Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones huésped-patógeno, como cuáles son las características únicas de las células infectadas productivamente, qué cofactores del huésped permiten a los virus establecer la infección productiva y cómo atacar estas células en intervenciones terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona medidas cuantitativas para proteínas y ARNM dentro de células individuales, y la mayoría de los reactivos están disponibles comercialmente. Demostrando el procedimiento de clasificación celular estará Matthew Creegan, un técnico superior del núcleo de citometría de flujo en el laboratorio del Doctor Michael Eller.
Para comenzar, en una estación de trabajo de biología molecular pre-PCR designada, prepare la mezcla de ensayos combinando 96 ensayos de expresión génica en un tubo libre de RNase, DNase asegurándose de agregar cada ensayo a una concentración final de 180 nanomolares de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás. Añadir tampón de suspensión de ADN para lograr la dilución adecuada de la mezcla de ensayo. Para cada matriz de chips prevista de 96 por 96, pipetee seis microlitros de cada ensayo en un pozo designado de una placa PCR de 96 pozos, luego selle la placa con un adhesivo.
Para comenzar la tinción superficial de células viables, en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejido, primero prepare las muestras de compensación y una mezcla maestra de cóctel de anticuerpos fluorescentes como se describe en el protocolo de texto. Descongelar las celdas crioconservadas en un baño de agua celsius de 37 grados durante dos minutos. Después de esto, añadir entre 5 y dos mililitros de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga 12 mililitros de PBS.
Centrifugar a 500 G durante tres minutos a 25 grados Celsius, luego aspirar el PBS y resuspender el pellet en tres mililitros de PBS fresco. Transfiera esta mezcla a un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Centrifugar una vez más a 500 G durante tres minutos a 25 grados centígrados.
Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 10 microlitros residuales PBS. A continuación, resuspender hasta 20 millones de células lavadas en 80 microlitros de cóctel de anticuerpos. Incubar durante 20 minutos a 25 grados centígrados mientras esté protegido de la luz.
Después de esto, agregue tres mililitros de PBS. Centrifugar a 500 G durante tres minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspender a fondo las células en 300 a 500 microlitros de PBS.
Filtrar esta solución pipeteándola a través de una tapa de 35 micrómetros de nylon cell-strainer. luego mantener las células sobre hielo y protegidas de la luz hasta el tipo. De vuelta en la estación de trabajo pre-PCR, primero prepare la mezcla de reacción preAMP RT en un solo tubo estéril libre de RNase, DNase como se describe en el protocolo de texto.
Usando una pipeta multicanal, dispensar 10 microlitros de esta mezcla de reacción en el número deseado de placas de recogida de clasificación PCR de 96 pozos. Selle la placa con película adhesiva y luego coloque la placa en un bloque de aluminio pre-refrigerado de 96 pozos. Después de esto, establezca el esquema de medición de celdas y prepare el clasificador de celdas citométricas de flujo como se describe en el protocolo de texto.
Introduzca la configuración de instrumento adecuada para especificar el número y subconjunto de celdas que se ordenarán en cada pozo. Retire el sello adhesivo, luego FACS clasifre las células en las placas de recolección de PCR preparadas de 96 pozos. Vuelva a sellar la placa con película adhesiva fresca.
Inmediatamente vórtice la placa resedada y luego centrifugar a 2000 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Termocicla la placa en una máquina PCR con una tapa precalentada a 50 grados Celsius durante 15 minutos seguido de 95 grados Celsius durante dos minutos. Finalmente, termociclo para 18 ciclos de 95 grados Celsius durante 15 segundos y 60 grados Celsius durante cuatro minutos, luego en una estación de trabajo post-PCR, transferir cinco microlitros de cDNA en 20 microlitros de tampón de suspensión de ADN en una nueva placa PCR de 96 pozos.
Para empezar, prepare la placa de ensayo qPCR pipeteando cuatro microlitros de reactivo de carga de ensayo en cada pozo. A continuación, transfiera cuatro microlitros de cada ensayo desde la placa de ensayo 2X a la placa qPCR. Mantenga la placa de ensayo qPCR a cuatro grados centígrados.
Dispensar los fluidos de la línea de control de las jeringas de cebado en las dos válvulas de admisión del chip. Retire el plástico protector de debajo de la placa. Coloque el chip en un controlador IFC con el lado con muesca en la posición A1, luego seleccione y ejecute el script principal.
Para cada chip microfluídico, mezcle 50 microlitros del reactivo de carga de muestra con 500 microlitros de mezcla maestra de PCR para preparar la mezcla de reacción en tiempo real. Pipette 4.4 microlitros de esta mezcla de reacción en cada pozo de una nueva placa PCR de 96 pozos ahora designada como la placa de muestra. A continuación, pipeteadores 3,6 microlitros del ADNc previamente diluido en cada pozo de la placa de muestra.
