L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare una demielinizzazione diffusa della corteccia di entrambi gli emisferi cerebrali in un modello di ratto utilizzando l'immunizzazione sub-clinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici, seguita dall'iniezione cerebrale di interesse di citochine attraverso un catetere impiantato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle malattie demielinanti infiammatorie del cervello, come la sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può generare demielinizzazione della materia grigia indotta dall'infiammazione nella corteccia di entrambi gli emisferi cerebrali senza portare a tappi di sostanza bianca.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore comprensione dei meccanismi della demielinizzazione corticale che si osserva principalmente nei tipi progressivi di sclerosi multipla. Per iniziare questa procedura, assemblare il catetere e il cappuccio del catetere con l'ingresso. Quindi, tagliare il catetere a una lunghezza di due millimetri con un bisturi.
Quindi radere la testa di un ratto anestetizzato tra le orecchie usando il rasoio elettrico. Posizionare il ratto nella cornice stereotassica e fissare la testa usando le barre auricolari e la piastra del morso. Assicurarsi che la testa sia orizzontale e verificarne la stabilità applicando una pressione su di essa con le dita o una pinica.
Successivamente, applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico, coprire gli occhi con un materiale opaco per prevenire qualsiasi esposizione chirurgica alla luce. Quindi, pulire l'area rasata alternando l'applicazione del complesso di iodio al 70% di etanolo e al 10% di povidone. Per impiantare il catetere, fare un'incisione longitudinale di circa due centimetri di lunghezza lungo la linea mediana.
Quindi utilizzare morsetti bulldog per tenere la pelle ai lati. Rimuovere il sangue utilizzando un applicatore a punta di cotone. Successivamente, rimuovere il periosteo, pulire il tessuto con l'applicatore della punta di cotone, esporre il cranio e lasciarlo asciugare per circa un minuto.
Quindi, identificare i punti di riferimento anatomici, lambda, bregma e sutura mediale. Con il trapano installato sul telaio stereotassico, posizionare la punta della punta del trapano sul bregma come punto di partenza. Spostare due millimetri posteriori dal bregma e 2,4 millimetri lateralmente alla sutura mediale.
Quindi, praticare un foro di 0,5 millimetri di diametro per il catetere in questa posizione. Praticare altri tre fori di 1,3 millimetri di diametro per le viti di ancoraggio a pochi millimetri di distanza dal primo foro. Rimuovere la polvere ossea mediante irrigazione con circa uno o due millilitri di PBS sterile e pulire il cranio.
Successivamente, stringere le viti di ancoraggio di due o tre giri completi. Inserire un catetere di due millimetri di lunghezza attraverso il primo foro perpendicolare alla superficie del cranio. Mentre si tiene ancora il catetere, applicare un po 'di cemento dentale e lasciarlo polimerizzare con una breve esposizione alla luce di polimerizzazione dentale per stabilizzare il catetere.
Quindi applicare più cemento dentale attorno al catetere, ancorare le viti e solidificare il cemento dentale con la luce di polimerizzazione dentale per circa 15-30 secondi, confermare che il cemento è indurito. Dopo l'impianto, chiudere la pelle con suture riassorbibili anteriori e posteriori al catetere. Quindi iniettare la miscela di antidoto per via sottocutanea.
Successivamente, somministrare il 2,5% di enrofloxacina mediante iniezione sottocutanea per il trattamento antibiotico profilattico. Riportare l'animale nella gabbia modificata e tenerlo sotto osservazione per una o tre ore con un'applicazione di luce infrarossa per evitare l'ipotermia. Ripetere il trattamento con enrofloxacina e somministrare carprofene a un milligrammo per millilitro per via sottocutanea per alleviare il dolore mediante iniezione il giorno dopo l'intervento chirurgico.
Per preparare la miscela di immunizzazione, collegare due siringhe di vetro a punta di blocco inferiore da 10 millilitro ai bracci corti di un rubinetto a tre vie e chiudere la terza uscita con il braccio lungo. Successivamente, pipettare un millilitro di IFA e 50 microgrammi di rMOG insieme. E regolare la miscela su un volume finale di due millilitri con PBS sterile.
