Agradecemos sinceramente el Dr. Mustafa Khokha, Universidad de Yale, proporcionando el uso de sus recursos de laboratorio. Agradecemos a Mr. Wu Ming-Jie excelente asistencia técnica. EF es un investigador HHMI. Este trabajo fue financiado por una donación de la John Monsky y Jennifer Weis Monsky fondo de investigación de la enfermedad de Lyme.

1. elaboración de plantillas de la DNA
<ol><li>Descargar la secuencia de rRNA 16S específica para cada género bacteriano de la NCBI diseño y base de datos de reacción en cadena polimerasa (PCR) compatible hacia adelante y atrás cartillas que se amplifican regiones específicas de géneros (~ 200-250 pares bajos largo) como se describió anteriormente 19. también consulte el código abierto las bases de datos SILVA20,21 y probeBase22 online recursos para sondas de oligonucleótidos dirigidos a rRNA y cartillas, como sondas de RNA para algunos géneros bacterianos pueden ser comercialmente disponible. Nota: Es importante seleccionar regiones de genes que son específicos a específicos géneros y asegurar que primers diseñados no amplificar géneros bacterianos relacionados. Esto es fundamental para conseguir la hibridación de géneros/gene-específico sonda.</li>
	<li>Alimentación de las garrapatas para 24, 48 o 72 h en ratones, diseccionar tripas de garrapata y elaborar ARN y cDNA de tripas de garrapatas como descrito anterior23. CDNA de uso como plantilla para PCR amplifican amplicones específicos de géneros utilizando un termociclador. Ejecutar una parte alícuota de la polimerización en cadena-producto/productos en gel de agarosa 1.5% y confirmar que el amplicon corresponde al tamaño esperado por visualización bajo luz ultravioleta (UV) utilizando un gel sistema de imagen.</li>
	<li>Clonar el bacteriano 16S ribosomal RNA amplicon de interés en un vector disponible comercialmente de TA (Tabla de materiales) que contienen promotores de la ARN polimerasa adecuados para Polimerasas del bacteriófago (SP6, T7 y T3). La secuencia de los clones para confirmar la identidad de los amplicones y la direccionalidad de la copia con respecto a cada uno de los promotores. En base a esto, determinar el promotor de la opción generar sentido o antisentido RNA puntas de prueba (figura 1).</li>
	<li>Alinear 1 mg del plásmido con una enzima de restricción apropiada en un volumen de reacción de hasta 30 µLfor 2 h en las temperaturas recomendadas por el fabricante. Elegir las enzimas de restricción basadas en el promotor que se utilizarán para generar el sentido o la punta de prueba antisentido (figura 1). Verificar la linearización de visualización de 2 μl de la reacción de digestión en gel de agarosa al 1%.</li>
	<li>Purificar las restantes 28 μl de ADN digerido utilizando un kit de potabilización comercialmente disponible de PCR producto columna y cuantificar la concentración de DNA por el espectrofotómetro. Nota: Algunas sondas de sentido pueden causar tinción de fondo mucho más alta que la correspondiente sonda antisentida y otras opciones deben ser exploradas. Controles negativos alternativos incluyen plásmidos codifican secuencias no representadas en la muestra u otro sondeo que produce un patrón distintivo de la hibridación.</li>
</ol>2. construcción de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Preparar la mezcla de nucleótidos mediante la combinación 7.5 μl 100 mm UTP, 25 μl de 10 mM digoxygenin-UTP y 10 μl cada una de 100 mM ATP, GTP y CTP, en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.</li>
	<li>Realizar la transcripción en vitro usando kits de polimerasa T7 o Sp6 RNA disponibles comercialmente, utilizando 1 μl de la mezcla de nucleótidos (paso 2.1) y 0.25 - 1 μg de plantilla de ADN. Llevar el volumen hasta 20 μl con agua. Flick el tubo para combinar y pulso spin. Incubar a 37 ° C por 2.5-3 h. Nota: Construcción de la sonda ha tenido éxito con plásmido digerido concentraciones tan bajas como 7 ng/μl, pero concentraciones típicas en esta gama de paso de 15-25 ng/μl. La reacción de transcripción también se incuba durante la noche a 37 ° C, pero esto no aumentó significativamente la producción de RNA.</li>
