אנו מודים ד ר מוסטפא Khokha, אוניברסיטת ייל, למתן את השימוש במשאבים המעבדה שלו. אנו מודים על מר מינג-ג'יאה-וו לסיוע טכני מעולה. EF הוא חוקר HHMI. עבודה זו נתמכה על ידי מתנה ג'ון Monsky ואת קרן המחקרים של מחלת ליים Monsky של ג'ניפר וייס.

<ol>
	<li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission:+Translational+Aspects.">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).</li><li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut.">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li><li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worlds+within+worlds:+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota.">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li><li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+microbiome:+the+force+within.">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li><li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence.">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li><li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+microbiome+of+arthropods.">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks.">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li><li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphofunctional+changes+in+the+midgut+of+Ixodid+ticks+during+the+life+cycle.">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li><li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+a+microbiome+study.">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87 (2014).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li><li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae.">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections.">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (1991).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete.">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li><li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies.">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li><li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

זהו השימוש הראשון טכניקה הכלאה (WMISH) כולה-הר בחיי עיר ללמוד את microbiota של וקטור arthropod של פתוגנים. פרוטוקול שלנו הותאם מאחד המשמשות ללימוד פיתוח בדרוזופילה וב -צפרדע עוברי25,26. RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר נעשה שימוש באופן שגרתי כדי להתאים לשפה ג'ין תעת?...

האדם ובעלי פתוגנים ששודרו על-ידי וקטורים arthropod מצויים ברחבי העולם בחשבון כ- 20% של מחלות זיהומיות ברחבי העולם1, אך יעיל ואני בטוח חיסונים נגד רוב פתוגנים אלה אינן זמינות. הבנתנו תפקידה החשוב של מיקרואורגניזמים commensal, סימביוזה, פתוגניים, המכונה באופן קולקטיבי microbiome2, להתכוונן בעיצוב הבריאות של metazoans כמעט כל3 מתרחבת. עכשיו זה ברור arthropod וקטורים של פתוגנים הנמל גם בטן microbiota microbiota הקשורות וקטור אלה הוכחו השפעה מגוונים פתוגנים בעקיצות וקטור4,5. Microbiome arthropod מורכב eubacteria, ארכאונים, וירוסים, חיידקים האיקריוטים כגון חד-תאיים, נמטודות פטריות6. עם זאת, מוקד מחקר השולט כבר ב eubacteria נובע, בין השאר, את הזמינות של סמן גנים ובסיסי התייחסות לזהות חברי חיידקי ספציפי.
עם דגש על Ixodes scapularis, וקטור שנתות של פתוגנים האנושי מרובים כולל Borrelia burgdorferi7, סוכן סיבתי של מחלת ליים, אופטימיזציה של טכניקה ויזואליזציה מיקרוביאלי היה מכוון שיפור ההבנה שלנו של microbiota בטן שנתות בהקשר של אינטראקציות פתוגן-וקטור. מספר שאלות נותרו להיענות בשדה microbiome שנתות. הוא האתר של המורחבת המפגש הראשון בין השניה את הפתוגן נכנסות בהקשר של פתוגנים המועברים אופקית; לכן, להבין את התפקיד של וקטור microbiota בטן ב להתכוונן פתוגן-וקטור אינטראקציות תחשוף תובנות משמעותיות. קרציות יש מצב ייחודי של עיכול ארוחת דם, עיבוד של ארוחת דם רכיבים לוקח המקום intracellularly8. לומן מעיים לכאורה משמש קיבול להכיל את ארוחת דם כמו ההזנות שנתות, והוא מזין עיכול והטמעה ensue לאורך מספר ימים של האכלה ולהמשיך כסיגנל שלאחר. פתוגנים שרכשה את תקתוק שהאכילה הזן לומן הבטן יחד עם bloodmeal והופך ובכך לומן אתר ראשי של אינטראקציות בין שנתות, הפתוגן, תושב microbiota. כמו עיכול ממשיך דרך כסיגנל שנתות Ixodid משיר, הבטן עובר שינויים מבניים ופונקציונליים9. את ההרכב ואת הארגון המרחבי של חיידקים במעיים סביר גם משתנים בתיאום עם הבטן משתנה הסביבה שבה התרחשה. חשוב, לכן להבין את הארכיטקטורה של תושב חיידקים בבטן שנתות כדי להבין באופן מלא את הגומלין של שנתות הפתוגן, הבטן microbiota.
טכניקות מולקולריות כדי לתאר microbiota מארח-הקשורים באופן שגרתי לנצל אסטרטגיות רצפי מקביל בתפוקה גבוהה10 כדי להגביר את רצף ה-DNA חיידקי מטוסי אף-16 30s ריבוזומלי (rDNA). אלה אסטרטגיות רצפי לעקוף את הצורך להשיג axenic תרביות של חיידקים מסוימים מספקים תיאור מעמיק של כל חברי חיידקי ייצג במדגם. למרות זאת, אסטרטגיות מעין אלו הם מבולבל על ידי חוסר היכולת להבחין בין הסביבה מציג מתושבים bona פיד ה . עוד יותר, כאשר הערכת במדגמים, כגון קרציות, הינם קטני מידות ומכילות ומכאן DNA ספציפיים microbiota נמוך התשואות, הסבירות של הגברה של מזהמים סביבתיים מוגברת11 ותוצאות של פרשנות חד משמעיים של ההרכב microbiome. אפיון פונקציונלי בשיתוף עם הפריט החזותי של חיידקים קיימא ספציפי, לכן, תהיה קריטית כדי להגדיר ולהבחין את microbiome של שנתות חנותם והמרגשים. לעבר המטרה הזו, אנחנו ניצלו את העובדה RNA כולה-הר בחיי עיר הכלאה. טכניקה זו משמשת באופן שגרתי כדי להעריך את ג'ין תבניות ביטוי איברים, העוברים12,13,14 ומאפשר ניתוח semiquantitative של הביטוי על המדגם בכל עניין. זה שונה מסורתי בחיי עיר טכניקות הכלאה אשר לנצל את מקטעי רקמת ולעיתים קרובות דורשים ניתוח מקיף של חומר משרטוטי עם אסיפה חישובית לחזות ביטוי איברים כל15. בעוד כולה-הר מתייחס בדרך כלל אורגניזמים כל12, כאן כולה-הר מתייחס כל אומץ או איברים. יתרונות השימוש כולה-הר RNA בחיי עיר הכלאה הגישה כדי להעריך את הארכיטקטורה של שנתות בטן microbiota הם multifold. הבטן שנתות מורכב 7 זוגות diverticula, כל זוג משתנה גודל16. ההבדלים פונקציונלי, אם בכלל, בין אלה diverticula, אינם מובנים בהקשר של שנתות ביולוגיה, לתקתק אינטראקציות microbiota או פתוגן-שנתות. המניפולציות של המעיים, זה קרע את diverticula בטן תחסיר microbiota נוכח לומן מעיים או אלה הקשורים באופן רופף הבטן ואת התוצאה פירוש מוטעה של לוקליזציה המרחבי של microbiota. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה יש כבר מנוצל קודם לבחון שנתות בטן תעתיקים17 על-ידי תיקון ופתיחה diverticula בטן בודדים כדי להבטיח בדיקה הכלאה וכדי להתאים לשפה burgdorferi דרב תעתיקים באמצעות חלוקתה פרפין-מוטבע כל קרציות18. שתי גישות אלה דורשים מניפולציות של הרקמות שנתות לפני הכלאה שישפיעו על הארכיטקטורה microbiota בטן.
בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול לבחון microbiota בטן שנתות קיימא באמצעות כולה-הר בחיי עיר הכלאה (WMISH). השימוש של ה-RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר מאפשר הבנה גלובלית של נוכחות ושפע של הבטן ספציפי חיידקים באזורים שונים של המעיים, עשויה לדרבן תובנות חדשות שנתות ביולוגיה בטן בהקשר של פתוגן קולוניזציה ושידור. עוד יותר, השימוש של הגששים RNA נגד RNA חיידקי ספציפי מאפשר זיהוי של קיימא חיידקים בבטן שנתות.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

