Financiación: Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Imperial para centro de investigación biomédica investigación de la salud (NIHR) (BRC), la unidad NIHR de investigación de protección de salud (HPRU) en las infecciones respiratorias en el Imperial College de Londres en asociación Salud pública de Inglaterra (PHE) y el centro de investigación traslacional NIHR Imperial seguridad del paciente. Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o salud pública de Inglaterra.

Las técnicas utilizadas en el protocolo siguiente han sido aprobadas por el Comité de ética de investigación de Londres Oeste (número de referencia 15/lO/0444).
1. nasal absorción (NA)
<ol><li>
Preparación antes del muestreo de NA
	<ol>
<li>Al llevar a cabo NA, primero Lávese las manos y colóquese guantes, preferiblemente frente al paciente.</li>
		<li>Inspeccionar la cavidad nasal mediante una linterna de cabeza y que el clínico utilice su pulgar no dominante para retraer la nariz del paciente para visualizar la cavidad nasal. Nota: Un espéculo nasal no es generalmente necesario.</li>
		<li>Visualizar la cavidad nasal y cornete nasal antes de muestreo inferior. Nota: Las narinas (orificios nasales) no son redondas en corte transversal y van directamente hacia atrás. Generalmente, el cornete nasal inferior puede ser visto como un abultamiento o hendidura en la pared lateral de la fosa nasal, con el tabique nasal formando la pared lisa, plano medial. Queremos una muestra de este inferior cornete nasal, ya que el epitelio subyacente es un simple epitelio ciliado del tracto respiratorio44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muestreo de NA
	<ol>
<li>Cuando se muestrea, pasar el SAM NA suavemente hasta el lumen de la fosa nasal, orientar para ser plana contra el cornete nasal inferior.</li>
		<li>Pedir el donante que utilice el dedo índice para presionar el SAM en la mucosa nasal. NA puede causar un leve picor, con posible lagrimeo, como la FML es absorbido. Nota: En los adultos, generalmente realizamos NA 60 s.</li>
		<li>Después de la absorción de la FML, retire el dispositivo de NA de la fosa nasal y ponga en el tubo original.</li>
		<li>Procesar las muestras inmediatamente en el laboratorio o congelarlas, como se detalla más adelante en este protocolo. Nota: NA se está estudiando en una variedad de modelos de desafío mucosa nasal y también en enfermedades de vías respiratorias diferentes. Sin embargo, se debe realizar validación frente a otros métodos de toma de muestras respiratorias para cada población de estudio y el paciente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bronquial absorción (BA)
<ol><li>
Preparación antes del muestreo de BA Nota: BA se realiza por personal especializado en una suite de broncoscopia.<ol>
<li>Antes de colocar el dispositivo de BA por el catéter, compruebe que el SAM está sacando y retirarse hacia el catéter.</li>
		<li>Antes de realizar BA en un paciente, llevar a cabo un simulacro BA en un simulador de broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muestreo de BA
	<ol>
<li>Pasar el broncoscopio en la tráquea y el bronquio principal derecho al nivel del bronquio intermedio, justo proximal a la división en los lóbulos inferiores derecho y medios derecho. Nota: Nosotros normalmente la muestra desde el bronquio intermedio, aunque se pueden degustar otros sitios dentro de la vía aérea. Cuando se observa el catéter y SAM, uno no puede ver la punta del broncoscopio. Observamos los siguientes sencillos pasos para BA, una vez que el broncoscopio ha alcanzado el sitio de muestreo deseado.</li>
		<li>CATÉTER hacia abajo: Insertar el catéter BA a través del canal operativo del broncoscopio hasta que la punta blanca es apenas visible en la vía aérea, hasta un máximo de 1 cm distal al extremo del broncoscopio. Mantener la punta del broncoscopio y el catéter en el centro del lumen de la vía aérea. Tenga cuidado minimizar el contacto entre la punta del catéter y la mucosa bronquial para reducir el riesgo de abrasión de la mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Oprima la manija del dispositivo BA para que el SAM se saca en el lumen de la vía aérea del lóbulo medio o inferior derecho. Bajo visión directa, doblar la punta del broncoscopio para asegurarse de que el SAM está haciendo contacto con la FML en la pared de las vías respiratorias. Deja el SAM dentro de la vía aérea, plana en la pared mucosa de 30 s.</li>
		<li>SAM IN: Mire a través del broncoscopio para asegurar que la sonda SAM húmeda es recta y no doblada hacia atrás sobre el extremo del catéter. Si es necesario, la punta del catéter y broncoscopio puede ser traída detrás para enderezar el SAM. Bajo visión directa, retraerse el SAM recto suavemente hacia el catéter. Nota: Si hay dificultad para retraer el SAM en el catéter, retirar todo el dispositivo con SAM sacó detrás de las vías respiratorias.</li>
		<li>CATÉTER para arriba: Retire el catéter de todo desde el canal operativo del broncoscopio.</li>
		<li>CORTE SAM: SAM se corta con una tijera estéril y luego se pone en un criotubo en hielo. Estas muestras se pueden procesar con métodos diferentes, como se detalla más adelante en este protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. procesamiento de muestras de BA y NA
Nota: Hay muchas opciones para el procesamiento de laboratorio de las muestras resultantes de NA y BA. Estos protocolos pretenden almacenar muestras para su posterior uso y eluir la muestra MLF del SAM.
<ol><li>
Opciones para el manejo inmediato de las muestras NA y BA
	<ol>
<li>Opción 1: Almacenar el SAM húmedo en hielo por unas horas antes de la transformación posterior.</li>
		<li>Opción 2: Inmediatamente congelación NA SAMs de la colección del tubo. Asimismo, congelar a BA SAMs en viales criogénicos después del retiro, con tijeras, desde el dispositivo de muestreo.</li>
		<li>Opción 3: Coloque el SAM separado en tampón de elución (300 μL) antes de procesar directamente o profunda congelación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opciones del tampón de elución para muestras NA y BA Nota: La elección del tampón de elución depende de lo que va a ser analizados en la muestra de la FML y sugerimos cuatro alternativas principales:<ol>
<li>Utilizar un tampón de ensayo preparados adecuado para procedimientos de inmunoensayo. Dichos buffers deben contener una pequeña cantidad de detergente (0.05%) así como de proteína, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) al 1%.</li>
		<li>Como alternativa, utilizar un búfer que contiene una mayor cantidad de detergente, por lo que se produce la lisis celular. Nota: Usamos tampones conteniendo Triton X o NP40 en concentración del 1%. Búferes de lisis celular permiten citoquinas intracelulares y extracelulares se eluyen del SAM, y generalmente resultan en niveles más altos de citoquinas y quimioquinas. Estas reservas también deben contener proteínas y se componen con BSA al 1%.</li>
		<li>Para las mediciones de RNA, como PCR cuantitativa de RNA viral o medición RNA del anfitrión, añadir tampón de extracción de RNA directamente a SAM húmeda. Nota: Tampones de extracción de ARN caotrópico contienen Guanidinio que desnaturaliza las proteínas. Una alternativa es añadir tampón de extracción de RNA al fluido MLF eluído contenido en tampón de lisis de inmunoensayo o celular.</li>
		<li>Utilice solventes orgánicos como el ácido trifluoroacético, para la extracción de lípidos y metabolitos, para evaluación por espectrometría de masas. Nota: Detalles de estos reactivos se incluyen en la sección de materiales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica de elución
	<ol>
<li>Para cualquiera de las anteriores técnicas de elución, inserte el SAM en un tubo de microcentrífuga de 2 mL, junto con el tampón de extracción deseado.</li>
		<li>Vórtice mezcle la muestra durante 30 s para lavar el SAM de fluidos ligeramente acoplados y biomoléculas.</li>
		<li>Para asegurar la recuperación completa de la muestra, realizar elución centrífuga añadiendo el SAM húmedo a una columna mini filtro spin que inserta en el mismo tubo de microcentrífuga de 2 mL utilizado para lavarse. Nota: Pueden utilizarse dos tipos de mini columna de spin filtro. La primera contiene sólo una malla de plástico, que mantiene el SAM en su lugar, que permite la elución completa de fluidos. Por otra parte, si trabaja con materiales infecciosos, utilizar filtros de spin con un tamaño de poro de 0,22 μm. Estos filtros esterilización muestras y son adecuados para las muestras con sospecha de infección por micobacterias. Sin embargo, estos filtros deben ser previamente incubados con buffer, para minimizar el atascamiento de mediadores al filtro por interacciones no específicas.</li>
		<li>Utilizar pinzas esterilizadas para transferir el SAM húmedo al filtro de centrifugado. Cambio de pinzas entre muestras para evitar la contaminación.</li>
		<li>Centrifugar las muestras por 20 min a 16.000 x g en una centrífuga mini enfriado a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de ejemplo Resumen
	<ol>
<li>En el laboratorio, etiquetar 2 mL tubos de microcentrífuga para toma de muestra y añadir el volumen deseado de tampón de elución (normalmente 300 μL de NA; 100 μl de BA). Sello de la tapa y coloque en hielo.</li>
		<li>Muestreo (inmediatamente o en el laboratorio) el SAM es extraído del mango con unas pinzas y colocan en el búfer que contiene el tubo de la colección (producido en el paso anterior). Asegurar la tapa del tubo de microcentrífuga está bien cerrada y transferir las muestras en hielo al laboratorio para su posterior procesamiento.</li>
		<li>Quitar los tubos que contiene tampón SAM y elución de su mezcla transferencia recipiente y agitar durante 30 s.</li>
		<li>Utilizando pinzas estériles, eliminar SAM y colocar en una columna de vuelta (con o sin filtro de acetato de celulosa de 0.22 μm).</li>
		<li>Recoger el tampón de elución del tubo de colección y retener.</li>
		<li>Coloque la columna de spin, con SAM, en el tubo de colección original (o uno nuevo si filtrado estéril de muestras) y añadir tampón de colección para hacer girar la columna. De esta manera, el líquido de lavado pasará a través de la columna de vuelta hacia el tubo de la colección, a fin de eluir la muestra del SAM.</li>
		<li>Centrifugue las muestras con tapas selladas (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Extraer las muestras de la centrifugadora y colocar en un estante.</li>
		<li>Abrir la tapa sellada de los tubos y quite la columna de vuelta con el SAM. Dispone de columna de SAM y exprimido en un recipiente de residuos adecuado.</li>
		<li>Cuidadosamente los tubos alícuota el efluente contenido dentro del tubo en etiquetado criogénico. Registrar el volumen de eluyente y el volumen en cada alícuota.</li>
		<li>Transferir los tubos criogénicos cerrados a un congelador de-80 ° C y conservar en posición vertical hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Resultados de técnicas de muestreo de las vías respiratorias existentes son considerados como altamente variable; técnicas de muestreo alternativos son necesarios para estandarizar la investigación dentro de este campo5. NA BA permiten muestreo de la FML de forma no invasiva y tienen un potencial interesante para medir la respuesta inmune en sanas y enfermas de vías respiratorias. Estas técnicas ofrecen numerosas ventajas potenciales sobre las técnicas existentes, incluyendo una mayor tolerabilidad, velocidad de muestreo, la capacidad para repetir con frecuencia muestreo, menor variabilidad inter-usuario y disminuyeron la dilución de mediadores inmunes5 . La duración de la absorción y la técnica de procesamiento utilizada debe ser optimizada para cada estudio y rigurosamente mantenida entre eventos de muestreo. Además, en el caso de BA, el sitio de muestreo dentro de la vía aérea debe cuidadosamente replicarse entre individuos.
NA y sobre todo BA, son todavía relativamente novedosas técnicas para la investigación clínica. Sin embargo, los beneficios de estas técnicas han resultado de su uso en numerosos estudios, incluyendo validación cuidadosa frente a técnicas alternativas5. Estos dispositivos están disponibles como dispositivos de marcado CE listo para uso generalizado en la investigación respiratoria. Mientras que la NA y BA generar mucho menores volúmenes de muestra de técnicas de muestreo alternativos, mayores concentraciones obtenidas pueden resultar en una mayor sensibilidad para mediadores inmunes de baja abundancia.
Dependiendo de las aplicaciones de bajada deseadas, se pueden congelar directamente muestras NA y BA para posterior tratamiento, mejorar la factibilidad del estudio en un entorno de investigación clínica. El protocolo para el manejo de la muestra también se puede adaptar a aplicaciones particulares aguas abajo. Las técnicas de proceso propuesto pueden ser utilizadas para la colección de proteína o mediadores inmunes lípidos o ácidos nucleicos, pero deben ser optimizadas para cada estudio. En particular, FML puede ser eluido con buffers diferentes. En primer lugar, puede utilizarse buffer de inmunoensayo para medir anticuerpos6,45, mucosa citocinas y quimiocinas. Buffers con mayores niveles de detergente pueden utilizarse también para garantizar se produce lisis celular, permitiendo la inclusión de intracelular citoquinas. Extracción de ARN caotrópico buffers deben utilizarse para la determinación de la infección viral, viral de la carga, anfitrión mRNA y el microbioma. Alternativamente, pueden utilizarse disolventes orgánicos para anti-lípidos y espectrometría de masas.
En conclusión, la absorción directa de la FML de superficies de la mucosa es una técnica apasionante con potencial uso en enfermedades mucosa respiratorias, gastrointestinal, urogenitales y otros. Sin embargo, estas técnicas prometedoras de absorción requerirá validación precisa de muestreo y elaboración técnica para los ensayos individuales (biomarcadores) en cada ajuste de la enfermedad. Además, estas técnicas de muestreo mucosa precisión novela requerirá validación contra las muestras convencionales, como de sangre, aliento y esputo. Con estas técnicas, FML puede utilizarse para medir microbios, citocinas, quimiocinas, prostanoides y anticuerpos.

