Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
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Investigación en laboratorio de Robinson es apoyada por fondos de Colonia Cluster de excelencia en las respuestas de estrés celular en enfermedades Aging-Associated, Universidad de Colonia, Alemania (CECAD; financiado por el DFG dentro de la iniciativa de excelencia de la federal alemana y los gobiernos del estado) y becas de la Fundación Maria-Pesch de la Universidad de Colonia, Alemania, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) y fortuna Köln.

todos los pasos que implican el uso de patógenos S. typhimurium debe llevarse a cabo en un BSL-2 o mayor facilidad de nivel de seguridad biológica. La cultura y la capa de S. Typhimurium, así como la infección de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) debe realizarse bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. El aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas se puede realizar en cualquier banco de laboratorio BSL-2.
 la extracción de médula ósea de ratones para su diferenciación en macrófagos fue realizada de acuerdo con las directrices sobre bienestar animal y aprobada por la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la naturaleza, Medio ambiente y protección del consumidor [Landesamt für Natur, Umwelt y Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia; Archivo no: 02.05.40.14.082 84 y 84-02.04.2015.A443] y la Universidad de Colonia.
 1. cultivo S. typhimurium <ol><li>inocule S. typhimurium (SL1344 tensión) de una única colonia bacteriana en 5 mL de cerebro corazón infusión (BHI) caldo utilizando un bucle bacteriano.</li>
	<li>Incubar la suspensión bacteriana en una incubadora a 37 ° C durante la noche con sacudarir.</li>
	<li>Al día siguiente, transferir 1 mL de la suspensión bacteriana en 19 mL de caldo BHI en un matraz cónico e incubar a 37 ° C en una incubadora con agitación.</li>
	<li>Supervisar la S. typhimurium crecimiento midiendo la densidad óptica (OD) a 600 nm (OD 600) con un espectrofotómetro. Las mediciones deben tomarse aproximadamente cada 30 minutos</li>
	<li>OD cuando 600 alcanza 1.0, retire la suspensión bacteriana de la incubadora y transferencia en tubo de 50 mL. Centrifugue las bacterias a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 5.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender las bacterias en 4,9 mL de PBS estéril.</li>
</ol> 2. Capa de S. typhimurium con bolas magnéticas conjugado NHS-biotina/estreptavidina biotina <ol><li>Agregar 100 μl de 10 mg/mL a la solución (NHS-biotina disuelto en dimetil sulfóxido, DMSO) recién preparada, a la suspensión bacteriana preparado en el paso anterior. Por ejemplo, diluir 5 mg de biotina de NHS en 0,5 mL de DMSO estéril. Mezcla adecuadamente mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.</li>
	<li>Dividir la mezcla en cinco tubos de 1.5 mL.</li>
	<li>Incubar por 2 h a temperatura ambiente (RT) en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender en 1 mL de PBS estéril, centrifugar a 15.000 x g por 10 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Repetir 2,5 dos veces más para eliminar el exceso biotina une solución.</li>
	<li>Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Transferir 100 μl de solución de conjugado estreptavidina - granos magnéticos de 10 mg/mL en un tubo de 1,5 mL y dejarla en la rejilla magnética de 5 min.</li>
	<li>Quitar el disolvente con una pipeta, tomar el conjugado estreptavidina-solución granos magnéticos de la rejilla magnética y resuspender con 1 mL de suspensión bacteriana revestido de biotina preparado en el paso 2.7.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un termobloque con agitación constante a 350 rpm.</li>
	<li>Coloque la solución en la rejilla magnética, espere 5 minutos y luego retire con una pipeta de las bacterias que no adhirió a la pared (guardarlo en un tubo etiquetado como &#34; bacterias sin recubrimiento &#34;). La fracción que se adhiere a la pared del tubo en contacto con el imán es la bacteria biotina/estreptavidina-revestido.</li>
	<li>Quitar el tubo que contiene las bacterias marcadas de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Colocarlo otra vez en la rejilla magnética, espere 5 minutos y utilice una pipeta para extraer el PBS.</li>
	<li>Repita 2.13 y 2.14 dos veces para eliminar todas las bacterias que no están cubiertas con las bolas magnéticas conjugado estreptavidina.</li>
	<li>Después del último lavado, resuspender las bacterias recubiertas en 500 μl de PBS estéril y etiquetar el tubo como &#34; revestido bacterias &#34;.</li>
	<li>Contar las colonias formando unidades (UFC) de ambos &#34; no recubiertas de bacterias &#34; y &#34; recubiertas de bacterias &#34; soluciones por diluciones seriadas en placas de agar BHI de la galjanoplastia. Se obtienen aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bacterias recubiertas de 20 mL de suspensión bacteriana inicial con OD 600 de 1.0. Mantener la suspensión bacteriana cubierto a 4 ° C para ser utilizado al día siguiente para infectar a los macrófagos.</li>
</ol> 3. Infección de BDMDs <ol><li>el mismo día cuando las bacterias están recubiertas con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos, placa completamente el distinguido BMDMs 22 platos de 6 cm con una densidad de 5 x 10 6 células por plato.</li>
	<li>Al día siguiente, centrifugar la suspensión bacteriana cubrió a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) en una concentración de 10 x 10 6 UFC/mL.</li>
	<li>Para infectar a los macrófagos en una multiplicidad de infección (MOI) de 10, quitar el medio de las BMDMs y añadir 5 mL de suspensión bacteriana cubierto preparado. MOI óptima puede evaluarse para cada tipo de células o el propósito experimental de los fagosomas aisladas.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para sincronizar fagocitosis.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO 2 durante 30 minutos iniciar la fagocitosis. Otros tipos de células pueden requerir tiempos de incubación diferentes para asegurar la internalización de la bacteria.</li>
	<li>Quitarlo del medio que contiene bacterias de los platos y lavar las células con RPMI tres veces para eliminar las bacterias internalizadas no.</li>
	<li>Por último, añadir 10 mL de RPMI con 10% FBS y 50 μg/mL gentamicina para matar a las bacterias fagocitadas no.</li>
	<li>Incubar los infectados BMDMs a 37 ° C con 5% CO 2 hasta que punto el tiempo deseado. El momento deseado debe ser determinada experimentalmente según la bacteria y tipo de la célula usado y el propósito de análisis. Para el estudio de los acontecimientos tempranos de la fusión fagosoma-endosome en S. BMDMs typhimurium infectada, se recomienda una incubación de 30 min. Para el análisis de acontecimientos posteriores, fagosomas pueden extraerse después de 2 h o 4 h de incubación. Incubación prolongada de macrófagos con S. Typhimurium más allá de 24 h resulta en la muerte de los macrófagos. Extendido la infección intracelular antes de la extracción de fagosoma probablemente podría conducir a la degradación de las moléculas de biotina. Sin embargo, no se observó pérdida de biotina en bacterias recubiertas hasta 24 h.</li>
</ol> 4. Aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas almacenador intermediario <ol><li>preparar el volumen de fagosoma necesario aislamiento A (50 mM tubos, pH.7, 50 mM de MgCl 2, 5 mM EGTA) mediante la adición de Ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 1 mM, citocalasina B para un final concentración de 10 μm y proteasa y fosfatasa inhibidores según lo recomendado por el fabricante. 
	Nota: TDT y Cytochalasin B deben agregarse al búfer de aislamiento de fagosoma A siempre inmediatamente antes de usar. Cytochalasin B altera el citoesqueleto, facilitando la ruptura de la membrana celular.</li>
	<li>En el momento deseado punto, eliminar el medio de las células infectadas y lavar con PBS estéril calentada a RT.</li>
	<li>Añadir 750 μl de phagosome aislamiento del almacenador intermediario A por plato e incubar 20 minutos en hielo. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento A.</li>
	<li>Añadir 250 μl de tampón de fagosoma aislamiento B (tubos de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, manitol de 220 mM y 68 mM sacarosa). Roca la placa para que el buffer llegue a toda la superficie del plato. Cuando se utiliza un número diferente de células, debe ajustarse proporcionalmente el volumen de tampón de aislamiento B.</li>
	<li>Eliminar las células del plato raspando suavemente usando un policía de goma y transferirlos a un tubo de 1.5ml previamente enfriada.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de una aguja de 26G utilizando una jeringa de 1 mL por lo menos 15 veces (una aspiración y una expulsión del suspensión del recuento como una vez). Esto es suficiente para liberar el contenido citosólico de BMDMs. El número de pasadas a través de la aguja debe ser optimizado para cada tipo de celular.</li>
	<li>Coloque la suspensión de células en la rejilla magnética y espere 5 minutos. Las partículas de imán son los fagosomas que contienen revestido - S. Typhimurium. La suspensión contiene el resto de los componentes celulares.</li>
	<li>Transferir la suspensión a un tubo de 1,5 mL etiquetado como &#34; citosol &#34;.</li>
	<li>Quitar el tubo con los fagosomas aislados de la rejilla magnética y resuspender en 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Coloque la suspensión del fagosoma en la rejilla magnética, espere 5 minutos y retirar el PBS.</li>
	<li>Repita los pasos 4.9 y 4.10 para lavar el aislado S. typhimurium-que contienen fagosomas.</li>
	<li>Finalmente retirar el PBS y resuspender los fagosomas en el buffer necesario; por ejemplo, en un tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación para análisis de proteínas. Aproximadamente el 50-200 μg de proteína se obtiene por ejemplo siguiendo este protocolo, dependiendo de la cantidad inicial de las células y el Ministerio del interior de la infección de.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Un nuevo método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina conjugada granos magnéticos se describe aquí. Después de la interrupción de la membrana celular suave, fagosomas que contienen bacterias pueden ser fácilmente extraídos mediante una rejilla magnética. Demostramos que el etiquetado de las bacterias conserva la capacidad del patógeno para inducir inflamación y no altera la propiedad fagocítica de la célula huésped...