מחלות זיהומיות המועברת על ידי וקטורים arthropod ימשיכו להוות איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. פתוגנים גרימת מחלות אלו, אינם קיימים בבידוד כאשר הם ליישב את הווקטור; במקום זאת, הם כנראה לעסוק אינטראקציות עם מיקרואורגניזמים תושב ב לומן מעיים. Microbiota וקטור הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב בפתוגן שידור עבור מספר מחלות נישאות וקטור. בין אם תושב חיידקים בבטן של השניה Ixodes scapularis , הוקטור של מספר פתוגנים האנושי כולל Borrelia burgdorferi, להשפיע על השידור שנתות של פתוגנים לא נקבע. אנחנו דורשים שיטות עבור אפיון ההרכב של חיידקים הקשורים עם הבטן שנתות כדי להקל על הבנה טובה יותר של פוטנציאל אינטראקציות בין זנים בבטן שנתות. שימוש כולה-הר בחיי עיר הכלאה להמחיש תעתיקים RNA הקשורים למין מסוים חיידקי מאפשר האוסף של נתונים איכותיים לגבי שפע והפצה של microbiota בתוך הרקמה ללא פגע. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים וחשש microbiota הבטן במהלך שנתות האכלה, ניתן להחיל גם לנתח את הביטוי של גנים שנתות. צביעה של כל שנתות אומץ התשואה מידע אודות התפלגות מרחבית ברוטו היעד RNA ברקמה ללא צורך שחזור תלת מימדי, מושפע פחות זיהום סביבתי, אשר לעיתים קרובות מבלבל את מבוסס על רצף שיטות שימוש תכוף ללמוד קהילות מיקרוביאלי מורכבים. בסך הכל, טכניקה זו היא כלי רב ערך שיכול לשמש טוב יותר להבין וקטור-פתוגן-microbiota אינטראקציות ותפקידם העברת מחלות.

מדידה, הערכה של איכות הגששים RNA הם קריטיים לפני תחילת ההכתמה. במבחנה שעתוק יעילות מאוד תלוי כמות ואיכות תבנית ה-DNA. אנחנו באופן שגרתי דמיינו את הגששים RNA על ג'ל פורמלדהיד כדי לאמת את הטוהר ואת כמות בדיקה שנוצר על ידי התגובות שעתוק. הגששים אמור להופיע כרצועות בהיר, דיסקר?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K Views.  Yale University School of Medicine. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

Video: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Immunology and Infection

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

מעקב אחר פתוגן של איברים שלמים באמצעות כימות כתב פלואורסצנטי

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

מחבר זרקור: חשיפת תגובות חיידקים לאנטיביוטיקה ולמערכת החיסון ברקמות

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST