. Aunque recomendamos al menos dos noches, también hemos incubado cerebros en la solución de anticuerpo primario para una sola noche y obtuvo tinción reproducible. Lo importante, limitando la cantidad de tiempo que los cerebros se incuban en el anticuerpo secundario a 3 h a temperatura ambiente (o una noche a 4 ° C) permite a fijación de límite no específica de anticuerpos secundarios tejido cerebral.
En segundo lugar, puede ser necesario utilizar reactivos adicionales de "bloqueo" para eliminar señales de fondo no deseados. Las opciones incluyen aumento de la concentración de NGS a ~ 10%, agregar 1-10% albúmina de suero bovino (BSA) al bloqueo y primario y secundario soluciones de anticuerpos, o la adsorción de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C con Drosophila embriones (véase de referencia68, sección 2.9, paso 3).
Mientras que hemos escrito el anterior protocolo usando RTP como el búfer sugerido para la fijación de todos, colada y pasos de incubación de anticuerpos, fijación del tejido en otros búferes (como PLP y PEM, indicados en la Tabla de materiales) puede resultar en diferencias profundas en intensidad de la señal. Por ejemplo, estudios anteriores han demostrado que la ciclina E es indetectable en los discos imaginales larvas cuando los tejidos se fijan en paraformaldehído al 4% de tradicional diluido en PBS, pero es claramente visible cuando los tejidos se fijan en tampón de PLP (Ken Moberg, personal comunicación y referencia69). Además de los cambios en el búfer de componentes, alterando el tiempo y la temperatura de fijación del tejido también significativamente puede afectar inmunofluorescente tinción y puede determinarse empíricamente si es necesario. En general, tiempo de fijación debe ser lo suficientemente largos para permitir la reticulación suficiente de componentes celulares y mantenimiento a largo plazo de morfología general celular estando limitado lo suficiente para evitar la sobre-reticulación y "enterrar" de epítopes de la proteína. Por lo tanto, cuando inicialmente optimizar condiciones de tinción para un anticuerpo primario recién adquirida, generalmente limitar el tiempo de fijación para aproximadamente 20 minutos y a menudo va a arreglar los tejidos a temperaturas más frías.
Varios controles deben incluirse en cualquier experimento de inmunofluorescencia para investigar la especificidad de los anticuerpos primarios y secundarios, así como el efecto de los transgenes/genética en el fenotipo observado. Para comprobar si el anticuerpo primario se utiliza específicamente reconoce la proteína de interés, tejido de moscas que carecen de esta proteína o tejido overexpressing la proteína debe ser incluido como controles. También se pueden incluir la adición de exceso proteína purificada para determinar si el anticuerpo primario reconoce otros epítopes en el cerebro de mosca. Por último, cualquier señal fluorescente cuando se omiten los anticuerpos primarios representa el nivel de fijación no específica de los anticuerpos secundarios seleccionados.
También deben incluir varios controles importantes para evaluar la contribución de la genética o la presencia de los transgenes a la intensidad de la tinción o morfología neuronal. Por ejemplo, las moscas utilizadas en el experimento MARCM en la figura 5 contienen múltiples transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, tina &#62; GAL80 y OK107-GAL4), cada uno de los cuales debe ser analizado por separado para efectos en la morfología del cuerpo de la seta. En una morfología de cuerpo mínimo, seta de las moscas que contengan OK107-GAL4 y UAS-CD8-GFP debe analizarse. También puede ser necesario evaluar el efecto del choque del calor y producción de recombinase de Flp en el desarrollo del cuerpo de la seta analizando vuela que contiene hsFLP y FRT82B. Aunque MARCM puede proporcionar la penetración importante en si una determinada proteína controla autónomamente la Guía axonal, el número de controles necesarios para realizar con precisión esta conclusión puede ser una menor limitación de esta técnica. En los experimentos menos complicados, controles similares también son aplicables. Por ejemplo, tomar un experimento donde el sistema de GAL4/UAS se está utilizando en combinación con un transgén ARNi a precipitación expresión de una proteína de interés en todas las neuronas. En este experimento, por lo menos dos transgenes estará presentes: un conductor GAL4 pan-neuronal, elav-GAL4, como el transgén UAS-ARNi . La morfología de las neuronas del cuerpo de la seta de moscas que contiene cada uno de estos transgenes solo debe investigarse además de la condición experimental donde moscas albergan tanto los transgenes en la mosca de la misma.
Finalmente, para determinar si la proteína de interés se expresa en las neuronas del cuerpo de la seta es generalmente necesario cerebros mancha Co con anticuerpos para Fas2. Por otra parte, proteínas fluorescentes como GFP y RFP la membrana destino CD8-GFP también puede expresarse utilizando el sistema de GAL4/UAS y utilizado en combinación con anticuerpos reconocer la proteína de interés. Desde Fas2 sólo reconoce los axones fasciculados que forman los lóbulos α y β del cuerpo de la seta, el uso de GAL4-conducido, unida a la membrana CD8-GFP ha sido especialmente útil para marcar las neuronas del cuerpo de la seta.
Defectos en la Guía axonal a menudo no son 100% penetrante y cerebro incluso del mismo genotipo puede mostrar cierta variabilidad. Por lo tanto, cuando analizando nuevamente genera alelos del mutante para defectos en el cuerpo de la seta o pathfinding fotorreceptor, debería utilizarse una combinación de alelos diferentes y enfoques. Mayoría de los estudios en la literatura utiliza varios métodos para investigar si una proteína desempeña un papel autónomo de la célula en el control de Guía axonal: i) análisis de pathfinding defectos homocigóticos moscas nulas (preferentemente utilizando diferentes nualelos de ll), ii) análisis de pathfinding defectos de moscas que carecen de la proteína de interés sólo en las neuronas (generalmente vía RNAi), iii) análisis MARCM de pathfinding defectos y iv) rescate de experimentos donde el gen es volver a expresado en las neuronas de homocigotos nulos vuela. Idealmente, deben analizarse varios docena cerebros por genotipo por defectos en la morfología neuronal.
Aunque el protocolo descrito aquí sobre todo se centra en localización inmunofluorescente de proteínas dentro del tejido fijo, se están desarrollando varias futuras aplicaciones de esta técnica al tejido fino del cerebro en imagen. Una vez que los cerebros se disecan (generalmente en medios de cultivo celular), pueden entonces ser cultivadas durante varios días a 25 ° C. Estos métodos de cultivo ex vivo se están desarrollando con el fin de investigar una amplia variedad de procesos biológicos, como la actividad de la proteína que promueve la regeneración del axón siguiendo lesión70,71, intracelular señalización dinámica72y73de desarrollo neuronal.

Aunque el sistema nervioso de Drosophila es menor que la de los seres humanos y roedores, su complejidad proporciona un modelo potente y accesible para entender mejor sus equivalentes vertebrados. En muchos casos, los genomas de vertebrados y moscas codifican proteínas muy similares que determinan los mecanismos de desarrollo del sistema nervioso. De hecho, muchos de los genes necesarios para el desarrollo neuronal en vertebrados han ortólogos en moscas, incluyendo aquellos involucrados en vías de señalización patrones de control, la neurogénesis y Guía axonal1,2,3 ,4,5. Por ejemplo, netrin es un ligando para la Guía axonal en mamíferos y D. melanogaster6,7,8. Mientras netrin fue originalmente aislado de chick embrionario cerebro tejido6, estudios posteriores han revelado que netrin desempeña un papel conservado durante el desarrollo del embrionario sistema nervioso central (SNC) en Drosophila8. Otros estudios han utilizado pantallas genéticas en el embrión de Drosophila CNS para identificar conservados ligandos y receptores para pathfinding en tanto en Drosophila como en vertebrados9.
Mientras que la mosca embrionaria del CNS se ha utilizado ampliamente en el pasado para identificar ligandos, receptores y proteínas de señalización intracelulares necesarias para la Guía axonal8,9, el trabajo reciente ha investigado las formas en que muchos de Estas proteínas también controlan las decisiones pathfinding durante etapas posteriores del desarrollo. Específicamente, investigación del cuerpo de la seta (MB) y desarrollo de neuronas fotorreceptoras retinianas (figura 1) ha proporcionado información sobre los mecanismos pathfinding control, formación de sinapsis, axón poda y otros aspectos del neuronal desarrollo10,11,12,13,14,15,16,17. Las neuronas fotorreceptoras conectan la retina de la mosca a las regiones del cerebro adulto llamada la lámina y médula y son fundamental para transmitir información visual al cerebro (revisado por18,19), mientras que las neuronas del cuerpo de la seta centralmente localizado en el cerebro de mosca y son necesarios para el aprendizaje y la memoria de20,21. Las neuronas fotorreceptores y las neuronas intrínsecas de los cuerpos de hongos, llamadas células de Kenyon, utilizan mecanismos evolutivamente conservado Guía axonal difusible y dependientes del contacto para encontrar sus blancos postsinápticos. Además de ser visible en moscas adultas, fotorreceptores y neuronas MB pueden también ser directamente visualizadas en larvas y pupas con anticuerpos o reportero genes22,23,24,25. La capacidad de visualizar fácilmente estos dos conjuntos de neuronas en diferentes momentos del desarrollo ha promovido su uso como modelos excelentes para muchos aspectos del desarrollo neuronal.
