Fonlama: Bu eser imparatorluk Ulusal Enstitüsü Sağlık Araştırma (NIHR) Biyomedikal Araştırma Merkezi (BRC için) NIHR sağlık koruma araştırma birimi (HPRU) anda Imperial College London'da solunum yolu enfeksiyonları içinde ortaklaşa finansman tarafından desteklenen Halk sağlığı İngiltere (PHE) ve NIHR imparatorluk hasta güvenliği translasyonel araştırma merkezi ile. Görüşler yazarlar ve ille bu NHS, NIHR, Sağlık Bakanlığı veya halk sağlığı İngiltere vardır.

Aşağıdaki protokolünde kullanılan teknikleri Batı Londra araştırma Etik Komitesi (referans numarası 15/lO/0444) tarafından onaylanmış olması.
1. burun emme (NA)
<ol><li>
NA örnekleme öncesi hazırlık
	<ol>
<li>Ne zaman NA taşıma, önce ellerinizi yıkayın ve eldivenler, tercihen hastanın önünde koymak.</li>
		<li>Kafa bir meşale kullanarak burun boşluğuna inceleyin ve klinisyen hastanın burun burun boşluğuna görselleştirmek için geri çekmek için onların baskın başparmak kullanın sahip. Not: Burun bir spekulum genellikle gerekli değildir.</li>
		<li>Burun boşluğuna ve aşağı örnekleme önce konka görselleştirin. Not: Siklikla (burun) kesit içinde yuvarlak değildir ve düz geriye doğru gidiyorlar. Genellikle, alt konka bir şişkinlik ya da burun lateral duvarındaki girinti olarak görülebilir nazal septum ile düz, düz medial duvarı şekillendirme. Temel epitel solunum yolu44basit bir siliyer epitel olduğundan örnek bu alt konka, istiyoruz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA örnekleme
	<ol>
<li>Örnekleme zaman NA konka inferior karşı düz olmasını süsleme SAM yavaşça burun deliği, lumen başarılı.</li>
		<li>SAM nazal mukoza üzerine basılacak bir işaret parmağı kullanmak için donör sor. NA MLF emilir gibi bir hafif, olası göz sulama ile gıdıklama neden olabilir. Not: Yetişkinlerde, biz genellikle NA 60 için gerçekleştirmek s.</li>
		<li>MLF emilimini sonra burun deliği NA aygıtı kaldırın ve özgün tüpün içine geri koy.</li>
		<li>Laboratuvar hemen örneklerinde işlemek veya onları, bu iletişim kuralını, daha sonra detaylı olarak dondurma. Not: NA nazal Mukozal meydan modelleri çeşitli ve farklı airways hastalıkları incelenmiştir. Ancak, diğer solunum örnekleme yöntemleri dayalı doğrulamayı her çalışma ve hasta popülasyon için yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bronşiyal emme (BA)
<ol><li>
BA örnekleme öncesi hazırlık Not: BA Bronkoskopi paketindeki uzman personel tarafından gerçekleştirilir.<ol>
<li>Kateter BA aygıtı yerleştirmeden önce SAM ekstrüzyon ve kateter geri çekilmesi emin olun.</li>
		<li>Bir hastaya BA gerçekleştirmeden önce sahte BA Bronkoskopi simülatör davranış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BA örnekleme
	<ol>
<li>Trakea ve sağ ana bronş aşağı bronkoskop bronş intermedius, sadece sağ alt ve sağ orta LOB lige proksimal seviyesine geçmek. Not: hava yolu diğer sitelerle tatmak mümkündür rağmen genellikle bronş intermedius, örnek. Kateter ve SAM gözlemleyerek, bir bronkoskop ucunu göremiyorum. Bronkoskop istenen örnekleme sitesi ulaştı bir kez biz BA için aşağıdaki basit adımları izlemek.</li>
		<li>Kateter aşağı: beyaz ucu sadece hava yolu, en fazla 1 cm bronkoskop sonuna kadar distal görünene kadar bronkoskop çalışma kanalından BA kateter takın. Bronkoskop ve kateter ucu hava yolu Lümen ortasında tutun. Kateter ucu ve aşınma mukoza için riskini azaltmak için bronş mukoza arasında teması en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
		<li>SAM OUT: Böylece SAM sağ orta veya sağ alt LOB hava yolu Lümen kalıptan çekilmiş BA aygıt tanıtıcısı düşürmek. Direkt görüş altında SAM hava yolu duvardaki MLF ile temas ediyor emin olmak için bronkoskop ucu viraj. SAM hava yolu içinde 30 Mukozal duvara düz bırakmak s.</li>
		<li>SAM inç: nemli SAM sonda düz ve değil bükülmüş sonuna kateter üzerinde olduğundan emin olmak için bronkoskop bakın. Gerekirse, kateter ve bronkoskop ipucu SAM düzeltmek için geri getirilebilir. Direkt görüş altında düz SAM yavaşça geri kateter geri çek. Not: SAM geri kateter geri çeker zorluk ise, tam aygıt SAM ile geri geri hava yolu dışında kalıptan çekilmiş.</li>
