El objetivo general de este procedimiento es generar una desmielinización generalizada de la corteza de ambos hemisferios cerebrales en un modelo de rata utilizando inmunización subclínica contra la glicoproteína oligodendrocitos de mielina, seguida de una inyección cerebral de citoquinas a través de un catéter implantado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en enfermedades inflamatorias desmielinizantes del cerebro, como la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que puede generar inflamación inducida por la desmielinización de la materia gris en la corteza de ambos hemisferios cerebrales sin dar lugar a tapones de materia blanca.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor comprensión de los mecanismos de desmielinización cortical que se observa principalmente en los tipos progresivos de esclerosis múltiple. Para comenzar este procedimiento, ensamble el catéter y la tapa del catéter con la entrada. A continuación, corte el catéter a una longitud de dos milímetros con un bisturí.
Luego afeite la cabeza de una rata anestesiada entre las orejas usando la afeitadora eléctrica. Coloque la rata en el marco estereotáctico y asegure su cabeza con las barras para los oídos y la placa de mordida. Asegúrese de que la cabeza esté horizontal y compruebe su estabilidad aplicando presión sobre ella con el dedo o las pórceps.
Después, aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía, cubra los ojos con un material opaco para evitar cualquier exposición a la luz quirúrgica. A continuación, limpie el área afeitada alternando la aplicación de 70% de etanol y 10% de complejo de yodo povidona. Para implantar el catéter, haga una incisión longitudinal de aproximadamente dos centímetros de longitud a lo largo de la línea media.
Luego use abrazaderas de bulldog para sostener la piel a los lados. Retire la sangre con un aplicador de punta de algodón. Después, retire el periostio, limpie el tejido con el aplicador de punta de algodón, exponga el cráneo y deje que se seque durante aproximadamente un minuto.
A continuación, identifique los puntos de referencia anatómicos, lambda, bregma y sutura medial. Con el taladro instalado en el marco estereotáctico, coloque la punta de la broca en el bregma como punto de partida. Muévase dos milímetros más atrás desde el bregma, y 2,4 milímetros lateralmente hasta la sutura medial.
Luego, perfore un orificio de 0,5 milímetros de diámetro para el catéter en esta posición. Perfore tres orificios más de 1,3 milímetros de diámetro para los tornillos de anclaje a unos milímetros del primer orificio. Retire el polvo óseo mediante irrigación con alrededor de uno o dos mililitros de PBS estéril y limpie el cráneo.
Posteriormente, apriete los tornillos de anclaje de dos a tres vueltas completas. Inserte un catéter de dos milímetros de longitud a través del primer orificio perpendicular a la superficie del cráneo. Mientras aún sostiene el catéter, aplique un poco de cemento dental y deje que polimerice con una breve exposición a la luz de curado dental para estabilizar el catéter.
Luego aplique más cemento dental alrededor del catéter, ancle los tornillos y solidifique el cemento dental con la luz de curado dental durante aproximadamente 15 a 30 segundos, confirme que el cemento esté endurecido. Después de la implantación, cierre la piel con suturas reabsorbibles anteriores y posteriores al catéter. Luego inyecte la mezcla de antídoto por vía subcutánea.
A continuación, administrar 2,5% de enrofloxacina mediante inyección subcutánea para el tratamiento antibiótico profiláctico. Devuelva al animal a la jaula modificada y manténgalo bajo observación durante una a tres horas con una aplicación de luz infrarroja para evitar la hipotermia. Repita el tratamiento con enrofloxacina y administre carprofeno a un miligramo por mililitro por vía subcutánea para aliviar el dolor mediante inyección el día después de la cirugía.
Para preparar la mezcla de inmunización, conecte dos jeringas de vidrio de punta de bloqueo inferior de 10 mililitros a los brazos cortos de una llave de paso de tres vías y cierre la tercera salida con el brazo largo. A continuación, pipetee un mililitro de IFA y 50 microgramos de rMOG juntos. Y ajustar la mezcla a un volumen final de dos mililitros con PBS estéril.
Coloque la mezcla diluida de IFA y rMOG en la jeringa abierta, luego inserte el pistón suavemente mientras mantiene una presión suelta en el pistón opuesto. Emulsiona el inóculo conduciendo de una jeringa a la otra empujando los pistones hacia adelante y hacia atrás hasta que esté blanco y viscoso. A continuación, fije una jeringa de bloqueo inferior de un mililitro al brazo corto abierto de la llave de paso de tres vías y llénelo con inóculo.
Distribuya todo el inóculo en jeringas de un mililitro y manténgalas en hielo hasta la inyección. Posteriormente, inyecte 200 microlitros de la mezcla IFA y rMOG por vía subcutánea en la base de la cola bajo anestesia temporal de isoflurano utilizando una aguja de calibre 21. Para la inyección de citoquinas intracerebrales, ajuste la longitud de la cánula del conector a dos milímetros.
Llene una jeringa de un mililitro con la mezcla de citoquinas. A continuación, conecte la jeringa a la cánula del conector. A continuación, llene la cánula con la mezcla de citoquinas, evite crear burbujas.
Luego, monte la jeringa en la bomba de jeringa programable y programe para inyectarla a una velocidad de 0.2 microlitros por minuto. Encienda la bomba y manténgala funcionando para evitar la formación de burbujas de aire en la punta de la cánula. Después, retire la tapa del catéter con la entrada.
Inserte la cánula del conector en el catéter, atornille y apriete. A continuación, permita que la inyección continúe durante 10 minutos antes de detener la bomba. Deje la cánula dentro del catéter durante 20 minutos para permitir que el volumen inyectado se difunda por completo.
Posteriormente, desenrosque la cánula del conector y retírela lentamente para evitar un efecto de vacío. Vuelva a colocar la tapa del catéter con la entrada y atornille. Permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula.
La desmielinización cortical podría evaluarse en diferentes puntos de tiempo después de una inyección de citoquinas por inmuno histoquímica para PLP. La Figura 6A muestra inmunorreactividad PLP intacta en el día 15 en un animal de control inmunizado con moggy que recibió solo PBS estéril a través del catéter implantado. El primer día después de la inyección de citoquinas, la desmielinización ya se pudo detectar en animales principales MOG.
Aunque, solo en las inmediaciones del área cateterizada. La inmunorreactividad de PLP permanece intacta en la corteza contralateral un día después de la inyección de citoquinas. En el tercer día, se pudo observar un aumento gradual en la pérdida de la inmunorreactividad PLP, que se propaga en la corteza ipsilateral.
La desmielinización cortical contralateral también podría detectarse en el tercer día, pero está bastante restringida al área debajo de los tornillos de anclaje. Entre los días nueve y 15, la desmielinización afecta a grandes partes de la corteza de ambos hemisferios. La desmielinización cortical se mantiene hasta 30 días después de la inyección de citoquinas en ambos hemisferios con solo una remielinización parcial.
La Figura 6J muestra una cuantificación de la pérdida de PLP en la materia gris cortical después de la inyección de citoquinas intracerebrales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar la desmielinización de la materia gris utilizando la inmunización subclínica contra las proteínas de mielina, seguida de la inyección intracerebral de citoquinas a través del catéter implantado. Este modelo animal podría ayudar a los investigadores en el estudio de los tipos progresivos de esclerosis múltiple, la desmielinización de la materia gris de capa es toda una marca.
El catéter implantado permite múltiples rondas de desmielinización o administración intercerebral de posibles fármacos terapéuticos sometidos a investigación preclínica sin causar trauma inducido por inyección.
