Robinson'ın laboratuarında araştırma hücresel stres yanıt Aging-Associated hastalıkları, Köln Üniversitesi, Almanya Köln mükemmellik kümede fon tarafından desteklenmektedir (CECAD; DFG içinde mükemmellik girişimi Alman Federal tarafından finanse edilen ve hükümetlerin devlet) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln servet ve Maria-Pesch Vakfı Üniversitesi Köln, Almanya dan gelen hibe.

patojen S. kullanımıyla ilgili tüm adımları Typhimurium BSL-2 veya daha yüksek biyolojik güvenlik seviye yapılmalıdır. Kültür ve S. kaplama Typhimurium gibi kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) enfeksiyonu önlemek amacıyla laminar akış başlık altında gerçekleştirilmelidir. S. yalıtım Typhimurium-phagosomes içeren herhangi bir BSL-2 laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.
 kemik iliği çıkarma fareler makrofajlar içine onun farklılaşma için hayvan refah kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve doğa, Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet ajansı tarafından onaylanmış Çevre ve tüketici koruma [Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Dosya no: 84-02.05.40.14.082 ve 84-02.04.2015.A443] ve Köln Üniversitesi.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>Inoculate S. Typhimurium (SL1344 zorlanma) üzerinden 5 mL bakteriyel bir döngü kullanarak beyin kalp infüzyon (BHI) suyu içine bakteriyel bir koloni.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyon bir kuluçka 37 ° C'de gecede sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>19 mL konik bir şişesi BHI suyu içine 1 mL bakteriyel süspansiyon, ertesi gün, transfer ve sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	S. <li>izlemek 600 optik yoğunluk (OD) ölçme tarafından typhimurium büyüme nm (OD 600) bir Spektrofotometre ile. Ölçümler yaklaşık her 30 dk. alınmalıdır</li>
	<li>Ne zaman OD 600 1.0 ulaşır, inkübatör ve transfer 50 mL tüp içine bakteriyel süspansiyon kaldırın. Santrifüj kapasitesi bakteri 5400 x g 15dk için de 4'te ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) resuspend.</li>
	<li>Vasıl 5400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 4.9 mL steril PBS bakterilerde resuspend.</li>
</ol> 2. S. typhimurium NHS-Biotin/Streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar ile kaplanması <ol><li>10 mg/ml eklemek 100 µL biotin (NHS-Biotin çözünmüş Dimetil sülfoksit, DMSO) çözüm taze hazırlanmış, bakteriyel süspansiyon bağlama önceki adımda hazırlanan. Örneğin, NHS-Biotin 5 mg 0.5 mL steril DMSO içine oranında seyreltin. Mix düzgün tarafından yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting.</li>
	<li>Karışımı beş 1,5 mL tüpler içine split.</li>
	<li>Incubate 2 h üzerinde bir termo (RT) oda sıcaklığında sabit 350 rpm'de sallayarak ile için.</li>
	<li>RT, 10 dak için 15.000 x g, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>1 ml steril PBS, RT, 10 min için 15.000 x g, santrifüj resuspend ve süpernatant atın.</li>
	<li>Tekrar adım 2.5 iki kez daha çözüm bağlama fazlalığı biyotin tamamen çıkarmak.</li>
	<li>Sonra son yıkama, pelet 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>10 mg/mL manyetik boncuklar streptavidin Birleşik çözüm 1.5 mL tüp içine 100 µL transfer ve 5 dakika süreyle manyetik rafta bırakın</li>
	<li>Solvent bir pipet ile kaldırmak, streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar çözüm manyetik raf almak ve 1 mL 2.7 adımda hazırlanan biotin kaplı-bakteriyel süspansiyon ile resuspend.</li>