Los macrófagos circulan células fagocíticas especializadas que detectan, fagocitan y degradarán cualquier partícula extranjera presente en los tejidos periféricos, que van desde células apoptóticas a la invasión de microorganismos como las bacterias. Sobre superficie receptor-medió el reconocimiento de marcadores específicos del patógeno comúnmente presentes en la superficie de los microorganismos (conocido como patrones moleculares asociados a patógenos PAMPs), los macrófagos inician una reorganización compleja de la membrana celular en orden para rodear y fagocitan el patógeno1.
El patógeno engulló entonces contenido por el macrófago en una vesícula intracelular denominada fagosoma. A través de una serie de eventos de fisión con otras vesículas de endosomas y lisosomas y fusión, el fagosoma que contiene el patógeno adquiere un conjunto de proteínas necesario para la eliminación del contenido phagosomal. Por lo tanto, la composición enzimática del fagosoma es altamente variable en el transcurso de este proceso, conocido como de la maduración del fagosoma2.
Poco después de la fagocitosis, la multimérica Complejo ATPasa vacuolar (v-ATPasa) se incorpora a la membrana del fagosoma por fusión con endosomas3. Este complejo utiliza ATP para protones bomba desde el citosol al lumen del fagosoma4. Acidificación del fagosoma es esencial para los eventos de fusión con otras vesículas5 y para la activación de un gran número de enzimas degradativas dependiente de pH6. Otro complejo enzimático multimérica que rápidamente se ensambla en la membrana del fagosoma es el complejo NADPH-oxidasa (NOX). NOX complejo oxida NADPH para producir especies reactivas del oxígeno (ROS) que se secretan en el lumen del fagosoma y que contribuyen significativamente a la muerte de los microorganismos ingieren7.
Durante los pasos iniciales de la maduración, fagosomas presentan marcadores típicamente como Rab5 y Rab7 de endosomas temprano y tardío respectivamente junto con la subunidad de0 V de la v-ATPasa8. Fusión de los fagosomas con los lisosomas y endosomas finales resulta en la exposición del patógeno fagocitado a una gran variedad de enzimas hidrolíticas tales como lipasas y proteasas catepsina y β-galactosidasa9. Acidificación del lumen también se requiere para la activación de estas enzimas. Por ejemplo, el escote de catepsina D para producir la forma corta activa es dependiente de pH10. Estas enzimas degradan el patógeno y median la producción de péptidos derivados del patógeno cortos que son presentados por el macrófago de histocompatibilidad (MHC) clase II moléculas complejas a las células T para desencadenar una respuesta inmune adaptativa11.
Por lo tanto, la maduración del fagosoma es crucial para la respuesta inmunitaria innata y une los brazos del sistema inmune innatos y adaptativos. No es de sorprender que los patógenos han desarrollado estrategias para superar la eliminación por los macrófagos a través del proceso anteriormente descrito de la maduración del fagosoma. Por ejemplo, la bacteria intracelular tuberculosis del Mycobacterium y Legionella pneumophila prevenir la maduración del fagosoma por Asamblea de v-ATPase inhibidor y lumen consecuente acidificación12,13 . Otras bacterias como la Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducen la formación de poros en la membrana del fagosoma para escapar en el citosol14,15. Por otra parte, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es capaz de modificar las propiedades del fagosoma dentro de la vacuola para transformarlo en un lugar adecuado para su replicación16. Esta capacidad hace S. typhimurium un modelo muy interesante para estudiar la interferencia mediada por el patógeno de la maduración del fagosoma.
S. typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. Bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y dentro de fagosomas17. Algunos informes han descrito previamente S. typhimurium-fagosomas que contienen actualmente los fabricantes de endosomas y lisosomas18, y otros estudios han encontrado la fusión fagosoma-lisosoma prevenida sobre S. De la infección typhimurium19.
Inicialmente, maduración de fagosoma al S. la infección typhimurium ha sido investigada por microscopia de la inmunofluorescencia. El desarrollo de técnicas para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas permitió un estudio más preciso del contenido en términos de marcadores endosome y lisosoma fagosoma. Hasta la fecha, el método principal utilizado para el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas es el fraccionamiento subcelular en sacarosa paso gradientes18,20. Sin embargo, este método requiere varios pasos de centrifugación que pueden causar daños mecánicos en fagosomas, pueden afectar la estabilidad de phagosomal componentes (proteínas y lípidos) y consume tiempo. Por otra parte, requiere el uso de una ultracentrífuga: una pieza de equipo especializado que no es accesible para cada laboratorio.
