המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור demyelination נרחב של קליפת המוח של שתי ההמיספרות המוחיות במודל חולדה באמצעות חיסון תת קליני נגד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין, ואחריו הזרקת מוח עניין של ציטוקינים דרך קטטר מושתל. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מרכזיות במחלות demyelinating דלקתיות של המוח, כגון טרשת נפוצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול ליצור demyelination חומר אפור המושרה דלקת בקליפת המוח של שתי ההמיספרות המוחיות מבלי להוביל תקעים חומר לבן.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון הבנה טובה יותר של מנגנונים של demyelination קליפת המוח כי הוא ציין בעיקר סוגים מתקדמים של טרשת נפוצה. כדי להתחיל בהליך זה, להרכיב את הצנתר ואת כובע הקטטר עם כניסת. לאחר מכן, לחתוך את הקטטר לאורך של שני מילימטרים עם אזמל.
ואז לגלח את ראשו של חולדה מרדים בין האוזניים באמצעות מכונת הגילוח החשמלית. מניחים את החולדה במסגרת הסטריאו-טקית ומאבטחים את ראשה באמצעות מוטות האוזניים וצלחת הנשיכה. ודא שהראש אופקי ובדוק את יציבותו על ידי הפעלת לחץ עליו עם אצבע או מלקחיים.
לאחר מכן, יש למרוח טיפות עיניים משמנות למניעת יובש בקרנית במהלך הניתוח, לכסות את העיניים בחומר אטום כדי למנוע חשיפה לאור כירורגי. לאחר מכן, לנקות את האזור המגולח על ידי לסירוגין היישום של 70%אתנול ו 10% קומפלקס יוד povidone. כדי להשתיל את הקטטר, לעשות חותך אורך של כשני ס"מ לאורך קו האמצע.
ואז להשתמש מלחציים בולדוג להחזיק את העור לצדדים. הסר את הדם באמצעות אפליקטור קצה כותנה. לאחר מכן, להסיר את periosteum, לנקות את הרקמה עם אפליקטור קצה כותנה, לחשוף את הגולגולת ולאפשר לו להתייבש במשך כדקה אחת.
לאחר מכן, זהה את ציוני הדרך האנטומיים, למבדה, ברגמה ותפירה מדילית. כאשר המקדחה מותקנת על המסגרת הסטריאו-טסטרואטקטית, מקם את קצה המקדחה בברזמה כנקודת ההתחלה. הזז שני מילימטרים אחוריים מן bregma, ו 2.4 מילימטרים לרוחב לתבל המהודל.
לאחר מכן, לקדוח חור בקוטר 0.5 מ"מ עבור הקטטר במצב זה. לקדוח עוד שלושה חורים בקוטר 1.3 מ"מ עבור ברגי העוגן כמה מילימטרים מהחור הראשון. הסר את אבק העצם על ידי השקיה עם סביב אחד עד שני מיליליטר של PBS סטרילי ולנקות את הגולגולת.
לאחר מכן, להדק את ברגי העוגן על ידי שניים עד שלושה סיבובים מלאים. הכנס קטטר באורך שני מילימטר דרך החור הראשון בניצב אל פני הגולגולת. בעוד עדיין מחזיק את הקטטר, להחיל קצת מלט דנטלי ולתת לו פילמור עם חשיפה קצרה לאור ריפוי השיניים על מנת לייצב את הצנתר.
לאחר מכן להחיל יותר מלט דנטלי סביב הקטטר, לעגן את הברגים, ולבסס את המלט הדנטלי עם אור ריפוי השיניים במשך כ 15 עד 30 שניות, לאשר כי המלט מוקשח. לאחר ההשתלה, סגור את העור עם תפרים הניתנים למיחזור הקדמיים, ואחוריים אל הצנתר. ואז להזריק את תערובת הנוגדן תת עורית.
לאחר מכן, לנהל 2.5% enrofloxacin על ידי הזרקה תת עורית לטיפול אנטיביוטי מניעתי. להחזיר את החיה לכלוב שונה ולשמור אותו תחת השגחה במשך שעה עד שלוש שעות עם יישום של אור אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה. חזור על הטיפול enrofloxacin ולנהל carprofen במיליגרם אחד למיליליטר תת עורית להקלה על הכאב על ידי הזרקה יום לאחר הניתוח.