Posizionare la miscela diluita di IFA e rMOG nella siringa aperta, quindi inserire delicatamente il pistone mantenendo una pressione allentata sul pistone opposto. Emulsionare l'inoculo guidandolo da una siringa all'altra spingendo i pistoni avanti e indietro fino a quando non è bianco e viscoso. Quindi, fissare una siringa di blocco inferiore da un millilitro al braccio corto aperto del rubinetto a tre vie e riempirlo di inoculo.
Distribuire tutto l'inoculo su siringhe da un millilitro e tenerle sul ghiaccio fino all'iniezione. Successivamente, iniettare 200 microlitri della miscela IFA e rMOG per via sottocutanea alla base della coda in un'anestesia isoflurano temporanea utilizzando un ago calibro 21. Per l'iniezione intracerebrale di citochine, regolare la lunghezza della cannula del connettore a due millimetri.
Riempire una siringa da un millilitro con la miscela di citochine. Quindi, collegare la siringa alla cannula del connettore. Quindi, riempire la cannula con la miscela di citochine, evitare di creare bolle.
Quindi, montare la siringa sulla pompa a siringa programmabile e programmarla per iniettare a una velocità di 0,2 microlitri al minuto. Avviare la pompa e mantenerla in servizio per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta della cannula. Successivamente, rimuovere il cappuccio del catetere con l'ingresso.
Inserire la cannula del connettore nel catetere, avvitare e stringere. Quindi lasciare procedere l'iniezione per 10 minuti prima di interrompere la pompa. Lasciare la cannula all'interno del catetere per 20 minuti per consentire al volume iniettato di diffondersi completamente.
Successivamente, svitare la cannula del connettore e rimuoverla lentamente per evitare un effetto vuoto. Ricollegare il cappuccio del catetere con l'ingresso e avvitarlo. Lascia che l'animale si riprenda dall'anestesia in una gabbia.
La demielinizzazione corticale potrebbe essere valutata in diversi momenti dopo un'iniezione di citochine mediante immunoistochimica per PLP. La Figura 6A mostra l'immunoreattività PLP intatta al giorno 15 in un animale di controllo immunizzato moggy che ha ricevuto solo PBS sterile attraverso il catetere impiantato. Il primo giorno dopo l'iniezione di citochine, la demielinizzazione potrebbe già essere rilevata negli animali MOG prime.
Anche se, solo nelle immediate vicinanze dell'area cateterizzata. L'immunoreattività PLP rimane intatta nella corteccia controlaterale un giorno dopo l'iniezione di citochine. Il terzo giorno, si è potuto osservare un graduale aumento della perdita dell'immuno reattività PLP, che si diffonde nella corteccia ipsilaterale.
La demielinizzazione corticale controlaterale potrebbe anche essere rilevata al terzo giorno, ma è piuttosto limitata all'area sotto le viti di ancoraggio. Tra i giorni nove e 15, la demielinizzazione colpisce gran parte della corteccia di entrambi gli emisferi. La demielinizzazione corticale è sostenuta fino a 30 giorni dopo l'iniezione di citochine in entrambi gli emisferi con solo una rimielinizzazione parziale.
La Figura 6J mostra una quantificazione della perdita di PLP nella materia grigia corticale dopo l'iniezione intracerebrale di citochine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare demielinizzazione della materia grigia usando l'immunizzazione subclinica contro le proteine mieliniche, seguita dall'iniezione intracerebrale di citochine attraverso il catetere impiantato. Questo modello animale potrebbe aiutare i ricercatori nello studio dei tipi progressivi di sclerosi multipla, la demielinizzazione della materia grigia dello strato è un segno completo.
Il catetere impiantato consente cicli multipli di demielinizzazione o somministrazione intercerebrale di potenziali farmaci terapeutici sottoposti a indagine preclinica senza causare traumi indotti dall'iniezione.