	<li>Sürekli 350 rpm'de sallayarak ile 1s için RT, bir termo üzerinde Incubate.</li>
	<li>Çözüm manyetik raf yerleştirin; için 5 dakika bekleyin ve sonra bir pipet ile duvara uygun değil bakteri kaldırın (olarak etiketlenmiş bir tüp devam &#34; sigara kaplı bakteri &#34;). Tüp mıknatıs ile temas duvarına kalarak kesir biotin/streptavidin-kaplı bakteri olduğunu.</li>
	<li>Manyetik raf etiketli bakteri içeren tüpü çıkarması ve 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Tekrar manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Adımları yineleyin 2,13 ve 2.14 iki kez daha streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı değil tüm bakteriler kaldırmak için.</li>
	<li>Son yıkama sonra kaplı bakteri steril PBS 500 µL içinde resuspend ve tüp olarak etiket &#34; kaplı bakteri &#34;.</li>
	<li>Saymak birimleri (cfu) her iki oluşturan colony &#34; sigara kaplı bakteri &#34; ve &#34; kaplı bakteri &#34; tarafından BHI agar plakalar üzerinde seri dilutions kaplama çözümleri. Yaklaşık 2 x 10 8 cfu/mL kaplı-bakteri gelen ilk bakteriyel süspansiyon 20 mL OD 600 1.0 ile elde edilir. Ertesi gün makrofajlar bulaştırmak için kullanılmak üzere 4 ° C kaplı-bakteriyel süspansiyon devam.</li>
</ol> 3. Enfeksiyon BDMDs <ol><li>ne zaman bakteri kaplı biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile aynı günde tam 6 cm yemekler yemek başına 5 x 10 6 hücre yoğunluğu, farklılaşmış BMDMs 22 plaka.</li>
	<li>Bir sonraki günü kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 dak için 15.000 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve % 10 fetal sığır serum ile (FBS) takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 10 x 10 6 cfu/mL konsantrasyonu resuspend.</li>
	Makrofajlar enfeksiyon (MOI) 10, çokluğu, bulaştırmak için <li>Orta BMDMs kaldırın ve hazırlanan kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 mL ekleyin. En iyi MOI her hücre türü ya da izole phagosomes deneysel amacı için değerlendirildi.</li>
	<li>RT 10 dk fagositoz eşitlemek için Incubate.</li>
	<li>Incubate % 5 CO 2 kuluçka fagositoz başlatmak 30 dk 37 ° C'de. Diğer hücre tipleri farklı kuluçka kez bakteri içselleştirilmesi sağlamak için gerektirebilir.</li>
	<li>Bakteri içeren orta gelen yemekler kaldırmak ve sigara içselleştirilmiş bakteri kaldırmak için üç kez RPMI hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Sonunda sigara phagocytized bakterileri öldürmek için RPMI %10 FBS ve 50 µg/mL viomisin içeren 10 mL ekleyin.</li>
	İstenen saat noktayı kadar <li>37 ° c % 5 CO 2 ile enfekte BMDMs kuluçkaya. İstenen saat noktası deneysel olarak bakteri ve hücre türü kullanılan ve analiz amacı göre belirlenmelidir. S. phagosome-endosome füzyon olaylarda erken çalışma için BMDMs, Typhimurium enfekte bir 30 dk kuluçka önerilir. Daha sonra olayları analiz için phagosomes 2 saat veya 4 h, kuluçka sonra elde edilebilir. Makrofajlar S. ile uzun süreli inkübasyon Typhimurium 24 h ötesinde makrofajlar ölümle sonuçlanır. Phagosome ayıklama muhtemelen biotin molekülleri düşmesine neden olabilir önce hücre içi enfeksiyon genişletilmiş. Ancak, biz kaybı biotin kaplı-bakteri kadar 24 h gözlemleme</li>
</ol> 4. S. yalıtım Typhimurium-Phagosomes içeren <ol><li>hazırla gerekli phagosome hacmi yalıtım arabellek (1 mM, Cytochalasin B bir final için son bir konsantrasyon dithiothreitol (DTT) ekleyerek bir 50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) üretici tarafından önerilen gibi 10 µM ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri konsantrasyon. 
	Not: DTT ve Cytochalasin B phagosome yalıtım arabellek A eklenmesi gerekir her zaman hemen önce kullanmak. Cytochalasin B hücre membran rüptürü kolaylaştırmak sitoiskeleti bozan.</li>
	<li>İstediğiniz zaman gelin, enfekte hücreleri ortamından çıkarmak ve steril PBS için RT. ısındı yıkayın</li>
	<li>Phagosom ekleyin 750 µLe yalıtım çanak A tampon ve buz üzerinde 20 dk kuluçkaya. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek A hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Ekleyin 250 µL phagosome yalıtım arabelleği B (50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol ve 68 mM Sükroz). Rock arabellek yemeğin tam yüzey ulaştığından emin olmak için plaka. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek B hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Hücreleri nazikçe bir lastik polis kullanarak kazıma yemek kaldırmak ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer.</li>
	<li>26 G iğne (bir aspirasyon artı hücre süspansiyon sayısı bir fırlatma bir kez olarak) en az 15 kere 1 mL şırınga kullanarak hücre süspansiyon geçer. Bu BMDMs sitozolik içeriğini serbest bırakmak için yeterli. İğne geçer sayısı her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon manyetik raf yerleştirin ve 5 dakika bekleyin. Parçacıklardır mıknatıs için bağlı kaplı - S. içeren phagosomes Typhimurium. Süspansiyon hücresel bileşenleri geri kalanı içerir.</li>
	<li>Süspansiyon olarak etiketlenmiş bir 1,5 mL tüp içine transfer &#34; sitozol &#34;.</li>
	<li>İzole phagosomes ile tüp manyetik raf çıkarmak ve onları 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Phagosome süspansiyon manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırın.</li>
	<li>Tekrarlama adım 4,9 ve izole S. yıkamayı 4.10 Typhimurium-phagosomes içeren.</li>
	<li>Son olarak PBS kaldırmak ve phagosomes resuspend gerekli arabellek; Örneğin, bir radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek protein analizi için. Yaklaşık 50-200 µg protein hücrelerinin başlangıç tutarı ve enfeksiyon MOI bağlı olarak bu protokol sonrası örnek başına elde edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

S. yalıtım için yeni bir yöntem Typhimurium-phagosomes bakterileri biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren burada anlatılan. Hücre zarının nazik bozulma sonra bakteri içeren phagosomes kolayca bir manyetik raf kullanarak elde edilebilir. Gösterdiğimiz bakteri etiketleme iltihap ikna etmek için kapasite patojenin koruyan ve ana hücrenin fagositik özelliğini değiştirmez. Bakteri ve endosome/lysosome bu yöntemle elde edilen phagosomes önemlisi,...

Makrofajlar algılayan, yutmak ve herhangi bir yabancı parçacık mikroorganizmalar bakteri gibi işgal için apoptotik hücreler arasında değişen periferik dokularda mevcut aşağılamak özel fagositik hücreler dolaşmaktadır. Reseptör aracılı yüzey tanıma patojen belirli işaretleri (patojen ilişkili moleküler desen veya PAMPs da bilinir) mikroorganizmalar yüzeyinde yaygın olarak mevcut makrofajlar içinde hücresel membran karmaşık bir yeniden yapılanma başlatmak. sipariş surround ve patojen1işbirliği için.
Yutulmak patojen sonra phagosome bilinen bir hücre içi vezikül makrofaj tarafından yer alıyor. Diğer veziküller endosomes ve organellerin gibi olaylarla fisyon ve füzyon dizi sayesinde patojen içeren phagosome phagosomal içerik ortadan kaldırılması için gerekli proteinleri bir dizi satın aldı. Bu nedenle, phagosome enzimatik kompozisyon phagosome olgunlaşma2olarak bilinen bu işlem süresince son derece değişkendir.
Fagositoz kısa bir süre sonra karmaşık katmaninin ATPaz (v-ATPaz) Fusion endosomes3phagosome membran dahil multimeric. Bu karmaşık ATP sitozol phagosome4Lümen için gelen pompa proton için kullanır. Phagosome asitleştirme diğer veziküller5 füzyon olaylarla ve pH bağımlı degradative enzimler6çok sayıda aktivasyonu için gereklidir. Phagosome membran üzerinde hızlı bir şekilde monte başka bir multimeric enzimatik karmaşık NADPH-oksidaz (NOX) karmaşık değil. NOX karmaşık NADPH bu phagosome Lümen salgılanan ve bu önemli ölçüde katkı7yutulmak mikroorganizmaların öldürülmesi için Reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için oksitlenir.
Olgunlaşma ilk adımları uyguladığınızda, phagosomes işaretleri genellikle Rab5 ve erken ve geç endosomes v-ATPaz8V0 alt birim ile birlikte sırasıyla Rab7 gibi mevcut. Organellerin ve geç endosomes phagosomes füzyonu phagocytized patojen maruz hydrolytic enzimler cathepsin proteaz, lipaz ve β-galaktozidaz9gibi çok çeşitli sonuçlanır. Lümen asitleştirme da bu enzimlerin aktivasyonu için gereklidir. Örneğin, etkin kısa form üretmek için cathepsin D bölünme pH bağımlı10' dur. Bu enzimler patojen bozulmasına yol açar ve makrofaj MHC kompleksi (MHC) Sınıf II molekülleri bir adaptif immün yanıt11tetiklemek için T hücrelere tarafından sunulan kısa peptidler patojen kaynaklı üretim aracılık.
Bu nedenle, phagosome olgunlaşma doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için çok önemlidir ve bağışıklık sisteminin doğuştan gelen ve edinilmiş silah bağlar. Patojenler ortadan kaldırılması phagosome olgunlaşma yukarıda açıklanan sürecinde makrofajlar tarafından üstesinden gelmek için stratejiler geliştirmişlerdir hiç de şaşırtıcı değil. Örneğin, hücre içi bakterilerin Mycobacterium tüberküloz ve Legionella pneumophila inhibe v-ATPaz derleme ve bunun sonucunda Lümen asitleştirme12,13 phagosome olgunlaşma önlemek . Listeria Monositogenez veya Shigella flexneri gibi diğer bakteri sitozol14,15kaçmak için phagosome membran gözenek oluşumu teşvik. Öte yandan Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) phagosome içinde onun çoğaltma16için uygun bir yer haline dönüştürmek için çarpıtma özelliklerini değiştirmek yapabiliyor. Bu yeteneği S. yapar typhimurium patojen-aracılı girişim phagosome olgunlaşma eğitim için çok ilginç bir model.
S. typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve phagosomes17içinde bulunan. Bazı raporlar daha önce o S. tarif var Typhimurium-içeren phagosomes vericiler için hem endosomes hem de organellerin18sunmak ve diğer çalışmalar phagosome-lysosome füzyon S. engelledi bulduk Typhimurium enfeksiyonu19.
Başlangıçta, phagosome olgunlaşma üzerine S. Typhimurium enfeksiyonu ayirt mikroskobu tarafından araştırmış. Bakteri içeren izolasyonu için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde phagosomes etkin phagosome içerik endosome ve lysosome açısından daha doğru bir çalışma. Bugüne kadar bakteri içeren yalıtımı için kullanılan ana yöntem phagosomes hücre altı ayırma Sükroz adım degradeler18,20olduğunu. Ancak, bu yöntem phagosomes mekanik zarar verebilir, phagosomal bileşenleri (protein ve yağlar) kararlılığını etkileyebilir ve zaman alıcı birden fazla Santrifüjü adımları gerektirir. Ayrıca, bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir: her laboratuvar için erişilebilir değil özel ekipman parçası.