כדי להכין את תערובת החיסונים, חבר שני מזרקי זכוכית עם קצה מנעול נמוך ב-10 מיליליטר לזרועות הקצרות של עצירה משולשת, וסגור את השקע השלישי בזרוע הארוכה. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של IFA ו 50 מיקרוגרם של rMOG יחד. ולהתאים את התערובת לנפח סופי של שני מיליליטר עם PBS סטרילי.
מניחים את תערובת IFA ו rMOG מדוללת במזרק הפתוח, ולאחר מכן להכניס את הבוכנה בעדינות תוך שמירה על לחץ רופף על הבוכנה הנגדית. תחליב את inoculum על ידי נהיגה אותו ממזרק אחד לשני באמצעות דוחף את הבוכנות הלוך ושוב עד שהוא לבן וצמיג. לאחר מכן, תקן מזרק מנעול תחתון של מיליליטר אחד לזרוע הקצרה הפתוחה של העצירה המשולשת ומלא אותו באינוקום.
מפיצים את כל האינוקולום למזרקי מיליליטר אחד ושומרים אותם על קרח עד ההזרקה. לאחר מכן, להזריק 200 microliters של תערובת IFA ו rMOG תת עורית בבסיס הזנב תחת הרדמה איזופלורן זמני באמצעות מחט 21 מד. להזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים, התאם את אורך הצינורית המחברת לשני מילימטרים.
ממלאים מזרק מיליליטר אחד בתערובת הציטוקינים. לאחר מכן, חבר את המזרק לחיבור הצינורית המחברת. לאחר מכן, למלא את הצינורית עם תערובת ציטוקינים, להימנע מיצירת כל בועות.
לאחר מכן, הר את המזרק על משאבת המזרק הניתן לתכנות ולתכנת אותו להזריק בקצב של 0.2 מיקרוליטרים לדקה. התחל את המשאבה ולשמור אותו עובד על מנת למנוע היווצרות בועת אוויר בקצה הצינורית. לאחר מכן, להסיר את כובע הקטטר עם מפרצון.
הכנס את הצינורית המחבר לתוך הצנתר, בורג ומהדק אותו. לאחר מכן לאפשר את הזריקה להמשיך במשך 10 דקות לפני עצירת המשאבה. השאירו את הצינורית בתוך הקטטר במשך 20 דקות כדי לאפשר את הנפח המוזרק לפזר באופן מלא.
לאחר מכן, לפתוח את הצינורית המחבר ולהסיר אותו לאט כדי למנוע אפקט ואקום. לחבר מחדש את מכסה הקטטר עם המפרצון ולברג אותו. אפשר לחיה להתאושש מההרדמה בכלוב.
demyelination קליפת המוח ניתן להעריך בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת ציטוקינים על ידי היסטוכימיה אימונו עבור PLP. איור 6A מראה חיסון PLP שלם ביום ה-15 בחית בקרה מחוסנת מוגית שקיבלה רק PBS סטרילי דרך הצנתר המושתל. ביום הראשון לאחר הזרקת הציטוקינים, demyelination כבר יכול להיות מזוהה בבעלי חיים ראשוניים MOG.
אם כי, רק בקרבת האזור הצנתור. החיסון PLP נשאר שלם בקליפת המוח הנגדית יום אחד לאחר הזרקת ציטוקינים. ביום השלישי, ניתן היה לראות עלייה הדרגתית באובדן תגובתיות האימונו PLP, המתפשטת בקליפת המוח האיסיליטרלית.
Demyelination קליפת המוח Contralateral יכול להיות מזוהה גם ביום השלישי, אבל זה מוגבל למדי לאזור מתחת ברגי העוגן. בין ימים 9 עד 15, demyelination משפיע על חלקים גדולים של קליפת המוח של שתי ההמיספרות. demyelination קליפת המוח הוא מתמשכת עד 30 ימים לאחר הזרקת ציטוקינים בשתי ההמיספרות עם remyelination חלקי בלבד.
איור 6J מראה כימות של אובדן PLP בחומר האפור הקליפתי לאחר הזרקת ציטוקינים תוך-מוחיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור demyelination של חומר אפור באמצעות חיסון תת-אקליני נגד חלבוני מיאלין, ואחריו הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים דרך הצנתר המושתל. מודל חייתי זה יכול לעזור לחוקרים בחקר סוגים מתקדמים של טרשת נפוצה, ירידה בחומר אפור שכבה היא סימן שלם.
הצנתר המושתל מאפשר סבבים מרובים של demyelination או משלוח בין-גזעי של תרופות טיפוליות פוטנציאליות העוברות חקירה פרה קלינית מבלי לגרום לטראומה הנגרמת על ידי הזרקה.