		<li>Kateter kadar: tüm kateter bronkoskop çalışma kanalından geri alıyorum.</li>
		<li>: SAM SAM steril makasla kesip kesip sonra bir cryotube buza koy. Bu örnekler bu protokolündeki daha sonra detaylı olarak değişen yöntemleri ile işlenebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. NA ve BA örnekleri işleme
Not: NA ve BA kaynaklanan örneklerinin laboratuvar işleme için çok sayıda seçenek vardır. Bu iletişim kuralları örnekleri daha sonra kullanmak üzere depolamak ve Sam MLF örnek elute için arıyorum.
<ol><li>
NA ve BA örnekleri hemen işleme seçenekleri
	<ol>
<li>Seçenek 1: nemli SAM daha fazla işleme önce bir kaç saat için buza saklayın.</li>
		<li>Seçenek 2: Hemen NA SAMs koleksiyonu derin dondurucu tüp. Benzer şekilde, kriyojenik şişeleri BA SAMs makas, örnekleme cihazı ile kaldırıldıktan sonra dondur.</li>
		<li>Seçenek 3: Müstakil SAM dondurucu doğrudan ve derin işleme öncesinde elüsyon arabellek (300 µL) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA ve BA örnekleri için elüsyon arabellek seçenekleri Not: MLF örnekte çözümlenmesi için neler olduğunu elüsyon arabellek seçim bağlıdır ve dört ana alternatifler öneririz:<ol>
<li>İmmunoassay yordamlar için uygun bir önceden hazırlanmış tahlil arabellek kullanın. Böyle arabellekleri deterjan (% 0.05) az miktarda protein, Örneğin, sığır serum albumin (BSA) % 1 yanı sıra içermelidir.</li>
		<li>Böylece hücre lizis oluşur alternatif olarak, deterjan, daha büyük bir miktarı içeren bir arabellek kullanın. Not: Triton-X veya NP40% 1 konsantrasyonu içeren arabellekleri kullanıyoruz. Hücre lizis arabellekleri SAM eluted ve genellikle daha yüksek düzeyde sitokinler ve kemokinler sonuç hücre içi ve hücre dışı sitokinler etkinleştirin. Bu arabellekleri aynı protein içermelidir ve BSA ile % 1'e yapılır.</li>
		<li>Gibi kantitatif PCR viral RNA veya ölçüm ana bilgisayar RNA, RNA ölçümler için doğrudan nemli SAM'a RNA ayıklama arabellek ekleyin. Not: Chaotropic RNA ayıklama arabellekleri proteinler denatures guanidinium içerir. İmmunoassay veya hücre lizis arabellekte bulunan eluted MLF sıvı RNA ayıklama arabellek eklemek için bir alternatiftir.</li>
		<li>Trifluoroacetic asit gibi organik çözücüler lipidler ve metabolitleri, kütle spektrometresi tarafından değerlendirilmesi için çıkarım için kullanın. Not: Tüm bu ayıraçlar ayrıntılarını malzemeler bölümünde yer almaktadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elüsyon tekniği
	<ol>
<li>Herhangi yukarıdaki elüsyon teknikleri için istenen ekstraksiyon arabellek ile birlikte 2 mL mikro-santrifüj tüpü SAM takın.</li>
		<li>Girdap karışımı 30 için örnek s SAM gevşek bağlı sıvı ve biomolecules yıkamak için.</li>
		<li>Tam örnek malın güvenliğini garantiye almak için nemli SAM yıkamak için kullanılan aynı 2 mL mikro-santrifüj tüpü ekler spin filtre Mini sütun ekleyerek santrifüj elüsyon gerçekleştirin. Not: İki tür spin filtre Mini sütun kullanılabilir. İlki sadece bir plastik kafes, hangi SAM yerinde tutan, sıvı dolu elüsyon izin içerir. Alternatif olarak, eğer bulaşıcı malzemeleri ile çalışma, 0,22 µm gözenek boyutu ile spin filtreleri kullanın. Bu filtrelerin örnekleri sterilize ve örnekleri ile şüpheli Mikobakteriyel Enfeksiyon için uygundur. Ancak, bu filtreleri ile arabellek bağlama filtresi arabulucu tarafından non-spesifik etkileşim en aza indirmek için önceden inkübe olmalıdır.</li>
		<li>Steril forseps nemli SAM spin filtre aktarmak için kullanın. Forseps kontaminasyonu önlemek için örnek arasında değiştirin.</li>
		<li>Mini santrifüj 16.000 x g de 20 dk santrifüj örnekleri 4 ° C'ye soğutmalı</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Özet örnek Protokolü
	<ol>
<li>Laboratuvarda, 2 mL mikro-santrifüj tüpleri örnek koleksiyonu için etiket ve elüsyon Arabellek istenen hacmi ekleyin (NA için; genellikle 300 µL BA için 100 µL). Kapağı kapatın ve Buza koyun.</li>
		<li>(Hemen veya laboratuarda) SAM örnekleme takip forseps kullanarak tanıtıcıdan kaldırılır ve toplama tüp (önceki adımda üretilen) içeren arabellek içine yerleştirilir. Microcentrifuge tüp kapağı güvenli bir şekilde kapatılır ve örnekleri, buz, işlenmesi için laboratuvar aktarmak olun.</li>
		<li>SAM ve elüsyon arabelleğinden 30 için onların transferi konteyner ve girdap karışımı içeren tüpler kaldırın s.</li>
		<li>Steril forseps kullanarak, SAM kaldırmak ve bir spin sütununa (veya 0,22 µm selüloz asetat filtre olmadan) yerleştirin.</li>
		<li>Koleksiyon tüpünden elüsyon arabellek toplamak ve muhafaza.</li>
		<li>SAM ile spin sütun özgün koleksiyonu tüpte yerleştirin (veya steril filtreleme Eğer yeni bir örnek) ve koleksiyon arabellek sütun dönmeye ekleyin. Bu şekilde, yıkama sıvısı içinde spin sütun Sam örnek elute için yardımcı geri toplama tüp içine geçecek.</li>
		<li>Örnekler santrifüj kapasitesi ile kapalı kapakları (16.000 x g, 20 dk, 4 ° C).</li>
		<li>Örnekler santrifüj çıkarın ve bir raf yerleştirin.</li>
		<li>Tüplerin kapalı kapağını açın ve SAM içeren spin sütun kaldırmak. SAM ve spin sütununda uygun bir atık konteyner atın.</li>
		<li>Dikkatle tüpün içine içinde bulunan eluate kriyojenik etiketli aliquot tüpleri. Eluate hacmi ve birimin her aliquot kaydedin.</li>
		<li>Mühürlü kriyojenik tüpler-80 ° C dondurucu aktarın ve dik kadar kullanmak depolayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut hava yolu örnekleme teknikleri sonuçlarından son derece değişken olarak kabul edilmektedir; Alternatif örnekleme teknikleri araştırma içinde bu alan5standart hale getirmek için ihtiyaç vardır. NA ve BA MLF örnekleme non-invaziv bir şekilde izin ve sağlıklı ve hastalıklı airways bağışıklık yanıtları ölçmek için heyecan verici bir potansiyele sahip. Bu tekniklerin daha büyük tolerabilite, örnekleme hızı, örnekleme, sık sık tekrarlamak için yeteneği dahil olmak üzere varolan teknikleri üzerinde çok sayıda potansiyel avantajları arası kullanıcı değişkenliği daha düşük teklif ve seyreltme bağışıklık arabulucu5 azaldı . Emme ve işleme tekniği kullanılan süresi her çalışma için en iyi duruma getirilmiş ve titizlikle örnekleme olaylar arasında yapılmaktadır. Ayrıca, söz konusu olduğunda BA, örnekleme hava yolu içinde sitenin dikkatle bireyler arasında yinelenmelidir.
NA ve özellikle BA, klinik araştırma için hala nispeten yeni teknikler vardır. Ancak, bu teknikler Faydaları bunların kullanımı alternatif teknikleri5karşı dikkatli doğrulama dahil olmak üzere çok sayıda çalışmalarda sonuçlandı. Bu cihazlar şimdi Cihazlar CE işaretli solunum araştırma yaygın kullanım için hazır olarak mevcuttur. NA ve BA alternatif örnekleme teknikleri daha çok daha küçük örnek birimleri içinde sonucu iken, daha yüksek elde edilen konsantrasyonları düşük bereket için bağışıklık arabulucu büyük duyarlılık neden olabilir.
Bağlı olarak istenilen aşağı akım uygulamaları, NA ve BA örnekleri doğrudan çalışma fizibilite klinik araştırma ortamında geliştirilmesi daha sonra işlenmek donmuş olabilir. Örnek işleme için protokol Ayrıca belirli aşağı akım uygulamaları uyacak şekilde uyarlanabilir. Önerilen işleme teknikleri protein veya lipid bağışıklık arabulucu veya nükleik asitler topluluğu için kullanılabilir ancak her çalışma için optimize edilmelidir. Özellikle, MLF ile farklı arabellekleri eluted. İlk olarak, immunoassay arabellek Mukozal sitokinler, kemokinler ve antikorlar6,45ölçmek için kullanılabilir. Arabellekleri deterjan düzeyler ile hücre lizis oluşur, intra hücresel sitokinler eklenmesi izin güvence altına almak için de kullanılabilir. Chaotropic RNA ayıklama arabellekleri viral enfeksiyon, viral belirlenmesi için kullanılması gereken yük, mRNA ve microbiome ana. Alternatif olarak, lipidomics ve kütle spektrometresi organik çözücüler kullanılabilir.
Sonuç olarak, doğrudan emilimini MLF Mukozal yüzeyler Mukozal hastalıklarda solunum, mide-bağırsak, idrar ve diğer potansiyel kullanımı ile heyecan verici bir tekniktir. Ancak, bu umut verici emme teknikleri örnekleme ve bireysel deneyleri (biyolojik) her hastalık ayarı için teknik işleme kesin doğrulama gerektirir. Buna ek olarak, bu roman hassas Mukozal örnekleme teknikleri geleneksel örnekleri, dayalı doğrulamayı gibi kan, nefes ve balgam gerektirir. Bu teknikler ile MLF mikrop, sitokinler, kemokinler, prostanoids ve antikorlar ölçmek için kullanılabilir.

Çoğu solunum yolu hastalıkları bir enflamatuar yanıt neden ve alerjik rinit, viral ve fungal enfeksiyonlar, tüberküloz, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, akciğer solunum Mukozal yüzeyinden örnekleme için acil bir ihtiyaç olduğunu fibrozis ve akciğer kanseri 1. Nazofarenks aspiratı (NPA), nazal lavaj ve bronchoalveolar lavaj (BAL) alt ve üst hava yolu örnekleme için ortak teknikler vardır. Ancak, bu teknikler zavallı tolerabilite, seyreltme inflamatuar arabulucu ve örnekleme2sık sık tekrarlamak için yetersizlik de dahil olmak üzere önemli sorunlar mevcut. NPA örnekleme için bir alternatif temizleme bezi, naylon akın etti, pamuk, kullanımı veya onlar neden rahatsızlık ve hasar nazal epitel ve bazı durumlarda geri dönüşü olmayan bağlama beri Rayonu3,4, ama bunlar da sınırlamalar, sahip inflamatuar aracılar5. Bu teknikler genellikle bir saatten fazla seri olarak yinelenemez ve alternatif teknikleri daha düşük bereket sitokinler ve kemokinler5,6tespiti için etkili olabilir. Ayrıca, bu teknikleri ile ilişkili kullanıcı değişkenlik veri, büyük hasta tabur gereksinim olarak ortaya çıkan tutarsızlıkları oluşturabilir.
Alternatif olarak, doğal ve sentetik sünger kullanarak emme teknikleri MLF Mukozal yüzeyler arasında toplamak için kullanılmaktadır. Oftalmik sünger oluşur (örneğin, Weck-cel) doğal selüloz örnek tükürük, servikal ve vajinal salgılar7için kullanılmıştır. Buna ek olarak, polivinil alkol (PVA) sentetik sünger yaptı ve hydroxylated polivinil asetat (HPVA) faydalanılan8olmuştur. Yedi farklı dinsel malzeme poliüretan mini-sünger insan gözyaşları10toplamak için kullanılan süre antikorlar9, ölçme öncesinde oral sıvı örnekleme için karşılaştırılmıştır.
Filtre kağıdı Pamuk bitki doğal selüloz oluşan yaygın Alam ve arkadaşları, 1992-11,12,13,14öncü kağıt beri burun salgıları emmek için kullanılmıştır, 15,16,17. Filtre kağıdı diskler (örneğin Shandon) filtresi kartlardan üretilen ve histamin ve sitokinler sonra burun alerjen zorluklar kontrollü ve doğal alerjen pozlama18,19 ile ölçmek için kullanılan ,20,21. Ancak, filtre kağıdı farklı gruplar halinde protein bağlayıcı ve sitokinler serbest bırakmak için bazı başarısız onların derecesi değişir. Sentetik dinsel matrisi (SAM) kullanarak yöntemleri bu nedenle gelişmiş2,22,23olmuştur. SAMs şimdi genellikle burun MLF almak için na tarafından kullanılır Bu emici malzemelerdir rahat kullanın ve MLF bile iltihaplı burun uzun bir süre sık aralıklarla elde edebilirsiniz.
Burun emme hassas Mukozal MLF örnekleme üst solunum yolu içinde için bir SAM kullanarak örnekleme bir şeklidir. NA Cihazlar CE işaretli tıbbi cihazlar Medikal dereceli malzemelerden temiz odalar kullanarak olarak imal edilmiş olup, toz ve alerjenleri serbest. NA örnekleyici bir kolu ve SAM bir steril cryotube oluşur. SAM polimerler, genellikle lifleri, oluşur ama de köpük mevcuttur ve bunlar yumuşak ve dinsel, hızlı örnek koleksiyon için esneklik ile seçilir. SAMs absorbe salgıları verimli elüsyon izin vermek için en az protein bağlayıcı var. NA üzerinde her yaştan bağış yapılabilir çok nazik, non-invaziv bir tekniktir. Buna ek olarak, seri örnekleme, birkaç dakikada bile, mümkündür. NA karşı varolan üst solunum yolu örnekleme teknikleri5 doğrulandı ve tekrarlayan örnekleme Kinetik veri meydan alerjen23,24,25ile hava yolu takip nesil izin verdi, Bakteriyel endotoksin26 ve viral türü TLR agonistler (Jha, A. vd., el yazması hazırlık). NA da doğa tarihi Atopi27,28,29 araştırmak bebeklerde ve viral bronşiyolit30kullanılmıştır.
Bronchoscopic microsampling (BMS) Olympus31,32,33tarafından geliştirilen alt solunum yolu MLF koleksiyonunda için bir yöntemdir. Ne yazık ki, bu BMS sistem sadece Japonya'da lisanslıdır. Olympus tedarik iki BMS sistemleri: fibröz hydroxylated polyester (FHPE) ile bir sonda34,35,36,37ve bir pamuk ile bir sonda33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. bir büyük engel astımı olan hastalarda kullanılan BMS sonda Mukozal temas kanama, tüm örnekleri kanla kontamine yarısı neden olmuştur. Yazarlar örnek MLF periferik airways bu BMS sistemden astım hastaları43yılında kullanarak mümkün olduğunu reddetmektedir.
Alternatif olarak, BA rhinovirus6olan astımlı bireylerde deneysel enfeksiyonu takip dahil olmak üzere alt solunum yolları, bronchoscopic incelenmesi sırasında gerçekleştirilen bir yumuşak SAM kullanarak geliştirdik. BA aygıt oluşur: bir dış içi boş kateter, bu SAM dışarı üstünde harekete geçirmek bir el parça ve SAM onun ucunda sahip bir merkez plastik kılavuz tel. NA, gelince BA kitleri temiz odalar kullanarak tıbbi malzemelerden üretilmektedir ve toz ve alerjenleri serbest. Ayrıca, CE işaretli ve gama radyasyona maruz sağlanan aygıtlardır. SAM şerit yumuşak, dinsel ve hızlı örnek koleksiyon için esneklik vardır. Ayrıca absorbe salgıları verimli elüsyon izin vermek için en az protein bağlayıcı vardır. Cihazın bir bronkoskop çalışma kanalı ile uygun ve için hızla kullanılabilir ve doğru bir şekilde MLF hava yolu içinde ilgi belirli siteleri, örnek. BAL veya BMS aksine, BA iletişim kanama veya ek hasta rahatsızlık sonrası yordam yol açmaz.
Dikkatli bir değerlendirme NA ve BA örnekleri işleme için verilmelidir. Örnekleri-ebilmek var olmak doğrudan donmuş ve toplu olarak işlenen veya hemen işlenebilir. Konak hücre RNA ilgili ve işlem türü uzun sitokinler, kemokinler ve immünglobulin veya viral, bakteriyel, elutions de dahil olmak üzere bazı aşağı akım uygulamaları doğru uygun olabilir. Biz klinik toplama ve laboratuvar işleme teknikleri klinik araştırmacılar için bir rehber olarak NA ve BA ile ilgili mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

Burun emme (NA) ve bronş emme (BA) yöntemlerini insan solunum yolu Mukozal astar sıvı (MLF) emmek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanın. NA konka aşağı sıvı emer ve en az düzeyde rahatsızlık neden olan non-invaziv bir tekniktir. NA sık üst solunum yolu örnekleme tekrarlamak için yeteneği ile tekrarlanabilir sonuçlar doğurdu.
Buna karşılık, nazofarenks aspirasyon (NPA) ve geleneksel ev temizliği, gibi solunum mukoza örnekleme farklı yöntemi daha invaziv ve daha büyük veri değişkenlik neden olabilir. Diğer yöntemleri kısıtlamaları bulunmaktadır, örneğin, biyopsi ve bronş yordamlar invaziv, balgam içeren birçok ölü hücreleri ve الرسالة gerektirir, su ve tükürük dışarı solunan nefes Yoğuşma (EBC) içerir ve lavaj örnekleri seyreltik ve değişken.
BA bronkoskop Kliniği çalışma kanalı aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Örnekleme iyi tolere edilir ve hava yolu içinde birden çok site yapılabilir. BA bronchoalveolar lavaj (BAL) örnekleri daha az sulu olmak MLF örnekleri sonuçlanır.
Bu makalede, NA ve BA teknikleri, hem de laboratuar işleme ölçülen istenen aşağı akım biyomarker uyarlanabilir elde edilen örneklerin gösterilir. Bu emme teknikleri klinik solunum araştırmalarında kullanılan geleneksel örnekleme teknikleri için yararlı alternatifleri vardır.

NA çalışmaları için bir dizi kolayca kullanılmıştır ve non-invaziv Mukozal inflamasyon ölçün. Alerjen burnuna yönetiminin, prostaglandin D2 (PGD2) düzeyleri yükselmeye ve mast hücresi degranulation (Thwaites vd., el yazması hazırlık) doğrultusunda (şekil 1), birkaç dakika içinde düşüş görülebilmektedir. Ayrıca, arabulucu IL-5 ( 24izni ile yayımlanmaktadırŞekil 2,), gibi tip-II iltihabı burun alerjen challenge23,24saat içinde ölçülebilir. Alerjik astımlı ve sağlıklı kontrol deneysel enfeksiyonunda NA arabulucu, interferon-gamma (IFN-γ), dahil olmak üzere bir panel ölçmek için 7 gün (şekil 3,) 6izni ile yayımlanmaktadır boyunca kullanıldı. Ayrıca, bebekler doğal respiratuvar sinsityal virüs (RSV) enfeksiyonunda NA göre sigara RSV bebekler bronşiyolit ve sağlıklı kontrol ( ile IFN-γ gibi inflamatuar sitokinlerin düzeyleri ile ilişkilendirilecek RSV gösterdi Şekil 4, yazdırılan 30izniyle). İlginçtir, bu ayrımcılık RSV ve sigara RSV bronşiyolit arasında zaman eşlemeli NPA örnekleri (şekil 4) önemli değildi.
BA rhinovirus ile Alerjik astımlı deneysel enfeksiyon sırasında da kullanıldı. IL-10 ve IL-5 gün rhinovirus enfeksiyon, düzeyleri, IFN-γ, CXCL11, 4 satır taban çizgisi (şekil 5; yükseltilmiş A, B, C ve D, sırasıyla). Ayrıca, bu teknik Alerjik astımlı alt havayolu yükseltilmiş IL-5 düzeyleri sağlıklı kontrol (şekil 5 d) (şekil 5 6izni ile yayımlanmaktadır) göre rhinovirus enfeksiyon sırasında gösterdi.
Bu temsilci sonuçlar % 0.05 ara-20 ve % 1 BSA içeren tahlil tampon kullanarak eluted örnekleri oluşturulan ( Tablo malzemelerigörmek).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Resim 1 : Hızlı üretimi ve prostaglandin D2 burun alerjen meydan takip yetkisi. Burun emme eluates seri örneklerinde burun alerjen meydan okuma ile Timothy çimen poleni takip itibaren ölçülen prostaglandin D2 (PGD2) düzeyleri (n = 5). Her satır veri tek bir kişi temsil eder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Resim 2 : IL-5 burun alerjen meydan takip Kinetik ölçüm. Burun alerjen meydan takip seri burun emme örneklerinde üretim IL-5. Üç alerjen meydan okuma yürütülen çalışmalar, katılımcılar ile tekrar (n = 19) plasebo (mavi) alma, düşük doz (10 mg) oral prednizon (turuncu) veya yüksek doz (25 mg) oral prednizon (kırmızı) alerjen yönetim önce bir saat. Geometrik ortalama satırları belirtmek ve hata çubukları tüm katılımcıların % 95 güven aralıkları vardır. (Şekil izninden Leaker vd., Mukozal İmmünoloji, 2017 ile yeniden basıldı). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Şekil 3 : Interferon γ indüksiyon rhinovirus enfeksiyon sırasında. Sağlıklı yetişkinlerin enfeksiyon mücadele sırasında (n = 11, mavi) ve Alerjik astımlı (n = 28, kırmızı) rhinovirus-16 ile burun emme örnekleme interferon-γ (IFN-γ) düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Veri hata çubukları interquartile aralıkları ifade eden bireylerin ve B) medyan düzeyleri A) pişmemiş spagetti araziler temsil edilir. (Şekil Hansel ve ark. izni ile yayımlanmaktadır 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Şekil 4 : Nasosorption ayrımcılık bebeklerde RSV enfeksiyonu ile ilişkili yükseltilmiş Interferon γ. Burun emme ve nazofarenks aspirasyon (NPA) solunum sinsisyal virüs (RSV) enfeksiyonu ile ilişkili bronşiyolit bebeklerde interferon γ düzeylerini ölçmek için kullanılmıştır (kırmızı, n = 12), bir sigara RSV solunum patojen (yeşil, n = 12) ve sağlıklı denetimleri (mavi, n = 9). Veriler analiz Kruskall Wallis testi ile Dunnlar düzeltme birden fazla karşılaştırmalar için kullanma (***p< 0.001). Satırları gösterir medyan değerleri ve hata çubukları interquartile aralıkları. (Şekil Thwaites vd izninden modifiye 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Şekil 5 : Bronş emme örneklerinde rhinovirus enfeksiyon sırasında inflamatuar arabulucu. Sağlıklı kontrol rhinovirus-16 enfeksiyonu takip (n = 10, mavi) ve Alerjik astım gönüllü (n = 23, kırmızı), bronş emme düzeyi A) IFN γ, B) CXCL11, C) IL-10, D) IL-5 temel ve günde 4 enfeksiyon ölçmek için kullanıldı. Veri analiz Wilcoxon tarafından rank testi (eşleşen örnekleri) ve Mann-Whitney testi (eşsiz örnekleri) imzaladı. Şekil Hansel ve ark. izni ile yayımlanmaktadır 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples at JoVE.com

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Bu el yazması burun ve bronş emme teknikleri, özellikle alt ve üst hava yolu Mukozal astar sıvı (MLF) örnek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanarak açıklar. Bu yöntemleri daha iyi standardizasyon ve tolerabilite mevcut solunum örnekleme teknikleri daha sağlar.

Burun ve bronş sıvıları emilimini: hassas örnekleme insan solunum mukoza ve laboratuvar işleme örnekleri

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

absorption-nasal-bronchial-fluids-precision-sampling-human

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

29.7K Görüntüleme.  St Mary's Hospital. Bu el yazması burun ve bronş emme teknikleri, özellikle alt ve üst hava yolu Mukozal astar sıvı (MLF) örnek için sentetik dinsel matrisler (SAM) kullanarak açıklar. Bu yöntemleri daha iyi standardizasyon ve tolerabilite mevcut solunum örnekleme teknikleri daha sağlar.

Video: Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Tıp

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Component-resolved Diagnostic Approach for a Study on Grass Pollen Allergens in Chinese Southerners with Allergic Rhinitis and/or Asthma

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen allergens, data on this topic are limited in southern China. Any available data were obtained by self-report questionnaires, skin prick tests, and total or specific IgE tests using crude extracts. For many reasons, these methods are unreliable. Serum sIgE reactivity to Bermuda grass, Timothy grass, and Humulus scandens allergens in a cohort of patients from Greater Guangzhou (southern China&#39;s largest city and its outskirts) with allergic rhinitis and/or asthma were examined using a fully-automated immunoassay analyzer as a component-resolved diagnostics (CRD) tool.
For the first time, a considerably high prevalence of Bermuda grass sIgE positivity was demonstrated in Chinese southerners with allergic rhinitis and/or asthma. In these patients, a subtle prevalence of sensitization to Timothy grass and Humulus scandens was also noted, which may arise from cross-reactivity, as the latter two are not common in the region. This was also supported by the detection of allergen components.
Fully-automated immunoassay analyzers may offer satisfactory consistency between regions, laboratories, and institutions and over time. The automaticity of the instrument may enable a standardized detection that would not have been readily revealed before the advent of CRD.
This is a study that uses a CRD approach to investigate sensitization to grass pollen allergens in southern China. It adds to current evidence in the literature. Future studies are needed to validate these findings. However, although CRD is a useful tool, the findings made with the fully-automated immunoassay analyzer should not substitute for other laboratory investigations, clinical evaluations, and physician expertise.

This work describes a protocol that uses a component-resolved approach to study sensitization to grass pollen allergens in a cohort of patients from southern China with allergic rhinitis and/or asthma.

Allerjik Rinit ve / veya Astımı olan Çinlilerin Çimen Poleni Allerjenleri Üzerine Bir Çalışma İçin Bileşen ile Çözümlenmiş Bir Teşhis Yaklaşımı

Sensitization to grass pollen imposes a global risk for allergic airway diseases. Although prevention relies on local investigation of the pollen ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

Uzak Laboratuvar Yönetimi: Solunum virüs tanılama

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor

Capnography is commonly used to monitor patient&#8217;s ventilatory status. While sidestream capnography has been shown to provide a reliable assessment of end-tidal CO2 (ETCO2), its accuracy is commonly validated using commercial kits composed of a capnography monitor and its matching disposable nasal cannula sampling lines. The purpose of this study was to assess the compatibility and accuracy of cross-paired capnography sampling lines with a single portable bedside capnography monitor. A series of 4 bench tests were performed to evaluate the tensile strength, rise time, ETCO2 accuracy as a function of respiratory rate, and ETCO2 accuracy in the presence of supplemental O2. Each bench test was performed using specialized, validated equipment to allow for a full evaluation of sampling line performance. The 4 bench tests successfully differentiated between sampling lines from different commercial sources and suggested that due to increased rise time and decreased ETCO2 accuracy, not all nasal cannula sampling lines provide reliable clinical data when cross-paired with a commercial capnography monitor. Care should be taken to ensure that any cross-pairing of capnography monitors and disposable sampling lines is fully validated for use across respiratory rates and supplemental O2 flow rates commonly encountered in clinical settings.

The goal of this study was to evaluate the accuracy of capnography sampling lines used in conjunction with a portable bedside capnography monitor. Sampling lines from 7 manufacturers were evaluated for tensile strength, rise time, and ETCO2 accuracy as a function of respiratory rate or supplemental oxygen flow rate.

Taşınabilir Kapnografi Monitörü ile Kullanıldığında Kapnografi Örnekleme Hattı Uyumluluğunun ve Doğruluğunun Değerlendirilmesi

Capnography is commonly used to monitor patient&#8217;s ventilatory status. While sidestream capnography has been shown to provide a reliable assessment ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At present, most primary medical institutions in China have a poor percentage of adoption of blood-testing technology, and a hematology detection system with a high price to performance ratio and easy operation is urgently needed in primary healthcare centers. This paper introduces the principle and operation procedures of a point-of-care testing (POCT) card-based leukocyte analyzer (evaluated system), which was used to detect WBC indexes such as neutrophils, lymphocytes, and intermediate group cells (including eosinophils, basophils, and monocytes) in whole blood. The results from the evaluated system were compared to those from two commercial automatic hematology analyzers (reference system). The correlation and consistency between the evaluated system and the commercial reference systems were analyzed. The results showed that WBC count and number of granulocytes detected by the evaluated and reference systems showed a strong positive correlation (rs = 0.972 and 0.973, respectively), while the number of lymphocytes showed a relatively low correlation (rs = 0.851). A Bland-Altman plot showed that the major difference between the values detected by the evaluated system and the reference systems is within 95% limits of agreement (LoA), indicating that the two systems are in good agreement. In conclusion, the evaluated system has an excellent correlation, robust consistency, and a reliable comparison with the results of the widely used automatic hematology analyzers. It is ideal for WBC detection in primary medical institutions where a full-automatic five-category hematology analyzer is unavailable, especially during the COVID-19 normalized prevention and control period.

A protocol to measure peripheral blood leukocytes using a POCT card-based leukocyte analyzer is presented here. Same blood samples were tested by two automated hematology analyzers to evaluate the consistency and accuracy of the results. The results showed that the evaluated analyzer had a good correlation with the reference system.

Periferik Kan Lökositlerini Ölçmek için Bakım Noktası Test Analizörünün Değerlendirilmesi

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...