I coloranti FM sono coloranti a membrana ampiamente utilizzati per il riciclaggio delle vescicole. Questo è il processo attraverso il quale una cellula forma vescicole dalla propria membrana per preservare le dimensioni delle cellule, riutilizzare proteine costose e trasportare consecutivamente le molecole nello spazio extracellulare. Questo processo è più comunemente studiato nelle sinapsi neuronali, dove è coinvolto nel rilascio di neurotrasmettitori. Oltre a esaminare il riciclaggio delle vescicole, i coloranti FM vengono utilizzati per studiare diversi altri fenomeni, come la secrezione nelle cellule cromaffini e la riparazione della membrana cellulare a seguito di lesioni.

Questo video si concentrerà sull'uso di coloranti FM in un esperimento che studia il riciclaggio delle vescicole. Esamineremo un protocollo passo-passo che utilizza coloranti FM per quantificare il processo di riciclaggio nei neuroni stimolati. Infine, esamineremo alcuni esperimenti di esempio, che utilizzano questa molecola unica in modi diversi.

Prima di passare alla procedura, esaminiamo prima le proprietà biochimiche dei coloranti FM, che ci aiuteranno a capire la loro funzione negli esperimenti di riciclaggio delle vescicole.

Strutturalmente, i coloranti FM sono molecole di stirilico che derivano il loro nome dallo scienziato che li ha sintetizzati: Fei Mao. Questi coloranti hanno tre caratteristiche strutturali principali: testa, coda e ponte. Il ponte è costituito da due anelli aromatici con una regione di doppio legame variabile tra di loro. L'intera sezione crea il fluoroforo.

È la natura di ogni fluoroforo che quando viene colpito dalla luce in arrivo a una certa lunghezza d'onda di eccitazione, i suoi atomi assorbono quell'energia e sollevano i suoi elettroni a uno stato eccitato. Questi elettroni ritornano allo stato base emettendo energia vibrazionalmente e infine come luce di una lunghezza d'onda di emissione. La coda idrofobica consente alla molecola FM di dividersi nei doppi strati lipidici della membrana cellulare e la sua testa idrofila ha una carica che limita la sua localizzazione al foglietto esterno della membrana.

Pertanto, l'unico modo in cui può entrare nella cellula è attraverso l'endocitosi. I coloranti FM sono acutamente sensibili all'ambiente e mostrano una debole fluorescenza nei solventi polari, ma una forte fluorescenza in ambienti idrofobici come le membrane. Ciò crea un'etichettatura a membrana ad alto contrasto che può essere visualizzata e quantificata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Queste proprietà rendono i coloranti FM particolarmente adatti per valutare il riciclaggio delle vescicole nelle sinapsi. In breve, il processo prevede l'incubazione delle colture con colorante FM. Alcune delle molecole FM si attaccano alle membrane, il che aumenta significativamente le loro intensità di fluorescenza. Successivamente, uno stimolo avvia il processo di internalizzazione della membrana. Pertanto, alcune molecole FM sono intrappolate nella membrana della vescicola e il resto delle molecole di colorante localizzate esterne vengono lavate via.

Alla seconda stimolazione, le vescicole colorate interiorizzate si fondono con la membrana cellulare per rilasciare il loro contenuto e il colorante si allontana rapidamente, con conseguente rapida diminuzione dell'intensità della fluorescenza. Questo destaining può essere quantificato con l'aiuto di un microscopio a fluorescenza.

Ora che hai familiarità con i principi biochimici dei coloranti FM, esaminiamo una procedura su come eseguire un esperimento che esamina il riciclaggio delle vescicole sinaptiche usando questi coloranti.

Campioni puliti e sani di colture neuronali su coverslips sono preparati in anticipo. Queste cellule vengono spostate in una soluzione colorante FM, causando l'etichettatura delle membrane. Il coverslip del campione viene quindi montato sulla camera di imaging del microscopio.

Per consentire manipolazioni fluide come lavaggi, le linee di ingresso e uscita del fluido sono collegate per formare una camera di perfusione sigillata. Montare la camera sul palco di un microscopio a fluorescenza. Collegare i fili alla camera e collegarli allo stimolatore elettrico. Una volta fissati, i filtri di eccitazione ed emissione vengono impostati in base al colorante FM utilizzato.

