Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la preparación del Gallium 68 etiquetado RGD-Peptide y el método para la evaluación biológica de sus análogos. La principal ventaja de esta técnica es que es un protocolo sistémico simple para el desarrollo de un nuevo péptido radiometal.etiquetado. Demostrando el procedimiento estará Ki-Hye Jung, un post-doc de nuestro instituto.
Comience por usar 0,5 ácido clorhídrico molar para eluir eletitar tricloruro de galio radiomarcado de un generador de germanio de galio radiomarcado. Purgar el compuesto en un vial de reacción de cinco mililitros con gas nitrógeno a 80 grados centígrados. Seguido por la adición de 100 microgramos de acetato de glicina de arginina o péptido RGD en un acetato de sodio molar al compuesto seco.
Caliente la mezcla de reacción a 80 grados Celsius durante cinco minutos antes de permitir que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente. Para purificar el producto crudo con cromatografía líquida de alto rendimiento, añada la solución a una columna C18 y pase la solución a través de un cartucho de fase inversa C18. Lavar el cartucho con dos mililitros de solución salina y eluir el péptido radiomarcado con 0,7 mililitros de 95% de etanol seguido de la eliminación del disolvente a 80 grados Celsius bajo gas nitrógeno durante 20 minutos.
Reconstituir el péptido purificado en PBS y filtrar el producto radiomarcado a través de un colador estéril estéril de 0,22 micras. Formular el péptido en un mililitro de solución salina estéril y detectar un microlitro de solución de péptido en una placa de cromatografía de capa fina instantánea. A continuación, desarrolle la placa en la cámara que contiene ácido cítrico 0,1 acuoso hasta nueve centímetros de distancia del punto para determinar el rendimiento químico radioeléctrico.
Para evaluar la absorción celular in vivo del péptido, tratar una vez 10 a las sextas células humanas de glioblastoma por pozo en seis placas de pozo con 111 kilobecquerel de péptido RGD radiomarcado por pozo a 37 grados Celsius durante 30, 60, 90 o 120 minutos de triplicado. Al final de la incubación, lave los pozos dos veces con dos mililitros de PBS por lavado, y cosecha las células con 0.25%Trypsin y 0.02%EDTA en PBS a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. Luego, transfiera las células de cada pozo a tubos cónicos de 15 mililitros para medir la absorción de péptidos radiomarcados en un contador gamma.
Para evaluar la estabilidad sérica del péptido RGD radiomarcado, añada 500 microlitros de suero de ratón recién preparado, 500 microlitros de suero humano y 500 microlitros de PBS a 50 microlitros de cada muestra e incubar las mezclas a 37 grados Centígrados durante un máximo de dos horas. A continuación, detecte de una a dos microlitros de cada muestra en una placa de cromatografía instantánea de capa fina después de 30, 60, 90 y 120 minutos de incubación y desarrolle las placas como se ha demostrado. Para determinar la lipofilia del péptido, agregue 10 microlitros del péptido RGD radiomarcado a un sistema PBS octanal y mezcle los viales generosamente durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, recoger el péptido por centrifugación y cosechar 100 microlitros de muestra de cada capa para medir con un contador gamma. Para generar modelos de tumores radiomarcados, cargue cinco veces 10 a las sextas células humanas de glioblastoma en 100 microlitros de PBS en una jeringa de insulina de media pulgada equipada con una aguja de calibre 28 por ratón desnudo BALB/c que se inyectará, y entregue las células tumorales por vía subcutánea en el flanco izquierdo de cada receptor. Para la cuantificación in vivo del péptido por tomografía por emisión de positrones, o PET, coloque la cabeza con un ratón tumoral anestesiado en el pórtico PET y administre por vía intravenosa 7,4 megabecquerels de solución de péptido RGD radiomarcado en 200 microlitros de PBS en cada modelo de ratón de xenoinjerto a través de la vena de cola durante un minuto mientras realiza una tomografía PET en el modo de lista.
Para el análisis de biodistribución ex vivo, inyectar 0,37 megabecquerels de péptido RGD radiomarcado en 200 microlitros de PBS en la vena de cola de un animal xenoinjertado, tumoral, y cosechar los tejidos de interés a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. Luego pesa los tejidos y mide su radiactividad con un contador gamma. Después de la quelación, las impurezas de reacción se pueden eliminar con éxito mediante cromatografía líquida de alto rendimiento como se ha demostrado.
Una pureza radioquímica superior al 99% del péptido RGD radiomarcado se puede lograr con una actividad específica al final de la síntesis entre 90 y 130 megabecquerels por nanómetro. El análisis de PET demuestra una alta absorción inicial en los órganos principales, incluyendo el hígado, riñón, corazón, músculo, así como dentro del tumor. Durante las últimas etapas del análisis, la región tumoral se puede visualizar claramente con la relación tumoral a músculo que permanece inalterada, lo que indica la estabilidad cinética del péptido.
El análisis de biodistribución ex vivo revela que la radiactividad acumulada en el tumor disminuye con el tiempo como se espera de los hallazgos de PET in vivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, aunque nuestra metodología no puede reemplazar el delicado proceso de evaluación biológica, se puede utilizar para utilizar considerablemente el tiempo y el costo de una práctica tradicional de desarrollo de drogas. No olvide que trabajar con los materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como el uso del equipo de protección adecuado como un dosímetro personal y un dosímetro termoluminiscente siempre debe tomarse mientras se realizan estos procedimientos.