	<li>Añadir 1 μl de DNasa (2.000 unidades/μL) y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. No exceda 10 minutos, o la enzima puede comenzar a degradar RNA.</li>
	<li>Añadir 30 μl de cloruro de litio de helada de 7,5-8 M y 30 μl de agua libre de nucleasa refrigerada para precipitar el ARN. Flick el tubo para mezclar. Permitir la precipitación de RNA para proceder durante la noche a-20 ° C.</li>
	<li>Recoger el RNA por centrifugación a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar el precipitado una vez con 1 mL de etanol al 75% recién preparada en dietil pirocarbonato (DEPC) agua y repita la centrifugación.</li>
	<li>Retire y descarte el sobrenadante, invertir el tubo sobre una toalla de papel limpia y dejar para secar por 10 minutos Resuspender el precipitado en agua libre de nucleasa. Si el sedimento es fácilmente visible, resuspender en 25 μl. Si la pastilla es muy pequeña o no visible, resuspender en 15-20 μl. obtener una estimación de la concentración de RNA de espectrofotómetro. Nota: RNA típicas concentraciones entre 200-500 ng/μl.</li>
</ol>3. visualización de RNA puntas de prueba por electroforesis del Gel del ARN formaldehído para evaluar la pureza del ARN
PRECAUCIÓN: Formaldehído plantea un peligro de inhalación; por lo tanto, generar las soluciones necesarias para el análisis del gel del ARN en una campana de humos. Bromuro de etidio es un carcinógeno; Manéjela con cuidado.
<ol><li>Preparar un gel de agarosa 1% formaldehído como descrito previamente24 y echado el gel en una caja de gel libre de RNasas. Una vez fría, llenan el cuadro de gel 1 x buffer (1 x MOPS a pH 7,0, formaldehído al 5%) de ejecución.</li>
	<li>Preparar el tampón de muestra (bromuro de etidio de 400 mg/mL de 5 μl, 20 μl 10 x MOPS, 35 formaldehído μl y 100 μl formamida). 2 μl de sonda de RNA (paso 2.6) se combinan con 8 μl del tampón de muestra. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Preparar Buffer de carga de RNA mediante la combinación de 5 mL 50% de glicerol, formaldehído al de 10% 1 mL, azul de bromofenol 40 mg, 40 mg xileno cyanol y 20 μl de EDTA de 0,5 M (pH 7.5). Después de su uso, almacenar este tampón a-20 ° C.</li>
	<li>Agregar 3 μl de tampón de carga a la muestra de RNA de paso 3.2 y mezclar. Mantener los tubos en hielo.</li>
	<li>Cargar el volumen de toda muestra de paso 3.4 en el gel. Cargar una parte alícuota de escalera de RNA monocatenario junto a verificar tamaño de RNA. Correr el gel a 100 V o baja hasta que el colorante azul migra aproximadamente el 75% de la bajada del gel. Visualizar el RNA bajo luz UV utilizando un sistema de proyección de imagen del gel. Nota: Una sonda de RNA de buena calidad debe aparecer como una banda discreta con una movilidad corresponde al tamaño esperado de la sonda (figura 2, carril 1). Si la sonda aparece como difusa y graso banda (figura 2carril 2) esto no debe ser utilizado.</li>
</ol>4. colección de tripa y la fijación de la señal
<ol><li>Recoger a ninfas de Ixodes scapularis que han alimentado en ratones para los puntos de tiempo de interés. Nota: Para los efectos de esta técnica, garrapatas alimentan por 48 o 72 h trabajo mejor.</li>
	<li>Disecar el intestino de la garrapata en MEMFA (tabla 1) en un portaobjeto bajo el microscopio de disección, evitando daño al órgano tanto como sea posible. Coloque una marca sobre un portaobjetos limpio en 20-30 μl de MEMFA. Con un par de estéril alto carbono navaja acero #11 rebanada la región central en el escudo de la garrapata dejando el cuerpo de la garrapata. Presione suavemente el cuerpo para empujar la divertículos intestinal y las glándulas salivales a la cutícula del cuerpo. Separe las glándulas salivales y la tripa y sacar las tripas en la hoja de afeitar.</li>
	<li>Recoger vísceras en un tubo de 1,5 mL que contiene 500 μl MEMFA. Incubar el tubo a temperatura ambiente con balanceo suave durante 1 hora o toda la noche a 4 ° C. Nota: Marque las glándulas salivales también puede ser disecadas y semejantemente fijo y manchadas.</li>
	<li>Deshidratar los tejidos lavando suavemente 3 veces con 1 mL helada 100% de etanol. Que las tripas naturalmente se hunden hasta el fondo del tubo entre cada lavado, centrifugación puede dañar el tejido. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras en etanol 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. construcción de malla muestra cestas y soporte de la canasta de 24 pocillos
<ol><li>Cortar los fondos de 2 mL o 5 mL tubos de centrífuga de la encajar a presión-tapa utilizando una hoja de afeitar calentada solo filo de un bisturí. PRECAUCIÓN: La hoja puede necesitar ser recalentado varias veces antes de que se complete el corte.</li>
	<li>Cortar cuadrados de una malla de nylon de 110 μm ligeramente más grande que la nueva apertura del tubo. Adherir la malla en la parte inferior del tubo presionándolos juntos ligeramente en un plato caliente sobre fuego medio-bajo hasta que un buen sello. Deje que se enfríe, asegurar que no quedan huecos entre la malla y el tubo y recortar el exceso de malla alrededor de los bordes.</li>
	<li>Corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos tal que el borde de la cesta de la muestra hecho en el paso 5.2 a sentarnos en el agujero y no caer, dando una configuración donde los fondos de las canastas de muestra se sentará en los pozos cuando se colocan en el orificios de la cubierta.</li>
	<li>Utilice este soporte de la canasta equipada para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad para la totalidad del Protocolo de hibridación en situ . Utilice dos placas de 24 pocillos para que mientras se está produciendo una incubación, la otra placa está preparada para el siguiente lavado.</li>
</ol>6. hibridación in Situ : día 1 (tiempo: 4-5 h)
<ol><li>Valor de transferencia había etiquetado cestas muestra, separados por condición experimental y sonda de RNA la intención. Nota: La mancha por lo menos 5 agallas por condición para tener en cuenta la variación natural entre repeticiones.</li>
	<li>Rehidratar las muestras suavemente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido aumentando gradualmente la proporción de solución salina con tampón fosfato con 0.1% de tensioactivo no iónico (PTw; Tabla 1) de etanol en los lavados. Nota: Completar los lavados en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave a menos que se indique lo contrario. Alícuotas de 500-600 μl de soluciones de lavado en cada pozo del titular tal que las tripas en cada cesta estén completamente sumergidas. Preparar todas las soluciones con agua tratada con DEPC para evitar la degradación del RNA.<ol>
<li>Lavar las muestras durante 5 minutos en 500 μl 100% de etanol.</li>
		<li>Preparar por lo menos 500 μl por canasta de muestra de 75%, 50% y 25% de etanol en PTw. Rehidratar las muestras de lavado durante 5 minutos en cada solución de etanol, pasando de la concentración de etanol más alto al más bajo.</li>
		<li>Lavar las muestras 4 veces de 5 min en PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilizar las muestras con proteinasa K (10 μg/mL) en PTw durante 5 minutos.</li>
	<li>Preparar el tejido para hibridación con las sondas de RNA.<ol>
<li>Lavar las muestras dos veces como se describe en 6.2 en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave durante 5 minutos en 500 μl de tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) (tabla 1) para mantener las muestras en un ambiente libre de Amina.</li>