Mayoría de las enfermedades respiratoria causa una respuesta inflamatoria, y hay una necesidad urgente para el muestreo de la superficie de la mucosa respiratoria en rinitis alérgica, infecciones virales y fúngicas, tuberculosis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, pulmonar fibrosis y pulmón cáncer 1. Aspirado nasofaríngeo (NPA), el lavado nasal y lavado broncoalveolar (BAL) son técnicas comunes para el muestreo de las vías respiratorias superiores e inferiores. Sin embargo, estas técnicas presentan problemas considerables como pobre tolerabilidad, dilución de mediadores inflamatorios y la incapacidad para repetir con frecuencia de muestreo2. Una alternativa para el muestreo de NPA es el uso de hisopos, o nailon floqueado, algodón, o rayón3,4, pero estos también tienen limitaciones, ya que provocan malestar y daño para el epitelio nasal y en algún atascamiento irreversible de casos de mediadores inflamatorios5. Estas técnicas generalmente no pueden ser repetidas en serie más de una hora, y técnicas alternativas pueden ser más eficaces para la detección de baja abundancia citoquinas y quimioquinas5,6. Además, la variabilidad de usuario asociada con estas técnicas puede generar inconsistencias en los datos, dando como resultado la exigencia de grandes cohortes de pacientes.
Alternativomente, técnicas de absorción utilizando esponjas naturales y sintéticos se han utilizado para recoger MLF de superficies de la mucosa. Esponjas oftálmicas compuesto de celulosa natural (e.g., Weck-cel) se han utilizado para muestra saliva, cervical y secreciones vaginales7. Además, esponjas sintéticas de alcohol polivinílico (PVA) y acetato de polivinilo hidroxilado (HPVA) han sido utilizados8. Siete diferentes materiales absorbentes han sido comparados para el muestreo de fluido oral antes de medir anticuerpos9, mientras que mini-esponjas de poliuretano han sido utilizados para recoger lágrimas humanas10.
Papel de filtro de celulosa natural de la planta del algodón ha sido ampliamente utilizado para absorber las secreciones nasales desde el libro pionero de Alam y colegas en 199211,12,13,14, 15,16,17. Discos de papel filtro se han producido desde tarjetas de filtro (por ejemplo, Shandon) y se han utilizado para medir histaminas y citoquinas después de controlado retos alergénicos nasal y con exposición de alergeno natural18,19 ,20,21. Sin embargo, diferentes lotes de papel de filtro varían en su grado de unión a proteínas y algunas no liberan citoquinas. Métodos utilizando una matriz absorbente sintético (SAM), por lo tanto han sido desarrollados2,22,23. Sam ahora se utilizan generalmente para obtener MLF nasal por na Estos materiales absorbentes son cómodos de usar y puede obtener FML incluso de narices inflamadas a intervalos frecuentes durante largos períodos de tiempo.
Absorción nasal es una forma de toma de muestras de mucosa precisión utilizando un SAM para el muestreo de la FML en la vía aérea superior. NA dispositivos se fabrican como dispositivos médicos-marcado CE de materiales de grado médico, con habitaciones limpias y libres de polvo y alérgenos. El sampler de NA consiste en una manija y SAM en un criotubo estéril. El SAM consiste en polímeros, típicamente de las fibras, pero también está disponible como espuma y estas son seleccionadas para ser suave y absorbente, con rápido drenaje para recolección de muestras. Sam tienen Unión a proteínas mínimo para permitir la elución eficiente de absorberlos secreciones. NA es una técnica muy suave, no invasiva que puede realizarse en los donantes de todas las edades. Además, serie muestra, incluso cada pocos minutos, es posible. NA ha sido validado contra la vía aérea superior existente5 de técnicas de muestreo y muestreo repetitivo ha permitido la generación de datos cinéticos siguiendo el reto de la vía aérea con alérgeno23,24,25, 26 de la endotoxina bacteriana y viral tipo TLR agonistas (Jha, a. et al., manuscrito en preparación). NA también se ha utilizado en los niños a investigar la historia natural de atopia27,28,29 y en bronquiolitis viral30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) es un procedimiento para la recolección de la FML en la vía aérea inferior que ha sido desarrollada por Olympus31,32,33. Desafortunadamente, este sistema BMS está autorizada sólo en Japón. Olympus fuente dos sistemas BMS: uno con un poliéster hidroxilado fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, y con un algodón probe33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. un gran obstáculo ha sido que la sonda BMS utilizada en pacientes con asma causado contacto mucosa, sangrado, con la mitad de todas las muestras contaminadas con sangre. Los autores concluyeron que no era factible muestra MLF usando este sistema BMS de vías aéreas periféricas en pacientes de asma43.
Como alternativa, hemos desarrollado BA con un SAM suave que se puede realizar durante la investigación bronchoscopic de las vías respiratorias inferiores, incluyendo después de la infección experimental de sujetos asmáticos con rinovirus6. El dispositivo BA consta de: un catéter hueco externo, una pieza de mano que en la activación permite extruir el SAM y un alambre de guía plástico central que tiene el SAM en su extremo. NA, kits de BA están fabricados de materiales de grado médico, con habitaciones limpias y libres de polvo y alérgenos. Además, los dispositivos son CE marcado y reciben gamma irradiadas. La banda de SAM es suave, absorbente y tiene rápido wicking para recogida de muestras. También tiene Unión a proteínas mínimo para permitir la elución eficiente de absorberlos secreciones. El dispositivo puede caber por el canal de trabajo de un broncoscopio y se puede utilizar para rápidamente y exactamente la muestra FML en sitios específicos de interés dentro de la vía aérea. A diferencia de BAL o BMS, BA no resulta en sangrado contacto o malestar adicional del paciente posterior al procedimiento.
Debe prestar cuidadosa atención al procesamiento de las muestras NA y BA. Las muestras pueden estar directamente congelados y procesados en lotes o se pueden procesar inmediatamente. El tipo de procesamiento puede ser adaptado hacia ciertas aplicaciones posteriores, incluyendo inmunoensayos para citoquinas, quimiocinas e inmunoglobulinas o elutions de viral, bacteriana, y célula huésped asociado RNA. Presentamos la colección clínica y laboratorio de técnicas de procesamiento asociadas a NA y BA como una guía para los investigadores clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

Los métodos de absorción nasal (NA) y absorción bronquial (BA) utilizan matrices absorbentes sintéticos (SAM) para absorber el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) del tracto respiratorio humano. NA es una técnica no invasiva que absorbe el líquido desde el cornete nasal inferior y causa mínimas molestias. NA ha rendido resultados reproducibles con la capacidad de repetir con frecuencia el muestreo de las vías respiratorias superiores.
En comparación, otros métodos de muestreo de la mucosa respiratoria, como aspiración nasofaríngea (NPA) y vajillas convencionales, son más invasivos y pueden resultar en una mayor variabilidad de los datos. Otros métodos tienen limitaciones, por ejemplo, biopsias y procedimientos bronquiales son invasivos, esputo contiene muchos muertos y muriendo las células y requiere licuefacción, condensado de aire espirado (EBC) contiene agua y saliva y lavado las muestras son diluidas y variable.
BA se puede realizar a través del canal de trabajo de un broncoscopio en la clínica. El muestreo es bien tolerado y puede llevarse a cabo en múltiples sitios en la vía aérea. BA los resultados en muestras MLF siendo menos diluida que las muestras del lavado (BAL) broncoalveolar.
Este artículo demuestra las técnicas de NA y BA, así como el procesamiento de laboratorio de las muestras resultantes, que puede ser adaptada al deseada biomarcador aguas abajo se mide. Estas técnicas de absorción son alternativas útiles para las técnicas convencionales de muestreo utilizadas en la investigación clínica respiratoria.

NA se ha utilizado en un número de estudios para la fácil y no invasiva medir inflamación mucosa. Después de la administración del alergeno a la nariz, se observan niveles de prostaglandina-D2 (PGD2) que suben y bajan en minutos (figura 1), en consonancia con la degranulación de mastocitos (Thwaites et al., manuscrito en preparación). Además, los mediadores de la inflamación de tipo II, como IL-5 (figura 2, reimprimido con permiso de 24), pueden medirse en las horas siguientes alérgenos nasal reto23,24. En la infección experimental de asmáticos alérgicos y controles sanos, NA se utilizó para medir un grupo de mediadores, incluyendo el interferón-gamma (IFN-γ), en el transcurso de 7 días (figura 3, reimprimido con permiso de 6). Además, en la infección natural virus sincitial respiratorio (VSR) de los recién nacidos, NA demostrado RSV para asociarse con niveles elevados de citoquinas inflamatorias, tales como IFN-γ, en relación con la RSV no lactantes con bronquiolitis y controles sanos ( Figura 4, reimpreso con permiso de 30). Curiosamente, esta discriminación entre RSV y bronchiolitis de RSV no no fue significativa en muestras NPA tiempo comparable (figura 4).
BA también fue utilizado durante la infección experimental de asmáticos alérgicos con rinovirus. En el día 4 de infección por rinovirus, los niveles de IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 fueron elevados desde el inicio (figura 5; A, B, C y D, respectivamente). Además, esta técnica demostró niveles elevados de IL-5 en el inferior de las vías respiratorias de asmáticos alérgicos durante la infección por rinovirus, en comparación con controles sanos (figura 5) (figura 5 reimprimido con permiso de 6).
Se obtuvieron estos resultados representativos de muestras eluidas utilizando tampón de ensayo que contenga 0.05% Tween-20 y 1% BSA (véase Tabla de materiales).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Rápida generación y separación de prostaglandina-D2 después de desafío alergénico nasal. Los niveles de prostaglandina-D2 (PGD2) midieron de eluatos de absorción nasal en muestras seriales después de desafío alergénico nasal con polen de pasto Timothy (n = 5). Cada línea representa los datos de un individuo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Medición cinética de IL-5 después de desafío alergénico nasal. Producción de IL-5 en muestras de absorción nasal serial después de desafío alergénico nasal. Tres repetición estudios de desafío alergénico se llevaron a cabo, con los participantes (n = 19) recibieron placebo (azul), baja dosis (10 mg) oral prednisona (naranja), o prednisona oral de altas dosis (25 mg) (rojo) una hora antes de la administración del alergeno. Las líneas denotan la media geométrica y barras de error son intervalos de confianza del 95% de todos los participantes. (Figura reimpreso con permiso de perdidas et al., Inmunología Mucosal, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Inducción de interferón-γ durante la infección por rinovirus. Durante la infección de adultos sanos (n = 11, azul) y asmáticos alérgicos (n = 28, rojo) con rinovirus-16, muestreo de la absorción nasal se utilizó para medir los niveles de interferón-γ (IFN-γ). Los datos se representan como parcelas A) crudo spaghetti de individuos y niveles B) medianos con barras de error que indica rangos intercuartil. (Figura reimpreso con permiso de Hansel et al. 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina interferón-γ elevada asociada a infección por RSV de los recién nacidos. Absorción nasal y aspiración nasofaríngea (NPA) fueron utilizados para medir los niveles de interferón-γ en lactantes con bronquiolitis asociada con infección por virus sincicial respiratorio (VSR) (rojo, n = 12), un patógeno respiratorio RSV no (verde, n = 12) y saludable controles (azul, n = 9). Los datos se analizaron con una prueba de Kruskall-Wallis Dunn corrección para comparaciones múltiples (***p< 0,001). Líneas denota valores medianos y barras de error son rangos intercuartil. (Figura modificada con permiso de Thwaites et al. 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediadores inflamatorios en muestras bronquiales absorción durante la infección por rinovirus. Después de la infección de rinovirus 16 de controles sanos (n = 10, azul) y voluntarios asmáticos alérgicos (n = 23, rojo), absorción bronquial fue utilizada para medir el nivel de A) IFN-γ, B) CXCL11, C) IL-10 y D) IL-5 al inicio del estudio y el día 4 de la infección. Datos analizados por Wilcoxon firmaron prueba rank (emparejadas muestras) y test de Mann-Whitney (muestras sin igual). Figura reimpreso con permiso de Hansel et al. 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Este manuscrito describe el uso de técnicas de absorción nasal y bronquial, específicamente utilizando matrices absorbentes sintéticos (SAM) para el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) de la vía aérea superior e inferior de la muestra. Estos métodos proporcionan mejor estandarización y tolerabilidad que técnicas de muestreo respiratorias existentes.

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

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29.2K vistas.  St Mary's Hospital. Este manuscrito describe el uso de técnicas de absorción nasal y bronquial, específicamente utilizando matrices absorbentes sintéticos (SAM) para el líquido de la mucosa de revestimiento (MLF) de la vía aérea superior e inferior de la muestra. Estos métodos proporcionan mejor estandarización y tolerabilidad que técnicas de muestreo respiratorias existentes.

Video: Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Investigación

Medicina

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodología para la inducción de esputo y el procesamiento de laboratorio

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

Gerencia de laboratorio remoto: Diagnóstico de Virus Respiratorio de la

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

A Traditional Chinese Medicine Characteristic Therapy for Bronchial Asthma: Moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest tightness, or cough, as a result of increased airway reactivity. With high diurnal variation, these symptoms often occur or worsen at night or in the morning. By burning and roasting the Chinese medica above human acupoints, moxibustion is a type of treatment that stimulates the activity of the human meridians through drugs and heat stimulation to prevent and treat diseases. According to the principle of syndrome differentiation and treatment of traditional Chinese medicine, acupoints are selected on the corresponding parts, which has a definite effect. It is regarded as a characteristic traditional Chinese medicine therapy for bronchial asthma. This protocol elaborates the methods and steps of patient management, material preparation, selection of acupoints, operation, and postoperative nursing to ensure safe and effective moxibustion treatment to significantly improve the clinical symptoms and quality of life of patients with bronchial asthma.

This protocol presents a curative procedure of moxibustion in treating patients with bronchial asthma.

Una terapia característica de la medicina tradicional china para el asma bronquial: la moxibustión

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest ...

Captura de muestras de tejido de fibrosis submucosa oral para análisis espacial-ómico

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor destacado: Desvelando los misterios de las posibles neoplasias malignas orales 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Aislamiento de Células con Información Morfológica y Espacial a partir de Muestras de Fibrosis Submucosa Oral mediante Microdisección por Captura Láser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...