Después de esto, transfiera cinco microlitros de la placa de ensayo al pozo correspondiente en el lado con muesca del chip. Transfiera cinco microlitros de la placa de muestra al pozo correspondiente del otro lado del chip. Inserte el chip cargado en el controlador IFC y ejecute el script de mezcla de carga.
A continuación, transfiera el chip a la plataforma BioMark y configure el instrumento como se describe en el protocolo de texto y, a continuación, guarde el archivo de ejecución de chip en una carpeta designada. Una vez completada la ejecución del chip, abra el software de análisis de PCR en tiempo real y, a continuación, seleccione el archivo, abra, para abrir el chiprun. bml archivo.
En la esquina superior izquierda de la ventana del software, localice el explorador de chips y el resumen de ejecución de chip. En Resumen de ejecución de chip, haga clic en configuración del detector. En tarea, haga clic en nuevo y seleccione el tipo de contenedor SBS plate and container format SBS 96.
Haga clic en el botón con los puntos suspensivos junto a la asignación y, a continuación, seleccione M96-Assay-SBS96.dsp. Haga clic en las vistas de análisis. En la pestaña qPCR en la tarea, seleccione la corrección de línea base para la derivada lineal y el método de umbral de TC para los detectores de usuario.
En la pestaña Umbrales de TC, marque la casilla inicializar con automático y, a continuación, haga clic en el botón Analizar. En el cuadrante superior derecho de las vistas de análisis, haga clic en la segunda pestaña, tabla de resultados. En el menú desplegable, seleccione la vista de mapa de calor y aparecerá el mapa de calor con los datos.
En el mapa de calor, haga clic en umbral y gráfico de registro. Ajuste los umbrales de TC manualmente para cada detector haciendo clic en los ensayos, representados por columnas en el mapa de calor, y arrastrando el umbral según sea necesario para intersectar las curvas de amplificación en la fase exponencial. Cuando haya terminado, haga clic en analizar.
A continuación, exporte los datos qPCR como un archivo csv. Transfiera datos qPCR desde el ordenador BioMark a su escritorio. Importe los datos a una hoja de cálculo o software de análisis estadístico y asigne los resultados por las posiciones de muestra y ensayo en el chip.
Crea una nueva columna y usa una fórmula condicional para organizar las células en grupos basados en la expresión de genes virales. En Analizar, seleccione ajustar Y por X y trazar expresión génica frente a grupo. Después de esto, utilice FlowJo versión nueve para abrir archivos FCS de FACS que correspondan a una placa de 96 pozos.
Con el nombre de archivo resaltado, seleccione plataforma, puerta de número de evento y cree puertas de ordenación indexadas. Las celdas individuales aparecerán por fila. Resalte las 96 celdas y, a continuación, seleccione el espacio de trabajo, exporte, seleccione todos los pisos compensados.
En Datos, seleccione Archivo FCS, haga clic en Exportar y seleccione una carpeta designada. Arrastre los nuevos archivos FCS para celdas individuales a un nuevo espacio de trabajo FlowJo. Resalte todas las celdas y haga clic en Agregar estadísticas, representadas por el botón sigma, la media y todos los parámetros de fluorescencia.
Abra el editor de tablas, resalte todos los pisos de la primera celda y arrástrelos a la ventana del editor de tablas. En esta ventana, haga clic en crear y ver la tabla. Después de esto, copie y genere en un software estadístico, ya sea copiando o haciendo clic en el botón Guardar e iniciar la aplicación.
Combine los datos FACS de celda única con los datos qPCR en JMP por el número de placa y la posición del pozo. Por último, realice análisis gráficos y estadísticos de los datos combinados. En este estudio, la cuantificación de proteínas de superficie de una sola célula por citometría de flujo multiparámesis se integra con la expresión cuantitativa de ARNm de una sola célula mediante RTqPCR altamente multiplexado.
Aquí se muestra la expresión génica viral cuantitativa de una sola célula de células T positivas Rhesus ordenadas Rhesus. Tat/rev positivo N de células negativas expresan menos copias de arn de tat/rev que la N de células positivas en verde oscuro que es consistente con una etapa temprana de infección antes de la estabilización y una exportación nuclear de ARN viral parcialmente empalmado. Una alta abundancia de ARN-GAG sin empalme en el N positivo de tat/rev de las células positivas es consistente con la infección productiva tardía durante la cual se expresa abundante ARN genómico y se empaqueta en viriones en ciernes.
Esta gráfica trivariada que muestra el gen viral de una sola célula, el gen huésped y la expresión de proteína de superficie huésped muestra que la expresión de proteína CD4 y CD3 de superficie disminuye en las células positivas de tat/rev que se muestran en verde, aunque se mantengan las transcripciones CD4 y CD3. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos o tres días. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar una evaluación protorscriptual de una sola célula dirigida para abordar preguntas relacionadas con genes y proteínas expresados diferencialmente en células infectadas viralmente.