Recientemente, se ha aplicado un nuevo enfoque para el aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, en la que bacterias patógenas están marcados con lipopetide biotinilado (Lipobiotin) y más tarde extrajeron usando bolas magnéticas conjugado estreptavidina21 . Proponemos un método alternativo complementario por etiquetado bacterianas superficiales macromoléculas que contienen amina con NHS-biotina seguido de bolas magnéticas conjugado estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método son altamente enriquecidos en marcadores endosome y lisosoma y pueden utilizarse para una amplia gama de ensayos, de análisis de proteínas para análisis ómicas. Además, no requiere equipo especializado como ultracentrífugas. Por otra parte, mediante la eliminación de los pasos de centrifugación, el daño mecánico a los fagosomas y la cantidad de tiempo empleado se reducen considerablemente. Este método se puede adaptar fácilmente para el aislamiento de los fagosomas que contienen otras bacterias como la gram-positivos Staphylococcus aureus, incluido también en este manuscrito. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es un simple, rentable, y menos consumo de tiempo que el aislamiento clásico de sacarosa gradiente-ultracentrifugación, representación altamente enriquecido fagosomas que contienen bacterias.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&amp;micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium es una bacteria intracelular facultativa que produce gastroenteritis en humanos. Después de invasión de la lámina propia, S. bacterias typhimurium son rápidamente detectadas y fagocitadas por los macrófagos y contenidas en vesículas denominadas fagosomas para degradar. Aislamiento de S. typhimurium-fagosomas que contienen han sido ampliamente utilizados para el estudio de cómo S. la infección typhimurium altera el proceso de maduración del fagosoma para evitar la degradación bacteriana. Clásicamente, el aislamiento de las bacterias que contienen fagosomas ha llevado a cabo por centrifugación gradiente de sacarosa. Sin embargo, este proceso lleva tiempo y requiere de equipo especializado y un cierto grado de destreza. Se describe aquí es un método simple y rápido para el aislamiento de S. typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con bolas magnéticas conjugado con biotina-estreptavidina. Fagosomas obtenidos por este método pueden suspenderse en cualquier buffer de elección, permitiendo la utilización de fagosomas aisladas para una amplia gama de ensayos, como el análisis de proteínas, metabolitos y lípidos. En Resumen, este método para el aislamiento de S. typhimurium-que contienen fagosomas es específico, eficiente, rápida, requiere equipos mínimos y es más versátil que el clásico método de aislamiento por gradiente de sacarosa-ultracentrifugación.

Aislamiento de bacterias que contienen fagosomas en este protocolo requiere el biotinylation de las bacterias como un primer paso. Por lo tanto se evaluó la eficacia de S. Biotinilación de typhimurium por análisis de microscopía confocal de BMDMs infectadas con biotinilado mCherry -S. typhimurium marcado con Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs fueron infectados como se describe en este protocolo con mCherry -S. typhimurium previa...

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Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.6K vistas.  University of Cologne. Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Investigación

Inmunología e Infección

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

La purificación del patógeno a partir de vacuolas<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados por fagocitos

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Caracterización de la peritonitis séptica inducida por Salmonella Typhimurium en ratones

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Uso de LPS bacteriano para eliminar bacteriófagos de cultivos de Salmonella

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

Autor destacado: Eliminación eficiente de bacteriófagos de cultivos infectados de salmonela mediante lipopolisacáridos

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Resumen

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Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

La purificación del patógeno a partir de vacuolas

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar

"Fagosoma Cierre de ensayo" para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Caracterización de la peritonitis séptica inducida por Salmonella Typhimurium en ratones

Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella

Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella

Eliminación de bacteriófagos de cultivos infectados de Salmonella