Colorants de FM sont des colorants de membrane qui sont largement utilisés pour la vésicule image recyclage. C’est le processus par lequel une cellule forme des vésicules de sa propre membrane pour préserver la taille des cellules, réutiliser les protéines chers et consécutivement transporter des molécules dans l’espace extracellulaire. Ce processus est plus couramment étudié au niveau des synapses neuronales, où elle est impliquée dans la libération de neurotransmetteurs. En plus d’examiner le recyclage de la vésicule, FM colorants sont utilisés pour étudier plusieurs autres phénomènes, comme la sécrétion dans les cellules chromaffines et membrane cellulaire de réparation après une blessure.

Cette vidéo mettra l’accent sur l’utilisation des colorants de FM dans une vésicule d’experimentation expérience recyclage. Nous irons via un protocole étape par étape qui utilise des teintures de FM pour quantifier le processus de recyclage dans les neurones stimulés. Enfin, nous passerons en revue certaines expériences de l’exemple, qui utilisent cette molécule unique de différentes manières.

Avant de sauter dans la procédure, nous allons d’abord revoir les propriétés biochimiques des colorants FM, qui vont nous aider à comprendre leur rôle dans la vésicule recyclage des expériences.

Structurellement, colorants FM sont des molécules de styryl qui en dérivent leur nom le scientifique qui a synthétisé les — Fei Mao. Ces colorants ont trois principales caractéristiques structurelles : tête, queue et pont. Le pont est constitué de deux cycles aromatiques avec une région variable double liaison entre eux. Cette section entière crée le fluorophore.

C’est la nature de n’importe quel fluorophore que lorsque frappé par entrant sur une certaine longueur d’onde excitation, ses atomes absorbent cette énergie et élever ses électrons à un état excité. Ces électrons revenir à l’état fondamental en émettant de l’énergie vibrationnelle et enfin dans la lumière d’une longueur d’onde d’émission. La queue hydrophobe permet à la molécule de FM à partition dans les bicouches lipidiques de la membrane cellulaire, et sa tête hydrophile possède une charge qui restreint sa localisation sur la notice de la membrane externe.

Par conséquent, la seule façon qu’il peut entrer dans la cellule est par endocytose. Colorants de FM sont extrêmement sensibles à l’environnement et montrent une fluorescence faible dans les solvants polaires, mais forte fluorescence dans des environnements comme les membranes hydrophobes. Cela crée un contraste élevé membrane étiquetage qui peut être visualisée et quantifiées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Ces propriétés font des teintures FM spécifiquement adaptés pour évaluer la vésicule recyclage aux synapses. En bref, le processus implique d’incuber les cultures avec la teinture de FM. Certaines molécules FM attachés aux membranes, ce qui augmente considérablement leurs intensités de fluorescence. Ensuite, un stimulus déclenche le processus d’internalisation de membrane. Par conséquent, certaines molécules FM sont pris au piège dans la membrane de la vésicule, et le reste des molécules de colorant localisée externe sont emportées.

Le deuxième stimulation, intériorisées vésicules colorées se fusionnent avec la membrane de la cellule pour libérer leur contenu, et le colorant departitions rapidement, ce qui entraîne une diminution rapide de l’intensité de la fluorescence. Cette décoloration peut être quantifiée à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Maintenant que vous êtes familiarisé avec les principes biochimiques des colorants de FM, passons en revue une procédure sur la façon de réaliser une expérience examinant la vésicule synaptique recyclage à l’aide de ces colorants.

Des échantillons propres et sains de cultures de neurones sur les lamelles sont préparés à l’avance. Ces cellules sont déplacés vers une solution de colorant de FM, causant les membranes doivent être étiquetées. La lamelle de l’échantillon est ensuite montée dans la chambre d’imagerie du microscope.