Además de ser utilizado como un modelo para entender los mecanismos del desarrollo normal del sistema nervioso, estudios recientes han demostrado que moscas también sirven como modelos precisos de una gran variedad de enfermedades humanas, incluyendo el síndrome de X frágil (FXS)26 ,29,30,31de discapacidad intelectual (di)27,28,y otros32. Por ejemplo, para estudiar la función molecular de ZC3H14, un gen recientemente vinculado a discapacidad intelectual humano, hemos creado un modelo de mosca de ID con un alelo nulo de la mosca ZC3H14 ortólogo, llamado Nab230. Moscas que carecen Nab2 tienen discapacidad severa de la memoria y poly(A) colas, recapitulando lo que se observa en pacientes humanos o paciente derivado célula líneas33,34. Lo importante, moscas que carecen Nab2 también mostrarán defectos de morfología cerebral grave en sus cuerpos seta adultos34, similar a lo que se observa en moscas que carecen el gene del síndrome de FXS, FMR135. Por lo tanto, moscas pueden servir como un organismo modelo importante para estudiar el desarrollo normal del cerebro y enfermedades que lo interrumpen.
Por último, la accesibilidad de métodos de alto rendimiento para controlar el comportamiento, combinado con la amplia gama de herramientas genéticas disponibles, hacer Drosophila , un organismo modelo de elección para la identificación de las regiones del cerebro que controlan los comportamientos complejos, tales como aprendizaje y memoria, sueño, cortejo, sed y otros36,37,38,39. Una herramienta especialmente útil que está en el centro de "caja de herramientas" de un genetista mosca es el sistema de GAL4/UAS (figura 2). Este sistema40,41 utiliza la expresión específica de tejido del activador transcripcional Gal4 para aumentar la expresión de genes o transgenes aguas abajo de una secuencia de activación ascendente (UAS). Modificaciones de este sistema han permitido a los investigadores, por ejemplo, precisamente el control de la excitabilidad de las neuronas específicas42,43, sobrexpresan o precipitación de genes específicos de interés44, 45, analizar la dinámica de calcio en tiempo real en vivo46y expresar genes del reportero para marcar linajes neuronal41. La combinación del sistema de GAL4/UAS con la recombinación mitótica también permitida la creación del análisis de mosaico con un marcador de célula Repressible (MARCM) sistema12,47. MARCM se ha utilizado extensivamente en seguimiento de neurona única para identificar los componentes celulares de señalización necesarios para la Guía axonal12,47. Aunque estas y otras técnicas han proporcionado una cantidad de información valiosa sobre los mecanismos celulares necesarios para la función del sistema nervioso, la mayoría requieren que el cerebro de la Drosophila primero se diseca; eliminar del cerebro es necesaria para mantener patrones de morfología y conexión correcta del cerebro entre las regiones del cerebro. El siguiente protocolo utiliza neuronas cuerpo y fotorreceptor hongos comopoblaciones neuronales ejemplo como él le guía a través de la disección y cerebros inmunofluorescente de la coloración del adulto de Drosophila .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Desarrollo del sistema nervioso consiste en una serie secuencial de acontecimientos que son coordinados por varias vías de señalización y redes reguladoras. Muchas de las proteínas implicadas en estas vías son evolutivamente conservados entre los mamíferos y otros eucariotas, tales como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, sugiriendo que existen principios de organización similares durante el desarrollo de estos organismos. Lo importante, Drosophila se ha utilizado ampliamente para identificar los mecanismos celulares y moleculares de regulación de procesos que se requieren en los mamíferos incluyendo la neurogénesis, diferenciación, Guía axonal y sinaptogénesis. Moscas también se han utilizado con éxito para modelar una variedad de enfermedades del desarrollo neurológico humano. Aquí se describe un protocolo para la microdisección paso a paso, fijación y localización inmunofluorescente de proteínas en el cerebro adulto de Drosophila . Este protocolo se centra en dos poblaciones neuronales de ejemplo, las neuronas del cuerpo de la seta y fotorreceptores retinianos e incluye pasos opcionales para rastrear las neuronas cuerpo seta individual mediante análisis de mosaico con una técnica de marcador celular Repressible (MARCM). Ejemplo datos de tipo salvaje y mutantes cerebros se presentan junto con una breve descripción de un criterio de puntuación para los defectos de Guía axonal. Si bien este protocolo destaca dos anticuerpos bien establecidos para la investigación de la morfología del cuerpo de la seta y las neuronas fotorreceptoras, otras regiones del cerebro de Drosophila y la localización de proteínas dentro de otras regiones del cerebro también puede ser investigados mediante este protocolo.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.2K vistas.  The College of Wooster. Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Video: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la

La cría de la mosca de la fruta

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta