Expresamos nuestro agradecimiento a los niños y las familias del estudio de cohorte de2010 COPSAC por todo su apoyo y compromiso. Reconocemos y apreciamos los esfuerzos únicos del equipo de investigación COPSAC y la ayuda técnica de técnico Lisbeth Buus Rosholm, Universidad técnica de Dinamarca, para la medición de citoquinas y quimioquinas.

Los estudios se llevaron a cabo con arreglo a los principios rectores de la declaración de Helsinki. Se obtuvieron las aprobaciones del Comité de ética de Copenhague (KF 01-289/96 COPSAC2000 ) y H-B-2008-093 COPSAC2010y la Agencia de protección de datos de danés, y se obtuvo consentimiento informado de ambos padres de cada sujeto antes de la inscripción.
1. experimental configuración
<ol>
	<li>Utilizar hojas de papel de filtro (fibrosas hojas de poliéster hidroxilados, véase la Tabla de materiales)6,7.<ol>
		<li>Corte tiras de 3 x 15 mm en tamaño para un niño de 1 mes y en forma de L para los niños mayores y adultos (5 x 20 x 10 mm (brazo corto de la L)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inserte un pedazo de papel de filtro en cada fosa nasal de un niño con unas pinzas. Coloque el papel de filtro en la parte anterior del cornete inferior (aproximadamente 1 cm dentro de la fosa nasal en neonatos y 1,5 cm para todas las otras edades).<ol>
		<li>Lugar de recién nacidos en una cama y darles agua con azúcar para mayor comodidad. Nota: Para los niños de otras edades, el muestreo se realiza más fácilmente con el sujeto sentado en una silla.</li>
		<li>Para niños mayores, inserte el brazo largo del papel de filtro en forma de L en cada fosa nasal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aplicar un clip de la nariz alrededor de las fosas nasales para minimizar el malestar y evitar la pérdida accidental del papel de filtro.</li>
	<li>Retirar los papeles de filtro después de 2 minutos de la absorción.</li>
	<li>Coloque los papeles de filtro en tubos etiquetados y congelarlas inmediatamente a-80 ° C.</li>
	<li>Tome nota de cualquier síntoma de infección de la vía aérea, demostrado por el niño en el día de muestreo.</li>
	<li>Grabar cualquier estornudo, llanto persistente o epistaxis que ocurre durante los 2 minutos de muestreo.</li>
</ol>
2. cuantificación de las vías respiratorias inmune-mediadores
<ol>
	<li>Tomar hasta 10 muestras al azar del congelador. Registrar los números de identificación. Mantener las muestras en hielo durante todo el proceso de trabajo.</li>
	<li>Después de descongelar el hielo, sumergir los papeles de filtro (por tema) de ambos orificios nasales en 300 μL de recién preparado tampón (véase la Tabla de materiales) que contienen una completa proteasa inhibidor de la tableta (véase la Tabla de materiales) por cada 25 mL de tampón.<ol>
		<li>Ajustar el volumen de tampón según el tamaño del papel de filtro.<ol>
			<li>Utilizar 300 μL de tampón para papeles de filtro 3 x 15 mm de tamaño.</li>
			<li>Si sólo hay un papel de filtro, use la mitad del volumen de buffer (150 μL).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transferir las muestras a un vibrador de placa (400 rpm) por 5 min uso un temporizador.</li>
	<li>Transferir el papel filtro húmedo y tampón de ensayo en la taza de un filtro de tubo de acetato de celulosa (tamaño de poro de 0,22 μm) en una microcentrífuga del tubo (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Centrifugar a 16.000 x g por 5 min en una centrífuga refrigerada (a 4 ° C) para obtener el extracto filtrado nasal en el tubo.</li>
	<li>Retire la taza y mantener los tubos en hielo mientras tomar el extracto de la nasal en los pocillos de las placas de almacenamiento de unión a proteínas de baja (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Almacenar a-80 ° C hasta su análisis.</li>
	<li>Determinar las concentraciones de citoquinas y quimioquinas en los extractos nasales usando un sistema de alta sensibilidad, basado en electrochemiluminesce arreglo multiplexados (véase la Tabla de materiales). Nota: Un humano 10-plex TH1/TH2 cytokine ensayo, ensayo de chemokine 9-plex y plex solo IL-17A, TGF-β1 y TSLP se realizaron aquí.<ol>
		<li>Para los ensayos, incubar los extractos nasal durante la noche a 4 ° C. Realizar las medidas por el fabricante estándar protocolo (véase la Tabla de materiales). Nota: Los inmunoensayos (véase la Tabla de materiales) tienen un alto rango dinámico de medición entre 1 &#38; 10.000 pg/mL, pero para algunos ensayos, puede ser 100 000 pg/mL. Esto significa que todas las muestras se pueden ejecutar en la misma dilución, limitando la influencia de las diferentes diluciones en sujetos sanos y enfermos, como es el caso en otros inmunoensayos similares. El límite inferior de detección para todas las citocinas era 1 pg/mL o menos y de quimiocinas, osciló entre 1 &#38; 50 pg/mL. TSLP no era perceptible en el 98% de las muestras en 1 mes de edad.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. estadísticas
<ol>
	<li>Transformación de registro de los datos antes del análisis para obtener residuos distribuidos normalmente de los niveles de citoquinas y quimioquinas.</li>
	<li>Si las muestras son analizadas en más de un lote, corregir los datos de citoquinas y quimioquinas para batch-wise que se centra en los datos de registro-transformada.<ol>
		<li>Incorporar la media general y registro de la transformación para obtener datos en las unidades originales de medición. Nota: Para cada conjunto de análisis realizados, Plantéese ajustar las variables que afectan el nivel de citoquinas y quimioquinas. Esto podría ser influencias maternas (p. ej., consumo de alcohol y fumar durante el embarazo), lactancia materna, los eventos adversos durante el muestreo, hermanos, mascotas en el hogar, etc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. 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L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+unchallenged+levels+of+mediators+in+nasal+epithelial+lining+fluid.">A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid.</a> J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+colonizing+the+airways+in+asymptomatic+neonates+stimulates+topical+inflammatory+mediator+release.">Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

Todos los autores no declaran potencial, percibida o real conflicto de intereses en relación con el contenido de este manuscrito. Las agencias de financiamientos no tuvo ningún papel en el diseño y realización del estudio; la recopilación, gestión e interpretación de los datos; o la preparación, revisión y aprobación del manuscrito. Ninguna empresa farmacéutica ha participado en el estudio.

Con la técnica presentada aquí, hemos sido capaces de determinar el en vivo vías respiratorias superiores mucosa inmune perfil en niños desde 1 mes de edad, que no se ha hecho previamente. Observamos que esa presencia de bacterias de las vías respiratorias específicas picornavirus7,11, así como pre y otras exposiciones perinatales, se reflejaron en el perfil inmune de las vías respiratorias de los recién nacidos. Además, utilizamos estos datos ...

El líquido de revestimiento mucosa de la nariz es la parte líquida del sistema de vías respiratorias superiores. Consiste en una matriz compleja de mediadores derivados de la interacción entre el epitelio y las células inmunes que conforman la primera línea de defensa contra la invasión de microorganismos. La mucosa nasal es fácilmente accesible, y hay una fuerte relación funcional e inmunológica entre la nariz y los bronquios1. Este compartimiento es de especial interés en relación con enfermedades de las vías respiratorias que son comunes en la infancia, como el asma y la rinitis alérgica, pero también a una gama de otros desordenes respiratorios más frecuentes más tarde en la vida.
Aquí, describimos la aplicación de un método a la muestra mucosa de revestimiento líquido de la cavidad nasal mediante una técnica no invasiva basada en papel de filtro, así como un procedimiento posterior extracción, utilizados a fin de eluir analitos basados en proteína de los papeles de filtro antes de su cuantificación. Esta técnica puede, por ejemplo, se solía obtener en vivo firmas inmunes de individuos sanos e individuos con enfermedades respiratorias diversas. Además, es posible examinar la exposición de la importancia de una firma inmune específica y evaluar si es un predictor o mediador del desarrollo posterior de la enfermedad.
Mucosa revestimiento líquido previamente se ha obtenido por lavado nasal2, que a menudo es precedido por una prueba de reto nasal, donde se introduce un alérgeno en niveles altos para estimular una respuesta inflamatoria3,4. Sin embargo, la técnica de lavado nasal no es factible en niños y presenta un factor de dilución desconocido, que confunde los resultados, como el mediador diluido los niveles pueden caer por debajo del límite de detección del ensayo5. Por otra parte, debido al factor de dilución desconocido, las respuestas del analito medido de las pruebas de reto nasal no son comparables entre los individuos, limitando la utilidad de la técnica de lavado nasal en una cohorte de ajuste. Finalmente, reto alergénico es solamente aplicable en sujetos sensibilizados, y otros desafíos, como el desafío de histamina, no son fisiológicamente relevantes, potencialmente causando un efecto de techo en la liberación del mediador. Estos problemas son eludidos en la técnica presentada en papel de filtro para guarnición mucosa acumulación de líquido, donde la secreción individual de líquidos y niveles de analito son los únicos factores que influyen en la variación interindividual.
Durante el procedimiento de extracción, los analitos se eluyen de los papeles de filtro después de la adición de idénticos volúmenes de buffer para todas las muestras. Esto favorece la dilución similares ex vivo de todas las muestras. Un tampón de extracción de solución salina isotónica base de albúmina se utiliza para el paso de extracción; permite la extracción de mediadores proteínicos y estabiliza las proteínas para limitar desnaturalización durante el subsecuente congelamiento de proteínas eluídas antes de la cuantificación. Para evitar la degradación de las proteínas durante la fase de extracción, un cóctel de inhibidores de la proteasa se añade el tampón de extracción.
La aplicación de técnicas que permiten la cuantificación de no perturbados, en vivo-mediadores inmunes generados en sitios de la mucosa es de suma importancia. En primer lugar, el sitio de la mucosa constituye el órgano inmunológico más grande en el cuerpo. En segundo lugar, la ubicación nasal es el sitio primario de la exposición aerotransportada y está firmemente conectada al compartimiento inmunológico respiratorio de los pulmones1. En tercer lugar, la posibilidad de examinar este importante órgano con una técnica no invasiva abre la posibilidad para proporcionar una gran cantidad de información en el eje de interacción microbio-inmune importante en relación con la salud y la enfermedad de las vías respiratorias. En cuarto lugar, hay muchas otras posibles aplicaciones de esta técnica, como el estudio de alteraciones inmunológicas locales en ensayos controlados aleatorios de fármacos y micronutrientes.
Inicialmente hemos implementado la técnica en los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) de la infancia, donde se determinó el perfil inmune de mucosa revestimiento líquido en niños de 7 años de edad con rinitis alérgica versus controles sanos13. Posteriormente, hemos aplicado con éxito esta técnica longitudinal cohorte2010 de COPSAC y perfiles inmune vía aérea cuotas en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Resultados de los neonatos de 1 mes de edad han demostrado asociaciones importantes entre la firma inmune y la exposición ambiental vida temprana7,8,9,10,11,12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

Este protocolo describe el muestreo no invasivo del líquido de revestimiento mucosa vía aérea superior. También detalla el procedimiento de extracción utilizado antes el análisis de mediadores inmunes en eluídos de fluido para el estudio de la firma inmune tópica vía aérea, sin la necesidad de procedimientos de estimulación (de uso frecuente por otras técnicas). El líquido de revestimiento mucoso se muestrea en una tira de papel de filtro colocado en la parte anterior del cornete y a la izquierda por 2 min de absorción inferior. Los analitos se eluyen de los papeles de filtro, y el eluatos basados en proteínas extraídas son analizadas por un inmunoensayo basado en electrochemiluminescence, teniendo en cuenta la alta sensibilidad cuantificación de analitos de bajo y alto nivel en la misma muestra. Medimos los niveles de en vivo de 20 preseleccionados mediadores inmunes relacionadas con inmune específico señalización de vías en la mucosa de las vías respiratorias superiores, pero la técnica no se limita a ese grupo específico o sitio de muestreo. La técnica se implementó por primera vez en niños de 7 años de los estudios prospectivos de Copenhague sobre el asma en cohorte de2000 (COPSAC2000) infancia con rinitis alérgica. Después de eso fue utilizada en la longitudinal COPSAC2010 cohorte, muestreada en 1 mes, 2 años y 6 años de edad y en casos de síntomas respiratorios agudos. Con éxito obtuvieron y analizaron muestras de 620 (89%) de 700 niños de 1 mes de edad, algunas muestras fueron por debajo del límite de detección del ensayo (reportado como mediana (rango del intercuartil (IQR)). El número de muestras por debajo del límite de detección (es decir, desde 0 hasta el punto de set para el límite inferior de detección) para cada mediador fue 29 (7.25-119.5). Esta técnica permite la cuantificación de la vivo en perfil inmune mucosa de las vías respiratorias desde el nacimiento, puede ser aplicada longitudinalmente y puede ser aplicada a estudios sobre el efecto de la genética y vida temprana exposición a riesgos ambientales, Fisiopatología, endotyping y seguimiento de enfermedades respiratorias, desarrollo y evaluación de nuevos tratamientos.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 sample...

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

noninvasive-sampling-mucosal-lining-fluid-for-quantification-vivo

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Immunology and Infection

Unit 1

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

10.1K vistas.  University of Copenhagen. Este protocolo describe una técnica no invasiva para la toma de muestras del líquido guarnición mucosa de las vías aéreas superiores. Puede ser utilizado para realizar la cuantificación de en vivo los niveles de mediadores de la proteína, tales como citoquinas y quimioquinas, en sujetos de todas las edades.

Video: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

Cuantificación de la aterosclerosis en ratones

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...