Pour permettre la sortie et les manipulations de fluides comme la lave, fluide d’entrée lignes sont joints pour former une chambre de perfusion scellé. Monter la chambre sur la scène d’un microscope à fluorescence. Fixez les fils à la chambre et reliez-les au stimulateur électrique. Une fois attachées, les filtres d’excitation et d’émission sont fixés selon la teinture FM utilisée.

Colorant de chargement dans des vésicules par endocytose est induite à l’aide d’une stimulation électrique. Après la stimulation, les terminaisons nerveuses sont autorisés à récupérer. Puis, colorant extracellulaire est rincé avec un tampon ; Cela minimise également la fluorescence de fond. Il est important de garder l’intensité d’excitation minimale parce que les colorants de FM sont sujettes à photobleaching, qui est l’affaiblissement de l’intensité de fluorescence en raison de l’excitation prolongée. Après l’incubation courte, premières images sont obtenues. Ensuite, l’exocytose est induite par un second signal électrique.

Après avoir mesuré la fluorescence à des moments différents après la stimulation, à la fin, les terminaisons nerveuses peuvent être stimulées exhaustive pour décharger tous les colorant libérable. La fluorescence restant après cela est considérée comme l’intensité de fluorescence de fond. Ensuite, la fluorescence intrinsèque de chaque image est mesurée à l’aide de l’outil « Région d’intérêt » dans une zone non-synaptique de l’image. La fluorescence de fond et la fluorescence intrinsèque est ensuite soustraite de l’intensité de la fluorescence de chaque instant pour obtenir l’intensité de la fluorescence normalisé, qui est ensuite tracée en fonction du temps. La diminution de l’intensité avec le temps représente de décoloration, qui est une mesure indirecte du recyclage de la vésicule.

Maintenant que nous avons passé en revue la méthodologie, nous allons étudier comment FM colorants sont utilisés dans des expériences spécifiques.

Nous avons discuté du protocole à l’aide de colorants FM dans les neurones stimulés. Ici, les scientifiques étaient intéressés à étudier le recyclage de la vésicule spontanée. Ils ont fait cela en utilisant le protocole établi en combinaison avec un système d’imagerie assez sensible pour détecter de faibles variations dans l’intensité de la fluorescence. Les résultats représentent une diminution de l’intensité de la fluorescence qui résulte directement de la libération synaptique spontanée.

Dans le neurone présynaptique, les vésicules sont divisés en deux bassins : un bassin de réserve ou RP et une piscine facilement libérable ou PRT. Ici, les scientifiques ont utilisé FM colorants pour analyser la fraction de chaque type dans la population de la vésicule. Par l’application séquentielle de stimuli électriques d’intensité croissante, ces scientifiques ont été en mesure de quantifier les pourcentages relatifs de chaque type de piscine de la vésicule.

Enfin, biologiste cellulaire également utiliser FM colorants à disséquer les facteurs impliqués dans la réparation de la sécrétion des membranes plasmiques des blessés. Dans cette expérience, les chercheurs ont porté particulièrement sur le rôle de la sphingomyélinase, une enzyme de modification des lipides, dans le processus de fermeture de membrane. Tout d’abord, ils ont généré cellules déficientes en la sphingomyélinase enzymatique à l’aide de mise sous silence de traitement RNA. Ensuite, ils ont traitaient ces cellules et un groupe témoin avec exogène FM colorant et une toxine qui crée des lésions de la membrane plasmique. Enfin, ils ont vu tous les échantillons à l’aide d’un microscope confocal. Les résultats ont montré que les cellules déficientes de la sphingomyélinase a montré robuste accumulation de molécules intracellulaires de FM. En revanche, cellules témoins ont montré minime afflux de FM, suggérant un rôle de la sphingomyélinase dans la réparation de la membrane plasmique.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur teintures de FM dans le recyclage de la vésicule. La vidéo décrit la biochimie des colorants de FM, détaillée un protocole pour souiller et quantifier des vésicules synaptiques recyclage et enfin décrit des expériences actuelles utilisant ces colorants de différentes manières. Comme toujours, Merci pour regarder !