FM los tintes son colorantes de membrana que son ampliamente utilizados para vesícula imagen de reciclaje. Este es el proceso por el cual una célula forma vesículas de su propia membrana preservar el tamaño de la célula, reutilizar las proteínas caras y consecutivamente transporte de moléculas al espacio extracelular. Este proceso es comúnmente estudiado en las sinapsis neuronales, donde participa en la liberación de neurotransmisores. Además de examinar vesícula reciclaje, FM colorantes se utilizan para estudiar varios otros fenómenos, como la secreción en células cromafines y la reparación de la membrana de la célula después de lesión.
Este video se centrará en el uso de tintes de FM en una vesícula de estudio experimento de reciclaje. Vamos a ir sobre un protocolo paso a paso que utiliza tintes FM para cuantificar el proceso de reciclaje en las neuronas estimuladas. Por último, revisaremos algunas experiencias del ejemplo, que utilizan esta molécula única de diferentes maneras.
Antes de saltar en el procedimiento, primero Repasemos las propiedades bioquímicas de los tintes de la FM, que nos ayudará a entender su función en vesícula reciclaje experimentos.
Estructuralmente, los tintes de FM son styryl moléculas que derivan su nombre del científico que los sintetiza — Fei Mao. Estos colorantes tienen tres características estructurales principales: cabeza, cola y puente. El puente consiste en dos anillos aromáticos con una región variable doble enlace entre ellos. Toda esta sección crea el fluoróforo.
Es la naturaleza de cualquier fluoróforo que cuando golpeado por entrada de luz en una cierta longitud de onda de excitación, sus átomos absorben esa energía y sus electrones a un estado excitado. Estos electrones volver al estado de tierra emitiendo energía vibrationally y, finalmente, como la luz de una longitud de onda de emisión. La cola hidrofóbica permite la molécula de FM a la partición en las bicapas lipídicas de la membrana celular, y su cabeza hidrofílica tiene una carga que restringe su localización para el folleto de la membrana externa.
Por lo tanto, la única forma que puede ir dentro de la célula es mediante endocitosis. Tintes de FM son muy sensibles al medio ambiente y muestran fluorescencia débil en solventes polares, pero fuerte fluorescencia en entornos hidrófobos como las membranas. Esto genera alto contraste membrana etiquetado que puede ser visualizado y cuantificado utilizando un microscopio de fluorescencia.
Estas propiedades hacen tintes FM adaptados específicamente para evaluar la vesícula de reciclaje en las sinapsis. Brevemente, el proceso consiste en incubar las culturas con tinte de FM. Algunas de las moléculas de FM llegan Unidos a las membranas, lo que aumenta significativamente su intensidad de fluorescencia. A continuación, un estímulo inicia el proceso de internalización de la membrana. Por lo tanto, algunas moléculas de FM están atrapados en la membrana de la vesícula y el resto de las moléculas de tinte localizada exterior son arrastrados.
En el segundo estímulo, internalizadas manchadas las vesículas se fusionan con la membrana de la célula para liberar su contenido, y el tinte departitions rápidamente, resultando en una disminución rápida de la intensidad de la fluorescencia. Esta extracción puede ser cuantificada con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.
Ahora que usted está familiarizado con los principios bioquímicos de los tintes de FM, vamos a revisar un procedimiento sobre cómo realizar un experimento examinar vesícula sináptica reciclaje con estos colorantes.
Limpiar muestras de culturas neuronales en cubreobjetos se preparan de antemano. Estas células se mueven a una solución de tinte de FM, haciendo que las membranas a etiquetarse. El cubreobjetos de la muestra se monta luego en la cámara de proyección de imagen del microscopio.
Para permitir la salida y manipulaciones fluidas como lava, fluido de entrada líneas se unen para formar una cámara sellada de la perfusión. Monte la cámara en el escenario de un microscopio de fluorescencia. Conecte los cables a la cámara y unirlos con el estimulador eléctrico. Una vez fijado, los filtros de excitación y de emisión se establecen según el tinte de FM usado.
Colorante de carga en las vesículas a través de endocitosis se induce mediante una estimulación eléctrica. Después de la estimulación, terminales nerviosas pueden recuperar. Entonces, colorante extracelular se lava con buffer; Esto también minimiza la fluorescencia de fondo. Es importante mantener la intensidad de excitación mínima porque FM tintes son propensos a fotoblanqueo, que es debilitamiento de la intensidad de la fluorescencia debido a la excitación prolongada. Después de la incubación corta, se obtienen las imágenes iniciales. A continuación, exocitosis es inducida con una segunda señal eléctrica.
Después de medir fluorescencia en diferentes momentos después del estímulo, al final, terminales del nervio pueden ser estimulados exhaustivamente descargar todo tinte liberable. La fluorescencia restante después de se considera como la intensidad de la fluorescencia de fondo. Luego, se mide la fluorescencia intrínseca de cada imagen utilizando la herramienta de "Región de interés" en una zona no sináptico de la imagen. La fluorescencia de fondo y la fluorescencia intrínseca entonces se resta de la intensidad de fluorescencia de cada momento para obtener la intensidad de la fluorescencia normalizado, que entonces se representan gráficamente frente al tiempo. La disminución de intensidad con el tiempo representa extracción, que es una medida indirecta de la vesícula de reciclaje.
Ahora que hemos revisado la metodología, vamos a ver como colorantes de FM se utilizan en experimentos específicos.
Discutimos el protocolo utilizando tintes de FM en las neuronas estimuladas. Aquí, los científicos estaban interesados en estudiar reciclaje de vesícula espontánea. Hicieron esto con el protocolo establecido en combinación con un sistema de imagen lo suficientemente sensible como para detectar pequeños cambios en la intensidad de la fluorescencia. Los resultados representan una disminución en la intensidad de la fluorescencia es directamente debido a la liberación sináptica espontánea.
Dentro de la neurona presináptica, las vesículas se dividen en dos piscinas: una piscina de reserva o RP y una piscina fácilmente liberable o PVP. Aquí, científicos usaron tintes FM para analizar la fracción de cada tipo en la población de vesícula. Aplicación secuencial de estímulos eléctricos de intensidad creciente, estos científicos fueron capaces de cuantificar los porcentajes relativos de cada tipo de piscina de vesícula.
Por último, biólogo celular también utilizar tintes FM para diseccionar los factores implicados en la reparación de exocíticas de membranas de plasma heridas. En este experimento, los investigadores se centraron particularmente en el papel de esfingomielinasa, una enzima de modificación de lípidos, en el proceso mismo-resellado de la membrana. En primer lugar, generan las células deficientes en la enzima esfingomielinasa con la ayuda de silenciamiento tratamiento RNA. A continuación, trataron a estas células y un grupo control con tinte de FM exógena y una toxina que crea lesiones de la membrana plasmática. Por último, han consultado todas las muestras con un microscopio confocal. Los resultados mostraron que las células deficientes del sphingomyelinase mostraron robusta acumulación de moléculas intracelulares de FM. Por otro lado, las células del control mostraron mínima afluencia de FM, sugiriendo un papel de esfingomielinasa en la reparación de la membrana plasmática.
Sólo ha visto video de Zeus FM colorantes en el reciclaje de la vesícula. El video describe la bioquímica de los tintes de FM, detalla un protocolo de tinción y cuantificar la vesícula sináptica de reciclaje y finalmente había descrito experimentos actuales utilizando estos tintes de diferentes maneras. ¡Como siempre, gracias por ver!