Son zamanlarda, yeni bir yaklaşım bakteriyel içeren izolasyonu için uygulanmış olan bakteriyel patojenler biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ile etiketlenir phagosomes, çıkarılan manyetik boncuklar21 streptavidin Birleşik kullanarak . Önerdiğimiz alternatif tamamlayıcı bir yöntem bakteriyel yüzey Amin içeren oluştururlar NHS-Biotin ile etiketleme tarafından streptavidin Birleşik manyetik boncuklar tarafından takip. Bu yöntemle elde edilen phagosomes son derece endosome ve lysosome işaretleyicilerini zenginleştirilmiş ve deneyleri, protein analizi omics analiz için geniş bir yelpazesi için kullanılır. Ayrıca, ultracentrifuges gibi özel ekipman gerektirmez. Ayrıca, Santrifüjü adımları ortadan kaldırarak, phagosomes mekanik hasar ve istihdam süreyi önemli ölçüde azalır. Bu yöntem gibi gram-pozitif Staphylococcus aureusda bu el yazması dahil, diğer bakteriler içeren phagosomes yalıtım için kolayca adapte edilebilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren bu basit, düşük maliyetli, ve daha az zaman klasik yalıtım Sükroz tarafından alıcı degrade-ultrasantrifüj son derece oluşturma, bakteri içeren phagosomes zenginleştirilmiş.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluidMag Streptavidin</td>
			<td>Chemicell</td>
			<td>4205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4175.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1861280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYNAL or DynaMag Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial loop (10&#181;l)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5-streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-beta-actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-34974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-10764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cathepsin D antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tomm20 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calnexin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-46669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-20357</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve bozulmuş için phagosomes bilinen veziküller içinde bulunan. S. yalıtım Typhimurium-içeren phagosomes yaygın olarak kullanılan çalışma nasıl S. Typhimurium enfeksiyonu bakteriyel bozulma önlemek için phagosome olgunlaşma sürecinin değiştirir. Klasik, yalıtım bakteri içeren phagosomes Sükroz degrade Santrifüjü tarafından gerçekleştirilen. Ancak, bu işlem zaman alır ve özel ekipman ve belirli bir ölçüde beceri gerektirir. Burada açıklanan S. yalıtım için basit ve hızlı bir yöntem olduğunu Typhimurium-makrofajlar üzerinden phagosomes bakterileri biotin streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren. Bu yöntemle elde edilen phagosomes deneyleri, protein, metaboliti ve lipid çözümlemesi gibi geniş bir yelpazesi için izole phagosomes kullanımını sağlayan seçtikleri herhangi bir arabellekte askıya alınabilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren belirli, verimli, hızlı, en az ekipman için ve yalıtım Sükroz degrade-ultrasantrifüj tarafından klasik yöntem'den daha çok yönlüdür.

Yalıtım bakteri içeren phagosomes bu iletişim kuralı tarafından bakteri biotinylation bir ilk adım olarak gerektirir. Biz bu nedenle S. etkinliği değerlendirilir Typhimurium biotinylation biotinylated ile enfekte BMDMs confocal mikroskobu analizi tarafından mCherry -S. typhimurium Cy5-Streptavidin ile Etiketlenmiş. Kısaca, BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium daha önce biot...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.5K Görüntüleme.  University of Cologne. Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Video: Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key players in health and disease, acting as phagocytes during immune defense and mediating trophic, maintenance, and repair functions. Although it has been possible to study some of the molecular processes involved in human macrophage function, it has proved difficult to apply genetic engineering techniques to primary human macrophages. This has significantly hampered our ability to interrogate the complex genetic pathways involved in macrophage biology and to generate models for specific disease states. An off-the-shelf source of human macrophages that is amenable to the vast arsenal of genetic manipulation techniques would, therefore, provide a valuable tool in this field. We present an optimized protocol that allows for the generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in vitro. These iPSC-derived macrophages (iPSC-DMs) express human macrophage cell surface markers, including CD45, 25F9, CD163, and CD169, and our live-cell imaging functional assay demonstrates that they exhibit robust phagocytic activity. Cultured iPSC-DMs can be activated to different&#160;macrophage states that display altered gene expression and phagocytic activity by the addition of LPS and IFNg, IL4, or IL10. Thus, this system provides a platform to generate human macrophages carrying genetic alterations that model specific human disease and a source of cells for drug screening or cell therapy to treat these diseases.

This protocol describes the robust generation of macrophages from human induced pluripotent stem cells, and methods for their subsequent characterization. Cell surface marker expression, gene expression, and functional assays are used to assess the phenotype and function of these iPSC-derived macrophages.

Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu

Macrophages are present in most vertebrate tissues and comprise widely dispersed and heterogeneous cell populations with different functions. They are key ...