		<li>Tratar las muestras dos veces con anhídrido acético de 500 μl 0.25% en tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) durante 5 min, luego lavar las muestras dos veces en PTw por 5 min. Nota: El anhídrido acético acetylates aminas libres para neutralizar la carga positiva, que es fundamental para prevenir interacciones electrostáticas no específicas y garantizar la unión específica de la sonda al mRNA.</li>
		<li>Fijar las agallas por 20 min con paraformaldehido de 4% de 500 μl de PTw, luego lavar 5 veces en PTw durante 5 minutos.</li>
		<li>Prehybridize por incubación de las muestras en 500 μl de hibridación buffer /in el soporte de la canasta de 24 pozos en la placa bien 24 (tabla 1) por 1.5-2.5 h a 60 ° C con agitación suave en un baño. Guardar el buffer de hibridación utilizado por el paso prehybridization para reutilizar en el protocolo del día 2 (paso 7.1).</li>
		<li>Preparar soluciones de hibridación probe diluyendo las sondas de RNA en tampón de hibridación a una concentración final de 1 μg/mL.  Incubar las muestras con soluciones de hibridación de sonda en el soporte de la canasta de 24 pocillos a 60 ° C con agitación suave durante la noche en un baño (tabla 2). Cubra la placa con el soporte de la canasta bien con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución de hibridación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. hibridación in Situ : día 2 (tiempo: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Sacar las muestras de las soluciones de hibridación de la sonda y en el tampón de hibridación reservada del día anterior. Incubar a 60 ° C con agitación suave durante 3 minutos. Nota: Soluciones de sonda de hibridación pueden ser almacenadas a-20 ° C para su reutilización hasta 3 veces.</li>
	<li>Preparar diluyendo 20 2 x de buffer de citrato de sodio solución salina (SSC) x SSC en agua tratada con DEPC (tabla 1). Lavar las muestras dos veces por 3 minutos con 2 x SSC, luego 3 veces durante 20 min con 2 x SSC a 60 º C para eliminar los restos de la sonda y tampón de hibridación.</li>
	<li>Tratamiento con Rnasa (20 μg/mL) y Rnasa T1 (10 μg/mL) en 2 x SSC durante 30 min a 37 ° C para eliminar solo trenzado sonda RNA representando gratis no-cruzado por hibridación RNA.</li>
	<li>Lave una vez con 2 x SSC durante 10 min a temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por dilución 2 x SSC en el agua tratada con DEPC, luego lavar dos veces con 0,2 x SSC durante 30 min a 60 ° C para eliminar RNasas exceso.</li>
	<li>Lavar dos veces con 500 μl de tampón de ácido maleico (MAB; Tabla 1) de 10 minutos cada uno.</li>
	<li>Incubar las muestras con solución (reactivo de bloqueo 2% en MAB) 1.5-2 h de bloqueo. Nota: El reactivo de bloqueo puede ser difícil de disolver; calentamiento suave ayuda a la disolución.</li>
	<li>Reemplace la solución de bloqueo con anti-digoxigenina alcalina conjugados con fosfatasa 500 μl del anticuerpo a la dilución de 1:3,000 en solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente por cerca de 4 horas o a 4 ° C durante la noche.</li>
</ol>8. hibridación in Situ : día 3 (tiempo: 6 h hasta toda la noche)
<ol><li>Lavar las muestras por lo menos 5 veces de 30 minutos cada uno con 500 μl de MAB para quitar exceso del anticuerpo. Nota: Estos son flexibles y pueden ampliarse a 1-2 h o 3-4 lavados se pueden sustituir por un lavado durante la noche a 4 ° C con un mínimo efecto sobre la eficacia.</li>
	<li>Lavar dos veces durante 5 minutos con buffer de fosfatasa alcalina, pH 9.5 (tampón de AP; Tabla 1).</li>
