Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.

1. inducción de hipoxia
<ol><li>Un día o más antes del curso de tiempo de hipoxia: preparar la incubadora, celular filtrado sistema de vacío, tanque de gas, frascos, tapones, tubos de vidrio y tubos, como en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Coloque el tanque de2 N, incubadora, sistema de aspiración y filtración en proximidad cercana, a habilitar el procesamiento rápido de las células.</li>
	<li>Preparar medio YPD líquido estéril (1% Extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa) mezclando los componentes en una botella de vidrio y autoclave.</li>
	<li>Plan de diseño de frascos en la incubadora. Nota: El tanque de2 N, el primer frasco será una trampa de agua, el segundo matraz será el último punto de tiempo, el tercer matraz será el segundo a último momento y así sucesivamente hasta el último frasco que es una trampa de agua final. La figura 1 muestra el orden y las conexiones entre los frascos.</li>
	<li>El día anterior el curso del tiempo, inocular una colonia de levadura en una cultura de 5 mL de líquido YPD dentro de un tubo de ensayo estéril. Específicamente, recoger una colonia completa de una placa con un palito aplicador estéril. Coloque el palo en el YPD líquido y agitar el palo hasta que la mayoría de las células en suspensión.</li>
	<li>Gire los tubos a 30 ° C durante la noche (~ 16 h). Nota: Después de 16 horas, las células de tipo salvaje alcanzar saturación (~ 2 x 108 células/mL), indicado por una cultura muy nublada. Otras cepas pueden tardar más tiempo para alcanzar la saturación y prueba midiendo la concentración de células con un espectrofotómetro, tal como se indica en el paso 1.9.4.</li>
	<li>En el día del curso del tiempo, después de 16 h de incubación, diluir la cultura saturada 1:50 por utilizando una pipeta de 5 mL a 4 ml de noche cultura en 196 mL de YPD líquido dentro de un matraz de 500 mL estéril. Crecer con agitación a ~ 200 rpm durante 4 horas a 30 ° C. Nota: Después de 4 h, una cultura de tipo salvaje llega a una concentración de medio registro de ~ 1-2 x 107 células/mL.</li>
	<li>Durante la 4 h de incubación, etiqueta los frascos (para las trampas de la hipoxia y el agua) y los 50 mL tubos de recogida. Si la incubadora en el paso 1.7 anterior no se utiliza para el curso del tiempo de hipoxia, encienda la otra incubadora y 30 ° C.</li>
	<li>
Justo antes de someter las células a la hipoxia:
	<ol>
<li>Añadir 50 mL de agua a dos de los frascos estéril de 250 mL que servirán como las trampas de agua.</li>
		<li>Llenar 1/3 de hielo de cubo con nitrógeno líquido y sumerja un bastidor de espuma de poliestireno para sostener tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Configurar el sistema de filtro para recolección de células. Añadir un disco de filtro estéril en la unidad inferior del sistema de filtración utilizando pinzas estériles, teniendo cuidado de tocar sólo los bordes del disco de filtro. Coloque la unidad en la unidad inferior del filtro filtro y asegure con abrazaderas el sistema. Asegurar que las unidades superior e inferior están alineadas para que haya un sello hermético y no hay fugas.</li>
		<li>Medir la concentración de células con un espectrofotómetro. Diluir las células por lo que puede medirse en el rango lineal del espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0,6, dependiendo del espectrofotómetro. Nota: Una unidad de OD600 es ~ 3 x 107 células/mL, dependiendo de la morfología de la célula y espectrofotómetro. Se espera una concentración de ~ 1-2 x 107 células/mL, correspondiente a OD600 ~0.33 - 0.66.</li>
		<li>
Obtener rápidamente la muestra de tiempo 0.
		<ol>
<li>Conecte el sistema de filtro a un vacío fuerte (~ 10 mbar) a través de tubo de vacío y una trampa de frasco de 1.000 mL. Encienda la aspiradora. Vierta la cultura (generalmente unos 20 mL) en la unidad y espere a líquido ser tirado a través del filtro (~ 10 s, dependiendo de la fuerza del vacío).</li>
			<li>Con cuidado retire el disco de filtro con unas pinzas limpias y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque inmediatamente el tubo de centrífuga en el estante sumergido en nitrógeno líquido. Importante, no pre-enfriar los tubos antes de insertar el filtro ya que podría explotar los tubos.</li>
			<li>Después de > 30 s, lugar el tubo en un congelador de-80 ° C para la posterior extracción de RNA. Después de cada filtración, limpiar y volver a montar el sistema de filtro. Enjuague el sistema tirando agua a través de 10 s sin un disco de filtro. Por último, seque el sistema con una toalla de papel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diluir la cultura 4 h en frascos diferentes para los distintos puntos de tiempo, para que cada frasco alcanza registro media concentración (~ 1-2 x 107 células/mL) en el momento indicado de la hipoxia. Nota: La tabla 1 muestra las diluciones que se utilizaron para la cepa haploide de tipo salvaje S288C HAP1+ . Es aconsejable probar cada cepa en estas condiciones de cultivo hipóxico y ajustar en consecuencia las diluciones.</li>
		<li>Una vez que las células y los medios de comunicación se añaden a los matraces, reemplazar el papel de aluminio que cubre el frasco con un tapón que contiene dos tubos de vidrio insertados.</li>
		<li>Coloque los frascos en la incubadora en el diseño determinado anteriormente.</li>
		<li>Conecte firmemente la tubería como se muestra en la figura 1.</li>
		<li>Compruebe que todos los tapones se empujan firmemente en los orificios del matraz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A tiempo 0, abra la válvula del regulador. Luego ajuste el medidor de flujo a 3 L/min. Nota: Burbujeo se observará en ambos frascos de agua, indicando flujo adecuado de gas. Si este no es el caso, compruebe que los tapones estén bien apretadas y tubería esté correctamente conectada.</li>
	<li>La incubadora de cierre y ajuste la velocidad de agitación a ~ 200 rpm. Iniciar un temporizador.</li>
	<li>Antes de cada momento, establecer el sistema de filtración como se describe anteriormente en el paso 1.9.3.</li>
	<li>
En cada punto del tiempo (p. ej., 5 min, 10 min, etc.), con dos personas procesar rápidamente las celdas como sigue:
	<ol>
<li>Primera persona: Retire el matraz adecuado del soporte y sacar el tapón (con tubo de vidrio conectado). Nota: Esto no interrumpirá el flujo de N2 a cualquiera de los frascos de cultivo restantes pero rompe temporalmente el flujo a la última trampa de agua.</li>
		<li>Segunda persona: Pipetear 1 mL de cultivo y pipetear en una cubeta. Vuelva a conectar el tubo del frasco de cultura que está ahora en el extremo de la línea a la última trampa de agua (un tubo y una tapón voluntad eliminarse en el proceso). Entonces, medir la concentración de células en la cubeta, como se describió anteriormente en el paso 1.9.4.</li>
		<li>Primera persona: Vierta el resto de la cultura en el sistema de filtración de vacío y luego realizar filtrado y congelación como se describió anteriormente en el paso 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando haya terminado con todos los puntos de tiempo, apague el gas N2 . Primero cerrar el regulador y esperar a que la presión liberar y luego apague el medidor de flujo. Finalmente, desmontar el sistema y limpiar todos los materiales con agua y luego con etanol al 70%.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Preparar buffer RLT para purificación del ARN a columna, como se describe en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de la ADNsa añadiendo 10 μl de la solución madre de DNasa a 70 μl de buffer RDD por muestra (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Retirar los tubos de 50 mL que contiene filtros y células del congelador de-80 ° C y coloque en hielo se descongele (~ 15 min). Realice los pasos siguientes con los tubos en hielo.</li>
	<li>Etiqueta 2 mL tubos de tapón de rosca y colocar en hielo, un tubo para cada muestra. Añadir ~0.6 mL de ácido lavado los granos en cada tubo, utilizando un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cucharada y medir las cuentas.</li>
	<li>Añadir 0,6 mL del tampón frío de la RLT en los tubos de 50 mL.</li>
	<li>Pipeta hacia arriba y hacia abajo para quitar las células de filtro y suspender en la solución. Evitar que el filtro permanezca en la solución como empapará el filtro de la solución. Quitar toda la solución absorbente en el filtro utilizando la punta de la pipeta para apretar el filtro contra la pared del tubo.</li>
	<li>Transferir todo el líquido del tubo de 50 mL a los tubos de tapón de rosca que contiene granos.</li>
	<li>Colocar los tubos de tapón de rosca en un homogeneizador de molino de grano y duración de un minuto. Inmediatamente Coloque los tubos en hielo durante tres minutos. Otra vez, colocar los tubos en el homogenizador y duración de un minuto.</li>
	<li>Retirar los tubos del homogeneizador y el lugar en el hielo durante 5 minutos. Las cuentas se asentarán en la parte inferior de los tubos.</li>
	<li>Realizar el resto de los pasos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con una pipeta, transferir solamente el lisado (~ 350 μL), evitando los granos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrífuga por 2 min a máxima velocidad y luego traslado el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Agregar 1 volumen de etanol al 70% (a base de etanol de grado biología molecular prueba 200). Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Transferencia de la solución y cualquier precipitado a una columna de RNA que se ha colocado dentro de un tubo de colección de 2 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través (el líquido en el tubo).</li>
	<li>Añadir 350 μl de tampón RW1 a la columna. Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 80 μl DNasa I mezcla de incubación de la membrana de la columna (no permita que en los lados del tubo) y dejar para reposar 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 350 μl de tampón RW1 a columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar flujo a través.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga por 2 min a ≥12, 000 x g.</li>
	<li>Cuidadosamente retire la columna y coloque en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Microcentrífuga a toda velocidad durante 1 minuto (para secar completamente la membrana).</li>
	<li>Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna.</li>
	<li>Eluir el RNA de la columna por microcentrifuging durante 1 min a ≥12, 000 x g. Al cargar las columnas en la microcentrífuga, asegúrese de que las tapas del tubo de colección se enfrentan en la dirección de la centrifugadora gira, para evitar que las tapas de interrupción.</li>
	<li>Añadir otro 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna, manteniendo la columna en el mismo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Microcentrífuga durante 1 min a ≥12, 000 x g, por lo que el volumen del efluente final es 60 μL.</li>
	<li>Almacenar cada tubo de 1,5 mL que contiene 60 μL de RNA en el congelador de-80 ° C.</li>
</ol>3. determinar la calidad y la concentración de RNA
<ol><li>Medir la concentración de ARN y ADN en cada muestra de RNA, con un Fluorímetro, (b) ADN y RNA-específico fluorescente tintes y tubos de ensayo (c), que se enumeran en la Tabla de materiales. Siga las instrucciones de los tintes y el fluorómetro.</li>
	<li>Por otra parte, medir la concentración de ácidos nucleicos con un espectrofotómetro de UV a 260 nm. Nota: Una una lectura260 de 1.0 es equivalente a ~ 40 μg/mL solo ARN.</li>
	<li>Prueba calidad de RNA ejecutando el RNA en un analizador comercial de ácido nucleico (véase Tabla de materiales) o en un formaldehído/agarosa estándar gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq análisis
<ol><li>De la estirpe de RNA total, son 21 μl de 100 ng/μl de RNA en agua libre de ARNasa. Use 1 μl de este 21 μL para la concentración de RNA como el anterior. Presentar lo restantes 20 μl (2 μg) ARN total para un centro de secuenciación externa para el enriquecimiento de mRNA, preparación de la biblioteca específica de filamento (con ocho o más códigos de barras para multiplexación) y secuencia (véase Tabla de materiales). Alternativamente, localmente realizar enriquecimiento de mRNA y la preparación de la biblioteca y luego presentar la biblioteca para la secuencia.</li>
	<li>Piscina de ocho o más muestras de multiplexado y la secuencia en un carril de un secuenciador de última generación.</li>
	<li>Descargar el fichero FASTQ que contienen toda las secuencia de lecturas y lee el índice correspondiente. Descargar el archivo de texto que contiene los códigos de barras multiplex. Nota: Las lecturas de índice pueden estar presentes en un archivo separado de FASTQ. Coloque todos estos archivos en un directorio.</li>
	<li>Colocar el script que aquí, "fastq_pipeline.sh", en el mismo directorio. Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador. Nota: esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, la calidad de la secuencia de comandos recorta la lee la Lee los mapas del genoma y genera un archivo delimitado por tabuladores que contiene el número de lecturas por gen por cada muestra.</li>
	<li>Depositar los archivos FASTQ y crudos datos leer en Gene expresión Omnibus de NCBI antes publicación 27. Siga las instrucciones para "Datos de la secuencia de alto rendimiento de envío a GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importar los datos de cuenta leer en el ambiente estadístico de R y realizar análisis estadístico, utilizando el script de R que aquí, "time_course_script. R". Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador. Nota: Esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, este script importa los datos leídos, normaliza la Lee, identifica genes que cambian significativamente durante el curso del tiempo, realiza análisis de PCA y grafica la expresión de genes seleccionados.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de...

Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recientemente, RNA-seq fue utilizado para caracterizar cambios de expresión génica en el tiempo durante la hipoxia 13. Aquí, se presentan los detalles experimentales y discuten.
La hipoxia puede lograrse de varias maneras, cada una produciendo un nivel diferente de O2. Aquí, la hipoxia fue establecida por continuamente que fluye ultra alta pureza N2 en frascos, que disminuye [O2] inmediatamente disuelta con reproductivos cinética 10. Es posible que algunas O2 moléculas presentes que contribuyen a la expresión génica y el metabolismo pero este entorno se considera muy cerca de anaerobios. En ausencia de O2, las células de levadura no pueden sintetizar hemo, ergosterol y ácidos grasos insaturados 4,12,14. Así, estudios previos han incluido estos metabolitos cuando levadura sin oxígeno 5,10,15. Sin embargo, muchas respuestas hipóxicas son mediadas por el agotamiento de estos metabolitos y así rellenarlos invierte en el gen hipóxico expresión respuestas 12,16. Con el fin de imitar la hipoxia natural, estos metabolitos no fueron agregados a los medios de comunicación. En el poco tiempo que las células fueron expuestas a hipoxia sin la presencia de estos metabolitos esenciales, no había ningún aumento sensible en la muerte celular (datos no mostrados) ni a estrés prolongado respuesta 13.
La respuesta también es dependiente de la cepa y su genotipo. Especialmente importantes son los alelos de los reguladores conocidos de respuestas hipóxicas 2. El fondo de la cepa de S288C es altamente deseado para que resultados pueden ser comparados con los otros estudios genómicos realizados con esta variedad. Sin embargo, S288C contiene un alelo de pérdida de la función parcial de la HAP1 gen 17, un regulador transcripcional esencial para la respuesta hipóxica. Este alelo fue reparado en S288C usando un wildtype copia de la Σ1278b cepa fondo 11.
Expresión génica es altamente dependiente sobre el medio ambiente celular. Por lo tanto, al realizar el análisis del mRNA del genoma, es importante mantener un ambiente constante mientras varía otro parámetro como tiempo, estímulo o genotipo. Para lograr resultados altamente reproducibles, considere estas tres prácticas para el estudio y sus réplicas biológicas o técnicas. En primer lugar, el mismo experimenter(s) debe realizar el estudio, desde prácticas técnicas pueden variar a través de experimentadores. En segundo lugar, del mismo lote de ingredientes debe utilizarse en los medios de crecimiento, ya que cada lote tiene una composición ligeramente diferente que puede afectar la expresión génica. En tercer lugar, para minimizar los efectos del ciclo de la célula, cada momento debe consistir en células asincrónicas en la fase de registro medio de crecimiento (1-2 x 107 células/mL).
Al caracterizar una respuesta compleja como la gene expresión respuesta a la hipoxia, un curso del tiempo es ventajoso para la determinación de la cinética de varios eventos. Puntos de tiempo específico deben ser elegidos que capturará los principales cambios de la respuesta. En este estudio, se observaron puntos de tiempo entre 0 y 4 h, porque pasados experimentos revelaron cambios generalizados en la expresión génica durante este período 13.
Para medir la expresión génica global, RNA-seq fue usado 18,19. Este método utiliza secuenciación de próxima generación para determinar la abundancia relativa de transcripción de cada gen. En comparación con el análisis de microarrays de DNA, RNA-seq exhibe una mayor sensibilidad (para detectar menos abundantes transcripciones), un mayor rango dinámico (para medir cambios veces mayor) y reproducibilidad superior (seguir con precisión la expresión génica en el tiempo). Normalmente, más celular ARN es ARN ribosómico que muchos métodos han sido desarrollados para enriquecer determinados RNA especie 20. Aquí, granos de poly-T se utilizaron para purificar las transcripciones del mRNA de la poli-que la contengan, aunque varios comercialmente - kits disponibles de agotamiento de rRNA también podrían ser eficaces en el enriquecimiento de mRNA.
Aquí, se caracterizó la respuesta de expresión del gen de S. cerevisiae a la hipoxia. Las células fueron expuestas a la hipoxia y luego muestras en ocho puntos del tiempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 y 240 min). Para confirmar la reproducibilidad e identificar estadísticamente cambió las transcripciones, se realizaron tres réplicas biológicas. ARN fue extraído por la interrupción mecánica y purificación de la columna y luego procesada para el análisis de RNA-seq. Se describe la tubería posterior secuenciación y programación scripts son siempre que permiten la replicación exacta de los análisis realizados. Específicamente, Trimmomatic 21TopHat2 22, HTseq 23, el entorno estadístico de R 24y el DESeq2 paquete 25 fueron utilizados para procesar los datos de RNA-seq y a identificar los 607 genes que cambian significativamente durante hipoxia. Análisis de componentes principales (PCA) y expresión génica de las repeticiones indican la reproducibilidad de la técnica. Clustering y heatmaps reveló cinética de expresión amplia, mientras que el análisis del gene ontology (GO) demostró que muchos procesos celulares, como respiración aeróbica, se enriquecen en el conjunto de genes regulados por el oxígeno.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 - 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.

El curso del tiempo de hipoxia y RNA-seq análisis fueron realizados independientemente tres veces. Para examinar la reproducibilidad de las tres repeticiones, datos de expresión genética para todos los genes se analizan mediante análisis de componentes principales (ACP). La figura 2 muestra cómo cambian las muestras durante los dos primeros componentes principales, que en conjunto representan el 58.9% de la variabilidad. Este análisis indicó que cada c...

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K vistas.  Rowan School of Osteopathic Medicine. Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Investigación

Bioquímica

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genética

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biología

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

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