Il carico di colorante nelle vescicole tramite endocitosi viene indotto utilizzando una stimolazione elettrica. Dopo la stimolazione, i terminali nervosi possono recuperare. Quindi, il colorante extracellulare viene lavato via con tampone; questo minimizza anche la fluorescenza di fondo. È importante mantenere l'intensità di eccitazione minima perché i coloranti FM sono soggetti a fotosciviazione, che è l'indebolimento dell'intensità di fluorescenza a causa dell'eccitazione prolungata. Dopo la breve incubazione, si ottengono le immagini iniziali. Successivamente, l'esocitosi viene indotta con un secondo segnale elettrico.

Dopo aver misurato la fluorescenza in diversi punti temporali dopo la stimolazione, alla fine, i terminali nervosi possono essere stimolati in modo esaustivo per scaricare tutto il colorante rilasciabile. La fluorescenza rimanente dopo è considerata come l'intensità di fluorescenza di fondo. Quindi, la fluorescenza intrinseca di ogni immagine viene misurata utilizzando lo strumento "Regione di interesse" in un'area non sinaptica dell'immagine. La fluorescenza di fondo e la fluorescenza intrinseca vengono quindi sottratte dall'intensità di fluorescenza di ogni punto temporale per ottenere un'intensità di fluorescenza normalizzata, che viene quindi tracciata rispetto al tempo. La diminuzione dell'intensità nel tempo rappresenta il destaining, che è una misura indiretta del riciclaggio delle vescicole.

Ora che abbiamo esaminato la metodologia, diamo un'occhiata a come i coloranti FM vengono utilizzati in esperimenti specifici.

Abbiamo discusso il protocollo che utilizza coloranti FM nei neuroni stimolati. Qui, gli scienziati erano interessati a studiare il riciclaggio spontaneo delle vescicole. Lo hanno fatto utilizzando il protocollo stabilito in combinazione con un sistema di imaging abbastanza sensibile da rilevare piccoli cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. I risultati rappresentano una diminuzione dell'intensità di fluorescenza che è direttamente dovuta al rilascio sinaptico spontaneo.

All'interno del neurone presinaptico, le vescicole sono divise in due piscine: una piscina di riserva o RP e una piscina o RRP facilmente rilasciabile. Qui, gli scienziati hanno usato coloranti FM per analizzare la frazione di ciascun tipo nella popolazione di vescicole. Con l'applicazione sequenziale di stimoli elettrici di intensità crescente, questi scienziati sono stati in grado di quantificare le percentuali relative di ciascun tipo di pool di vescicole.

Infine, il biologo cellulare utilizza anche coloranti FM per sezionare i fattori coinvolti nella riparazione esocitica delle membrane plasmatiche ferite. In questo esperimento, i ricercatori si sono concentrati in particolare sul ruolo della sfingomielinasi, un enzima che modifica i lipidi, nel processo di risigillatura della membrana. In primo luogo, hanno generato cellule carenti nell'enzima sfingomielinasi con l'aiuto del trattamento dell'RNA silenziante. Successivamente, hanno trattato queste cellule e un gruppo di controllo con colorante FM esogeno e una tossina che crea lesioni della membrana plasmatica. Infine, hanno visualizzato tutti i campioni utilizzando un microscopio confocale. I risultati hanno mostrato che le cellule carenti di sfingomielinasi hanno mostrato un robusto accumulo di molecole FM intracellulari. D'altra parte, le cellule di controllo hanno mostrato un afflusso minimo di FM, suggerendo un ruolo della sfingomielinasi nella riparazione della membrana plasmatica.

Hai appena visto il video di JoVE sui coloranti FM nel riciclaggio delle vescicole. Il video descriveva la biochimica dei coloranti FM, dettagliava un protocollo per macchiare e quantificare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche e infine delineava gli esperimenti in corso che utilizzavano questi coloranti in modi diversi. Come sempre, grazie per aver guardato!