	<li>Comenzar la reacción de color mediante la sustitución del último lavado con 500 μl de cromógeno sustrato para fosfatasa alcalina (Tabla de materiales). Cubrir la placa de la muestra con papel de aluminio y dejar que la tinción proceder a temperatura ambiente durante 3 - 5 h o durante la noche a 4 ° C. Monitorear periódicamente la reacción de tinción viendo el tejido bajo un microscopio de disección para evitar overstaining. Nota: Cuando la tinción es completa, un tinte púrpura es detectable por el ojo en las muestras de sondeo antisentido al microscopio, pero el tejido no se debe llegar a ser muy oscuro. La coloración procede muy lentamente a 4 ° C y puede tardar hasta 20-24 h.</li>
	<li>Detenga la reacción de color de lavado durante 5 minutos en 500 μl de MAB y fijar el tejido durante la noche en solución de Bouin. PRECAUCIÓN: Manipule solución de Bouin en una campana de humos; es un carcinógeno corrosivo.</li>
</ol>9. hibridación in Situ : día 4 (tiempo: 3-3,5 h)
<ol><li>Preparar por lo menos 7 mL por canasta de muestra de 1 x SSC por dilución 20 x SSC en el agua tratada con DEPC. Retirar la solución de Bouin lavando las muestras de 4 a 6 veces con etanol al 70% en 1 x SSC hasta que el tejido ya no es de color amarillo.</li>
	<li>Preparar 500 μl por canasta de muestra de soluciones de etanol 75%, 50% y 25% en 1 x SSC. Lavar las muestras durante 5 minutos en cada solución, pasando de más alta concentración de etanol a menor a rehidratar el tejido. Lavar dos veces durante 5 min cada 1 en x SSC.</li>
	<li>Incubar las muestras en la solución de lejía (tabla 1) durante 90 minutos en un lightbox en una campana de humos. Nota: Este paso permite cualquier pigmentación en las muestras o coloración de Bouins solución para quitarse y mejora la señal de la sonda para una visualización clara.</li>
	<li>Lavar las muestras dos veces con 500 μl de 1 x SSC durante 5 minutos.</li>
	<li>Reubicar las tripas con un daño mínimo por inversión de la cesta de la muestra en un pocillo de una placa de 24 pocillos nueva y lave con etanol al 70% a través del fondo de la malla con una pipeta de transferencia. Almacenar a-20 ° C si es necesario.</li>
	<li>Para obtener una visión general de los patrones de tinción de muestras múltiples como se muestra en la figura 3, mantener las tripas en etanol al 70% en la placa de la pozo 24 y la vista con cualquier microscopio de campo brillante. Examinar vísceras individuales bajo un microscopio de campo brillante como se muestra en la figura 4, figura 5, y la figura 6, Monte las tripas en glicerol al 100% bajo el cubreobjetos. Utilice una espátula de plástico para manipular suavemente los tejidos con daño mínimo. Nota: La alta viscosidad de la glicerina ayuda a proteger el tejido del daño por compresión y permite la colocación cuidadosa de divertículos que el tejido puede verse óptimamente con aumentos más altos.</li>
	<li>Captura de imágenes en el microscopio utilizando el software de captura de imagen específica de microscopio (Tabla de materiales) y exportar como una imagen genérica de software de edición de imágenes Tiff. Para cuantificar las diferencias de coloración relativas entre tratamientos experimentales, descargar un software de análisis de imagen genérico (Tabla de materiales). Abre la imagen dentro del software de análisis y siga las instrucciones dentro del software para medir intensidad de píxeles de la tinción y cálculo parcelas histograma de la tinción.</li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Este es el primer uso de una técnica de hibridación (WMISH) conjunto de montaje en situ para el estudio de la microbiota de un artrópodo vector de agentes patógenos. Nuestro protocolo fue adaptado de uno usado para el estudio de desarrollo en Drosophila y en embriones de rana25,26. Conjunto de montaje RNA en situ el hibridación se ha utilizado rutinariamente para localizar espacialmente las transcripciones del gene y temporal<sup c...

Patógenos humanos y animales transmitidas por artrópodos vectores se encuentran en todo el mundo y representan aproximadamente el 20% de las enfermedades infecciosas a nivel mundial1, pero efectivo y seguras vacunas contra la mayoría de estos patógenos no están disponibles. Está expandiendo nuestra comprensión de la importancia de los microorganismos comensales, simbióticas y patógenas, colectivamente conocidos como el microbioma2, en la modulación y la configuración de la salud de casi todos los metazoos3 . Ahora es evidente que artrópodos vectores de patógenos también albergan la microbiota intestinal y estos microbiota asociado vector han demostrado influir en diversos agentes patógenos transmitidos por el vector4,5. El microbioma artrópodo se compone de eubacteria, archaea, virus y microbios eucariotas como protozoos, nematodos y hongos6. Sin embargo, el enfoque predominante ha sido en eubacterias debido, en parte, la disponibilidad de genes marcadores y bases de datos de referencia para identificar a miembros bacterianos específicos.
Con un enfoque de scapularis de Ixodes, el vector de señal de múltiples patógenos humanos incluyendo Borrelia burgdorferi7, el agente causal de la enfermedad de Lyme, la optimización de una técnica de visualización microbiano apuntaba a mejorar nuestra comprensión de la señal intestinal microbiota en el contexto de las interacciones patógeno vector. Varias preguntas quedan para ser contestadas en el campo de microbioma de la garrapata. El intestino es el sitio del primer encuentro extendido entre la garrapata y el patógeno entrante en el contexto de patógenos transferidos horizontalmente; por lo tanto, entender el papel de la microbiota intestinal de vector en la modulación de las interacciones patógeno vector revelará información significativa. Las garrapatas tienen un modo único de la digestión de la comida de sangre, donde procesamiento de harina de sangre componentes ocurre intracelularmente lugar8. El lumen de intestino aparentemente sirve como recipiente para contener la harina de sangre como los feeds de la garrapata, y asimilación y digestión de nutrientes sobrevienen a lo largo de los días de la alimentación y continúan después de la repleción. Los patógenos adquiridos por la garrapata durante la alimentación entre el lumen intestinal junto con la harina de sangre y así la luz se convierte en un sitio primario de las interacciones entre la microbiota residente, garrapata y patógeno. Medida que avanza la digestión a través de la repleción y garrapatas Ixodid muda, el intestino sufre cambios estructurales y funcionales9. La composición y la organización espacial de las bacterias del intestino también es probable que varíe en concierto con el cambiante entorno de tripa. Por lo tanto, es importante entender la arquitectura de las bacterias residentes en el intestino de la garrapata para comprender la interacción de garrapatas y patógenos microbiota intestinal.
Técnicas moleculares para describir la microbiota asociada a host rutinariamente utilizan estrategias de secuenciación paralela de alto rendimiento10 para amplificar y secuenciar ADN ribosomal bacteriano 16S (ADNr). Estas estrategias de secuenciación eluden la necesidad de obtener cultivos axénicos de bacterias específicas y proporcionar una descripción más detallada de todos los miembros de bacterias en la muestra. Sin embargo, tales estrategias se confunden por la incapacidad de distinguir la contaminación ambiental de los residentes bona fide . Además, al evaluar muestras, tales como las garrapatas, que son pequeñas en tamaño y por lo tanto, contienen ADN de microbiota específica bajo rendimientos, la probabilidad de amplificación de los contaminantes ambientales es mayor11 y en la interpretación ambigua de los resultados composición del microbioma. Caracterización funcional junto con la visualización de bacterias viables concretas, por lo tanto, será fundamental para definir y discernir el microbioma de la señal temporal y espacial. Hacia esta meta, lo aprovechó el conjunto Monte RNA en situ el hibridación. Esta técnica se usa rutinariamente para evaluar patrones de expresión génica en órganos y embriones12,13,14 y permite el análisis semicuantitativo de la expresión sobre toda la muestra de interés. Esto difiere de la tradicional en situ hibridación técnicas que utilizan secciones de tejidos y a menudo requieren un análisis extenso del material seccionado con un ensamblaje computacional para predecir la expresión en todo los órganos15. Mientras que Monte todo generalmente se refiere a todo los organismos12, aquí todo Monte se refiere a todo vísceras u órganos. Las ventajas de utilizar el conjunto de montaje RNA en situ hibridación enfoque para evaluar la arquitectura de la microbiota intestinal de garrapatas son múltiples. El intestino de la garrapata se compone de 7 pares de divertículos, cada par de variables en tamaño16. Las diferencias funcionales, si alguno, entre estos divertículos, no se entienden en el contexto de la biología de la garrapata, garrapata interacciones microbiota o tick-patógeno. Manipulaciones de la tripa que rompen los divertículos de intestino desplazaría la microbiota presente en el lumen del intestino o los asociados libremente con la tripa y resultar en una mala interpretación de la localización espacial de la microbiota. Marcados con fluorescencia RNA en situ el hibridación se ha utilizado anteriormente para examinar marca gut transcripciones17 mediante la fijación y apertura divertículos intestinales individuales para hibridación de la sonda y localizar del burgdorferi del B. transcripciones de secciones parafina-encajadas de garrapatas todo18. Ambos estos métodos requieren manipulaciones de los tejidos de garrapatas antes de hibridación que pueden afectar a la arquitectura de microbiota intestinal.
En este informe, describimos en detalle el protocolo para examinar garrapata viable intestinal microbiota con conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH). El uso del montaje en conjunto RNA en situ hibridación permite una comprensión global de la presencia y abundancia de las bacterias del intestino específicos en las diferentes regiones del intestino y puede estimular nuevos conocimientos sobre biología de tripa de garrapatas en el contexto de la colonización de patógenos y la transmisión. Además, el uso de sondas de RNA dirigida contra ARN bacteriano específico permite la detección de bacterias viables en el intestino de la garrapata.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Enfermedades infecciosas transmitidas por vectores artrópodos siguen planteando una amenaza significativa para la salud humana en todo el mundo. Los patógenos que causan estas enfermedades, no existen en aislamiento cuando coloniza el vector; por el contrario, probablemente participan en interacciones con microorganismos residentes en el lumen intestinal. La microbiota del vector se ha demostrado que juegan un papel importante en la transmisión de patógenos de varias enfermedades transmitidas por vectores. No se determina si las bacterias residentes en el intestino de la garrapata de scapularis de Ixodes , el vector de varios patógenos humanos, incluyendo el burgdorferi de Borrelia, influyen en la transmisión de la señal de patógenos. Requieren métodos para caracterizar la composición de las bacterias asociadas con el intestino de la garrapata para facilitar una mejor comprensión de las interacciones entre las especies potenciales en el intestino de la garrapata. Con conjunto de montaje en situ hibridación visualizar transcritos de RNA asociadas a especie bacteriana en particular permite la recolección de datos cualitativos con respecto a la abundancia y distribución de la microbiota en el tejido intacto. Esta técnica puede utilizarse para examinar los cambios en el entorno de microbiota intestinal a lo largo de la señal de alimentación y también puede ser aplicada para analizar la expresión de los genes de la garrapata. La coloración de la garrapata entera guts rendimiento información sobre la distribución espacial bruta de destino RNA en el tejido sin necesidad de reconstrucción tridimensional y es menos afectada por contaminación del medio ambiente, que a menudo confunde basada en la secuenciación métodos utilizados con frecuencia para el estudio de comunidades microbianas complejas. En general, esta técnica es una herramienta valiosa que puede utilizarse para mejor entender las interacciones patógeno-vector-microbiota y su papel en la transmisión de la enfermedad.

La medición y valoración de la calidad de las sondas de RNA son esenciales antes de comenzar con la tinción. Eficiencia de transcripción in vitro depende altamente de la cantidad y calidad de la plantilla de la DNA. Habitualmente visualizamos las sondas de RNA en un gel de formaldehído para verificar la pureza y la cantidad de sonda generada por las reacciones de transcripción. Las sondas deben aparecer como bandas luminosas, discretos (figura 2</strong...

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K vistas.  Yale University School of Medicine. Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Investigación

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Inmunología e Infección

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Seguimiento de patógenos de todo el órgano mediante cuantificación de reporteros fluorescentes

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor destacado: Desentrañando las respuestas bacterianas a los antibióticos y el sistema inmunitario en los tejidos

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

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